馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，屬于農(nóng)業(yè)微生物領域。本發(fā)明依次通過TSA復蘇凍干種子、在TSA瓊脂斜面一級中培養(yǎng)、在TSB培養(yǎng)基進行二級種子培養(yǎng)、在無血清和葡萄糖的加富胰酪蛋白培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。本發(fā)明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發(fā)酵培養(yǎng)的方法，進行工業(yè)放大生產(chǎn)研究，發(fā)酵抗原含量無降低，發(fā)酵過程中不用調(diào)整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝參數(shù)容易控制，減少補料；較現(xiàn)有發(fā)酵工藝穩(wěn)定、生長速度快，易于實現(xiàn)馬鏈球菌抗原的大規(guī)模高密度培養(yǎng)。同時提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保護效果。
【專利說明】
馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及農(nóng)業(yè)微生物技術領域，特別設及一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高 密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝。
【背景技術】
[0002] 馬鏈球菌獸疫亞種根據(jù)蘭氏分群屬于C群鏈球菌，該菌可引起多種動物感染，臨床 癥狀表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎等，一般呈地方流行性。隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，中國 豬鏈球菌病時有發(fā)生。流行病學調(diào)查表明，除豬鏈球菌2型外，馬鏈球菌獸疫亞種仍是中國 各地豬鏈球菌病的主要病原。目前控制該病的主要手段仍是疫苗，主要有弱毒疫苗、滅活 苗。
[0003] 馬鏈球菌弱毒菌株ST171是生產(chǎn)鏈球菌弱毒活疫苗的專用菌株，對其培養(yǎng)及研究 局限于大瓶培養(yǎng)和普通發(fā)酵活菌低的特點。馬鏈球菌獸疫亞種為兼性厭氧型微生物，生長 過程中需要血清和葡萄糖作為營養(yǎng)物質(zhì)，但是運些異源物質(zhì)的殘存會使疫苗存在安全隱 患。普通發(fā)酵工藝要隨著發(fā)酵的進行不斷調(diào)整通氣量，控制溶氧，同時需要添加2~5%的血清 和1 %的葡萄糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密 度發(fā)酵培養(yǎng)工藝。本發(fā)明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發(fā)酵培養(yǎng)的方法，進行工業(yè)放 大生產(chǎn)研究，發(fā)酵抗原含量無降低，發(fā)酵過程中不用調(diào)整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝 參數(shù)容易控制，減少補料;較現(xiàn)有發(fā)酵工藝穩(wěn)定、生長速度快，易于實現(xiàn)馬鏈球菌抗原的大 規(guī)模高密度培養(yǎng)。
[0005] 本發(fā)明的技術方案為： 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括步驟： 1) 取凍干的發(fā)酵種子菌用活化培養(yǎng)基活化，至單菌落長出； 2) 挑取單菌落至一級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)12-16小時，得一級種子； 3) 取一級種子并接種于二級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至ODsgg值達到0.4-0.6，得二級種子； 4) W 1%-3%接種量將二級種子液轉接至發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵種子培養(yǎng);調(diào) 節(jié)pH至7.2 ±0.2,關閉進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為50- 150rpm;當ODs日日值達到一定數(shù)值時停止發(fā)酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度 抗原;所述發(fā)酵培養(yǎng)基為加富膜酪蛋白培養(yǎng)基。
[0006] 作為優(yōu)選方案，還包括步驟5)，將發(fā)酵種子培養(yǎng)收獲的菌液Wl%-3%的接種量接種 至體積更大的發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基也為加富膜酪蛋白培養(yǎng)基，擴大 培養(yǎng)的工藝條件為：pH 7.2 ± 0.2，罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為50-150巧m;當ODsoo 值達到1.5-1.卵寸停止發(fā)酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。
[0007] 作為優(yōu)選方案，步驟1)中，所述活化培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養(yǎng)基。
[000引作為優(yōu)選方案，步驟2)中，所述一級種子培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養(yǎng) 基。
[0009] 進一步地，步驟3)中，所述二級種子培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSB培養(yǎng)基。
