一種用于綿羊肉用性能分子選種的pcr-sscp試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于綿羊肉用性能分子選種的PCR-SSCP試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 綿羊肉用性能(產(chǎn)肉量）是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，檢測(cè)并選留具有優(yōu)良肉用性能的綿羊 可以顯著提高養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用分子遺傳學(xué)方法能夠準(zhǔn)確 檢測(cè)并選留具有優(yōu)良肉用性能的綿羊。基于動(dòng)物DNA序列影響表型性狀的基本生物學(xué)原 理，應(yīng)用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)方法，尋找鑒定影響綿羊肉用性能的高效特異等位基因是評(píng)價(jià)綿 羊肉用性能的有效手段之一。綿羊肉用性能(產(chǎn)肉量)是數(shù)量性狀，受微效多基因調(diào)控，也有 效應(yīng)較大的主基因 （Major gene)。目前，檢測(cè)影響綿羊肉用性能的基因大多數(shù)為微效基因， 而微效基因數(shù)量大且并非隨機(jī)分布，通過(guò)檢測(cè)微效基因評(píng)估綿羊肉用性能的準(zhǔn)確性不高， 多個(gè)微效基因的檢測(cè)結(jié)果可能互相沖突且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而通過(guò)尋找和分析效應(yīng)較大的主基因 DNA序列，檢測(cè)影響綿羊產(chǎn)肉性能的主基因特異等位基因，可以有效提高綿羊肉用性能評(píng)估 的準(zhǔn)確性，縮短綿羊肉用性能改良進(jìn)程，進(jìn)而提高綿羊個(gè)體經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種用于綿羊肉用性能分子選種的PCR-SSCP試劑盒，采用綿羊肉 用性能分子標(biāo)記選種技術(shù)，主要針對(duì)特異主效基因 FABP4,利用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)特異等 位基因，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估攜帶不同等位基因個(gè)體的肉用性能等級(jí)，從而判斷是否留 做種用。
[0004] 綿羊FABP4基因定位于9號(hào)染色體，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證， 其是影響綿羊肉質(zhì)性狀的主要候選基因之一。綿羊FABP4基因具有豐富的變異，而剖析各 個(gè)等位基因?qū)θ庥眯阅艿挠绊懗潭扔欣陂_(kāi)發(fā)DNA標(biāo)記物。
[0005] 本發(fā)明提供一種用于綿羊肉用性能分子選種的PCR-SSCP試劑盒，所述試劑盒包 括綿羊FABP4*A和FABP4*B的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本，所述FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參 見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 1，所述FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 2 〇
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能的PCR-SSCP試劑盒， 所述試劑盒包括綿羊FABP4等位基因，所述FABP4等位基因包括FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本、 FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本、FABP4*C標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本、FABP4*D標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本和FABP4*E標(biāo)準(zhǔn)DNA 樣本，所述FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 1，所述FABP4*B 標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 2,所述FABP4*C標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷 酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 3,所述FABP4*D標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中 SEQ ID No. 4,所述FABP4*E標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 5。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于綿羊肉用性能分子選種的PCR-SSCP試劑盒的使 用方法，步驟如下： (I)收集并處理待測(cè)樣本DNA ; (2 )待測(cè)樣本DNA的PCR擴(kuò)增： 所用引物為：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn: ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ； 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性94°C 30秒，退火溫度60°C 30秒，延伸溫度 72°C 45秒，最后延伸溫度72°C 10分鐘； (3) SSCP電泳：將綿羊FABP4*A和FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本與待測(cè)樣本DNA同時(shí)進(jìn)行 SSCP電泳，待測(cè)樣本帶型與FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的為高產(chǎn)肉性能綿羊品種，與 FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的為產(chǎn)肉性能良好的綿羊品種。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供用于檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能的PCR-SSCP試劑盒的 使用方法，步驟如下： (1)收集并處理待測(cè)樣本DNA ; (2 )待測(cè)樣本DNA的PCR擴(kuò)增： 所用引物為：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn: ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ； 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性94°C 30秒，退火溫度60°C 30秒，延伸溫度 72°C 45秒，最后延伸溫度72°C 10分鐘； (3)SSCP電泳：將綿羊FABP4*A和FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本與待測(cè)樣本DNA同時(shí)進(jìn)行SSCP 電泳，待測(cè)樣本帶型與FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為優(yōu)質(zhì)；與FABP4*B標(biāo)準(zhǔn) DNA樣本和FABP4*C標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為良好；與FABP4*D標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本 帶型一致的產(chǎn)肉性能為合格；與FABP4*E標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為劣。
