op2000超微量分光光度計（美國，Thermo Fisher Scientific)檢測 所得DNA的濃度，以供Ο?ΤΜ5基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的檢測。
[0013] 3、DNA甲基化水平測定 本實(shí)驗采用焦磷酸測序技術(shù)對OiTM堪因啟動子區(qū)的7個CpG位點(diǎn)（如圖1)進(jìn)行了 DNA甲基化水平分析。此技術(shù)的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈 反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變 成了尿嘧啶（U)，然后通過測序引物進(jìn)行PCR測序，從而得到哪個位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。本次 研宄采用PyroMark Assay Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計，用于實(shí)驗的PCR擴(kuò)增引物和測序引 物如下： 甲基化特異性上游引物的核苷酸序列如下： 5? -Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3?； 甲基化特異性下游引物的核苷酸序列如下： 5' -CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3' ； 甲基化特異性測序引物的核苷酸序列如下： 5' -CTTCTTCTTCACCCTAATT-3'。
[0014] DNA甲基化水平測定的具體步驟： 第一步：采用 EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold(EZ DNA Methylation-Gold? Kit; ZYMO RESEARCH)對樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化； 第二步：取第一步中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶（Zymo Taq? PreMiX，ZYMO RESEARCH)，并加入上述趨化素樣因子超家族成員3基因啟動子區(qū)甲基化特異 性擴(kuò)增上游引物和下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：首先95°C IOmin的變性；接著95°C 3〇8，1'1114〇8,72°0 11^11，共45個循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°0 71^11(注：1'111在實(shí) 驗中根據(jù)跑PCR梯度溫度確定）； 第三步：焦磷酸測序的前期準(zhǔn)備：在PSQ24板中預(yù)先加入40 μ 1含有0. 3 μ M上述甲基 化特異性測序引物的退火緩沖液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);將需要使用的 混勻的瓊脂糖珠總量（每樣本3 μ 1)轉(zhuǎn)移到一個微量離心管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩 沖液（PyroMark Binding Buffer ;Qiagen)，使得平均每個樣品約有50 μ 1的體積，將混合 物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物（50 μ 1反應(yīng)體積）中，每樣本50 μ 1 ;將PCR產(chǎn)物在 常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個樣品板中依次加 入50ml的高純水、70%乙醇、洗絳緩沖液（PyroMark Wash Buffer ; Qiagen)和50ml的變 性緩沖液（PyroMark Denaturation Solution ;Qiagen);打開真空預(yù)備工作站的泵，將真 空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具（PyroMark Vacuum Pr印Filter Probes ; Qiagen)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠（在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此 操作）；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具 放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關(guān) 掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠（測序引物也可最后 加入）；使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 3 分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)； 第四步：焦磷酸測序：在PyroMark Q24焦磷酸測序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑 盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)對第三步中的PSQ24板中的樣本進(jìn)行測序，然 后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對結(jié)果進(jìn)行甲基化分析（甲基化水平檢測結(jié)果示例見圖2)。圖 2中所示百分?jǐn)?shù)為對應(yīng)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，如圖2所示CpGl到CpG7的甲基化程度分別 為 49%，46%，51%，46%，42%，49%，42%。
[0015] 4、數(shù)據(jù)分析 本次實(shí)驗采用SPSS 16. 0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，我們發(fā)現(xiàn)：被檢測的7個CpG位點(diǎn)間存 在顯著關(guān)聯(lián)（相關(guān)系數(shù)r > 0.82, p〈 0.0001，有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1)(注：p〈 0.05時表 示有統(tǒng)計學(xué)意義，下同），所以我們把CpGl-CpG7求平均值后參與到后續(xù)的分析中，發(fā)現(xiàn)病 例組和對照組之間的DNA甲基化水平存在顯著差異（p = 0.0000517,見表1)。
[0016] 表1病例組與對照組間的比較（n=42)
【主權(quán)項】
1. 一種可用于檢測與大腸癌相關(guān)的OfTM堪因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒，其特征 在于包括OfTM堪因啟動子區(qū)的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物、下游引物及其甲基化特異性 測序引物，其中所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示： 5'-Biotin-AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3' ； 所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示： 5' -CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3' ； 所述的甲基化特異性測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示： 5' -CTTCTTCTTCACCCTAATT-3'。
2. -種可用于檢測與大腸癌相關(guān)的OfTM堪因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用， 其特征在于：該試劑盒可用于大腸癌輔助檢測、診斷或藥物治療中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了可用于檢測與大腸癌相關(guān)的CMTM3基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點(diǎn)是該試劑盒包括一對CMTM3基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個甲基化特異性測序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測序引物如SEQ ID NO.3所示，優(yōu)點(diǎn)是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對大腸癌的檢測，檢測效率高，針對性強(qiáng)，同時，以CMTM3基因啟動子區(qū)甲基化為靶點(diǎn)的藥物有望成為大腸癌輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104726589
【申請?zhí)枴緾N201510127873
【發(fā)明人】段世偉, 葉孟, 李錦蕓, 陳成
【申請人】寧波大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月24日