[0010] 進一步地，步驟3)中，W1-3 ml TSB液體洗涂一級種子培養(yǎng)基的瓊脂斜面，將一級 種子接種于二級種子培養(yǎng)基，然后于36-38°C ,50-15化pm條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-4h。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述發(fā)酵種子菌為馬鏈球菌獸疫亞種ST171株。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述擴大培養(yǎng)所用發(fā)酵罐的體積為200-40化，所述發(fā)酵種子培養(yǎng) 所用發(fā)酵罐的提交為8-20L。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發(fā)酵培養(yǎng)的方法，進行工業(yè)放大生產(chǎn)研究， 發(fā)酵抗原含量無降低，發(fā)酵過程中不用調(diào)整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝參數(shù)容易控 審IJ，減少補料;較現(xiàn)有發(fā)酵工藝穩(wěn)定、生長速度快，易于實現(xiàn)馬鏈球菌抗原的大規(guī)模高密度 培養(yǎng)。同時提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保護效果。
[0014]
【附圖說明】
[0015] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 W根據(jù)運些附圖獲得其他的附圖。
[0016] 圖1為普通發(fā)酵工藝與本發(fā)明發(fā)酵工藝發(fā)酵生長曲線對比圖；曲線A代表本發(fā)明發(fā) 酵工藝；曲線B代表普通發(fā)酵工藝。
【具體實施方式】
[0017] W下各實施例中所用TSA培養(yǎng)基W及TSB培養(yǎng)基購自美國抓公司；加富膜酪蛋白培 養(yǎng)基購自山東陽谷蛋白僑潤辦事處潤蠢蛋白廠。
[001引實施例1 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發(fā)酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養(yǎng)基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養(yǎng)12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養(yǎng)基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-地，培養(yǎng)至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(加富膜酪蛋白 培養(yǎng)基)進行發(fā)酵種子培養(yǎng);采用IOM的氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養(yǎng)4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數(shù)，5小時活菌數(shù)達到63億cfu/mL ODs日日值達到1.7時停止發(fā)酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。
[0019] 實施例2 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發(fā)酵種子菌，在添加有7%成牛血清的TSA培養(yǎng)基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有7%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養(yǎng)12-16小時，得一級種子； 3) W3 ml TSB液體洗涂添加有7%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 7%成牛血清的TSB培養(yǎng)基，然后于38°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-地，培養(yǎng)至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W3%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至1化發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(加富膜酪蛋白 培養(yǎng)基)進行發(fā)酵種子培養(yǎng);采用IOM的氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養(yǎng)4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數(shù)，5小時活菌數(shù)達到62億cfu/mL ODs日日值達到1.別寸停止發(fā)酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。
[0020] 實施例3 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發(fā)酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養(yǎng)基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養(yǎng)12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養(yǎng)基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-地，培養(yǎng)至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(加富膜酪蛋白 培養(yǎng)基)進行發(fā)酵種子培養(yǎng);采用IOM的氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm; 5) 當當步驟4)中發(fā)酵種子培養(yǎng)至ODsoo值達至IjO.4-0.6時，取步驟4)發(fā)酵罐中的菌液，W 2%(V/V)的接種量轉接至30化發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(加富膜酪蛋白培養(yǎng)基)進行擴大培 養(yǎng);采用1OM的氨氧化鋼調(diào)節(jié)pH至7.2 ± 0.2，12 rC滅菌30min，關閉進氣閥和出氣閥，保持罐 體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養(yǎng)4小時后開始取樣測定ODs日日值和活菌計數(shù)，5 小時活菌達到70億Cf u/mL ODsoo值達到1.7時停止發(fā)酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種 發(fā)酵高密度抗原。