[0009] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種綿羊肉用性能的檢測(cè)和鑒別方法，步驟如下： (1) 收集并處理待測(cè)樣本DNA ; (2) 待測(cè)樣本DNA的PCR擴(kuò)增：所用引物為：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ;下游 引物Dn !ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ;作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘， 變性94°C 30秒，退火溫度60°C 30秒，延伸溫度72°C 45秒，最后延伸溫度72°C 10分鐘； (3) SSCP電泳：將綿羊FABP4*A和FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本與待測(cè)樣本DNA同時(shí)進(jìn)行SSCP 電泳，待測(cè)樣本帶型與FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為優(yōu)質(zhì)；與FABP4*B標(biāo)準(zhǔn) DNA樣本和FABP4*C標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為良好；與FABP4*D標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本 帶型一致的產(chǎn)肉性能為合格；與FABP4*E標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的產(chǎn)肉性能為劣。
[0010] 本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種綿羊肉用性能分子選種的方法，步驟如下： (1) 收集并處理待測(cè)樣本DNA ; (2) 待測(cè)樣本DNA的PCR擴(kuò)增：所用引物為：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ;下游 引物Dn !ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ;作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘， 變性94°C 30秒，退火溫度60°C 30秒，延伸溫度72°C 45秒，最后延伸溫度72°C 10分鐘； (3) SSCP電泳：將綿羊FABP4*A和FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本與待測(cè)樣本DNA同時(shí)進(jìn)行 SSCP電泳，待測(cè)樣本帶型與FABP4*A標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的為高產(chǎn)肉性能綿羊品種，與 FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本帶型一致的為產(chǎn)肉性能良好的綿羊品種。
[0011] 本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供用于綿羊肉用性能分子選種的試劑盒在綿羊肉用性 能分子選種中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能的試劑盒在檢測(cè)和鑒別綿 羊肉用性能中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的第九個(gè)目的是提供綿羊FABP4*A和FABP4*B標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本核苷酸序列在 綿羊肉用性能分子選種及在制備綿羊肉用性能分子選種試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的第十個(gè)目的是提供綿羊FABP4等位基因在檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能及 在制備檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能試劑盒中的應(yīng)用，其中，所述綿羊FABP4等位基因的核苷 酸序列為序列表中SEQ ID No. 1-5。
[0015] 本申請(qǐng)人對(duì)綿羊特異主效基因 FABP4進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)5種等位基因（A、B、C、D和 E)，分析了 5種等位基因?qū)d羊產(chǎn)肉性能指標(biāo)的影響，確定綿羊高產(chǎn)肉性能特異等位基因： 將等位基因 A和B作為綿羊肉用性能基因標(biāo)記，建立了綿羊肉用性能特異主效基因等位基 因的標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，提供了一種新的綿羊肉用性能分子選種的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為綿羊肉用性能特異主效基因等位基因 SSCP帶型圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0018] 實(shí)施例1 應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)和鑒別綿羊肉用性能特異主效基因等位基因的方法如下： (一）收集具有產(chǎn)肉性能指標(biāo)(腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、總?cè)庵鼗蛲炔咳獗壤⒀?部肉比例和肩部肉比例）的綿羊DNA血樣。
[0019] (二）PCR擴(kuò)增所收集的DNA血樣。
[0020] PCR擴(kuò)增時(shí)所使用引物為： 上游引物18bp核苷酸，下游引物20bp核苷酸，擴(kuò)增片段大小約為350bp，具體引物序列 如下： 上游引物 Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ; 下游引物 Dn :ACTTAGATGAAGGTGCTCTG。
[0021] PCR反應(yīng)體系為： 10XPCR 緩沖液（2. 5mM) 2 μ I Mg2+ (3. 0 μ M) I. 2 μ I 5XQ 溶液（1.5mM) 2 μ I dNTP (150 μ Μ) 1. 2 μ 1 上下游混合引物（0. 25 μ Μ) 1 μ 1 Taq 聚合酶 0· 5U 0. 1 μ 1 模板DNA用量 1個(gè)濾紙小圓盤(pán)（I. 2mm) 去尚子水 12. 5 μ 1。
[0022] 上述特異等位基因擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性94°C 30秒，