[0021] 對比例1 一種馬鏈球菌獸疫亞種普通發(fā)酵工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發(fā)酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養(yǎng)基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養(yǎng)12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養(yǎng)基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-地，培養(yǎng)至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(加富膜酪蛋白 培養(yǎng)基)進行發(fā)酵種子培養(yǎng)，添加5%成牛血清和1%的葡萄糖;采用IOM的氨氧化鋼調(diào)節(jié)pH至 7.2±0.2，121°(：滅菌30111111，控制溶氧在10~50%，攬拌速度為10化9111;培養(yǎng)4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數(shù)，6小時活菌數(shù)達到61億cfu/ni; ODs日日值達到1.7時停止發(fā)酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。
[0022] 實施例1(本發(fā)明發(fā)酵工藝)所得發(fā)酵抗原與對比例1(普通發(fā)酵工藝)所得發(fā)酵抗 原分別配制疫苗進行21-28日齡仔豬免疫，免疫后28天按照《中華人民共和國獸用生物制品 規(guī)程》(2000年版）的《豬敗血性鏈球菌病活疫苗制造及檢驗規(guī)程》進行效力檢驗，對照豬免 疫相同劑量的侶膠生理鹽水稀釋液，結果如表1所示。
[0023]
由表1可知，本發(fā)明發(fā)酵工藝所得抗原的免疫原性明顯改善，提高了疫苗的保護效果。
[0024] 實施例1(本發(fā)明發(fā)酵工藝)與對比例1(普通發(fā)酵工藝)發(fā)酵生長曲線對比圖如圖1 所示；由圖1可知，本發(fā)明發(fā)酵工藝較現(xiàn)有普通發(fā)酵工藝穩(wěn)定、生長速度快，易于實現(xiàn)馬鏈球 菌抗原的大規(guī)模高密度培養(yǎng)。
【主權項】
1. 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于，包括步驟：I) 取凍干的發(fā)酵種子菌用活化培養(yǎng)基活化，至單菌落長出；2)挑取單菌落至一級種子培養(yǎng)基， 培養(yǎng)12-16小時，得一級種子;3)取一級種子并接種于二級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD 6qq值達到 0.4-0.6，得二級種子;4)以1%-3%接種量將二級種子液轉接至發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進行 發(fā)酵種子培養(yǎng);調(diào)節(jié)pH至7.2 ± 0.2，關閉進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攪 拌速度為50-150rpm;當OD6qq值達到一定數(shù)值時停止發(fā)酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞 種發(fā)酵高密度抗原;所述發(fā)酵培養(yǎng)基為加富胰酪蛋白培養(yǎng)基。2. 如權利要求1所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于， 還包括步驟5)，將發(fā)酵種子培養(yǎng)收獲的菌液以1%-3%的接種量接種至體積更大的發(fā)酵罐中 進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基也為加富胰酪蛋白培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)的工藝條件為:PH 7.2 ± 0.2，罐體正壓0.03-0.05Mpa，攪拌速度為50-150rpm;當OD6qq值達到1.5-1.9時停止發(fā) 酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)酵高密度抗原。3. 如權利要求1或2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在 于:步驟1)中，所述活化培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養(yǎng)基。4. 如權利要求1或2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在 于:步驟2)中，所述一級種子培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養(yǎng)基。5. 如權利要求4所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于： 步驟3)中，所述二級種子培養(yǎng)基為添加有3-8%成牛血清的TSB培養(yǎng)基。6. 如權利要求5所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于： 步驟3)中，以1-3 mL TSB液體洗滌一級種子培養(yǎng)基的瓊脂斜面，將一級種子接種于二級種 子培養(yǎng)基，然后于36-38 °C，50-150rpm條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3-4h。7. 如權利要求1所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于： 所述發(fā)酵種子菌為馬鏈球菌獸疫亞種ST171株。8. 如權利要求2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于： 所述擴大培養(yǎng)所用發(fā)酵罐的體積為200-400L，所述發(fā)酵種子培養(yǎng)所用發(fā)酵罐的提交為8-20L〇
【文檔編號】C12R1/46GK105925517SQ201610575429
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】朱杰, 王楠, 牛成明, 董新榮
【申請人】山東濱州沃華生物工程有限公司