，65°C連續(xù)振蕩洗膜兩次， 每次15min〇
[0045] (8)將膜簡(jiǎn)單的用洗滌緩沖液漂洗lmin?5min(37°C下振蕩）；
[0046] (9)在100mL(每100cm膜）封閉溶液工作液中孵育30min(37°C下振蕩）；
[0047] (10)在20mL(每100cm膜）抗體溶液工作液中孵育30min?lh(37°C下振蕩）；
[0048] (11)在100mL(每100cm膜）洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min(37°C下振蕩）；
[0049] (12)在20mL(每100cm膜）檢測(cè)緩沖液中平衡2min?5min(37°C下振蕩）；
[0050] (13)將DNA點(diǎn)樣的膜面朝上，置于雜交袋（塑料袋壓模機(jī)封口制成，大小可根據(jù)膜 大小隨意調(diào)節(jié)）中，向膜上加入lmLCSPDready-to-use，立即蓋上封蓋使CSH)平均分布在 膜的表面，并防氣泡的產(chǎn)生。擦去溢出雜交袋多余液體，室溫（15°C?25°C)孵育5min;將 濕膜置于37°C孵育lOmin。
[0051] (14)在15°C?25°C條件下，采用圖像系統(tǒng)曝光5min?20min。
[0052] (15)結(jié)果判讀：有斑點(diǎn)反應(yīng)即表示無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性，無(wú)斑點(diǎn)反應(yīng)，即表示無(wú)乳鏈 球菌陰性。
[0053] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能利用病料組織DNA提取物或待檢菌株水煮后的上清液作斑點(diǎn) 分子雜交，均可在16h?24h內(nèi)完成檢測(cè)并報(bào)告結(jié)果，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 實(shí)施例1 :本發(fā)明試劑盒檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的敏感性
[0055] (1)樣品：羅非魚無(wú)乳鏈球菌。
[0056] (2)樣品處理：按分子克隆常規(guī)方法提取無(wú)乳鏈球菌DNA(原始濃度為：364. 5yg/ mL)或直接100°C水煮菌株，冰浴3min，離心取上清液，并將其做倍比稀釋。
[0057] (3)取2yL核酸樣點(diǎn)樣于適當(dāng)大小的尼龍膜上（尼龍膜劃好格子，長(zhǎng)和寬做好標(biāo) 記）。
[0058] (4)在2xSSC中簡(jiǎn)單洗膜，120°下烘烤尼龍膜30min。（可保存于4°C備用）
[0059] (5)將上述轉(zhuǎn)膜好的尼龍膜（點(diǎn)樣面朝上）放入適量體積的DIGEasyHyb緩沖液 (事先預(yù)熱至40°C)，溫和震蕩30min，進(jìn)行預(yù)雜交。
[0060] (6)取適量地高辛標(biāo)記的DNA探針，沸水浴中變性5min后，立即置于冰上冷切。將 變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的DIGEasyHyb緩沖液中，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。 (雜交液中探針終濃度約為25ng/mL較好）
[0061] (7)倒出（5)中預(yù)雜交液，在膜上加入（6)中的探針雜交液，40°C溫和震蕩孵育至 過(guò)夜。
[0062] (8)用足量的2XSSC，0. 1%XSDS，在室溫（15°C?25°C)連續(xù)振蕩洗膜兩次，每 次 5min〇
[0063] (9)用足量的0. 5XSSC，0. 1%XSDS(預(yù)熱到洗滌溫度），65°C連續(xù)振蕩洗膜兩次， 每次15min〇
[0064] (10)將膜簡(jiǎn)單的用洗滌緩沖液漂洗lmin?5min(37°C下振蕩）；
[0065] (11)在100mL(每100cm膜）封閉溶液工作液中孵育30min(37°C下振蕩）；
[0066] (12)在20mL(每100cm膜）抗體溶液工作液中孵育30min?lh(37°C下振蕩）；
[0067] (13)在100mL(每100cm膜）洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min(37°C下振蕩）；
[0068] (14)在20mL(每100cm膜）檢測(cè)緩沖液中平衡2min?5min(37°C下振蕩）；
[0069] (15)將DNA點(diǎn)樣的膜面朝上，置于雜交袋（塑料袋壓模機(jī)封口制成，大小可根據(jù)膜 大小隨意調(diào)節(jié)）中，向膜上加入lmLCSPDready-to-use，不要產(chǎn)生氣泡，立即封口使CSH) 平均分布在膜的表面。擦去溢出雜交袋的多余液體，室溫（15°C?25°C)孵育5min，37°C孵 育 10min〇
[0070](16)室溫（15°C?25°C )條件下，采用圖像系統(tǒng)曝光5min?20min或X光片曝光 15min?25min〇
[0071] (17)敏感性結(jié)果：
[0072] 采用本發(fā)明試劑盒能檢測(cè)羅非魚無(wú)乳鏈球菌的最低核酸量為1. 5pg/yL，表明本 檢測(cè)方法具有較好的敏感性。
[0073] 本發(fā)明利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通過(guò)PCR合成了經(jīng)地高辛標(biāo)記 的探針，通過(guò)斑點(diǎn)分子雜交，這些探針可用于檢測(cè)病料樣品中無(wú)乳鏈球菌特異性核酸的存 在或鑒定無(wú)乳鏈球菌病原。
[0074] 實(shí)施例2 :本發(fā)明試劑盒檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的特異性
[0075] (1)樣品：羅非魚無(wú)乳鏈球菌樣品5株和其他細(xì)菌樣品12株（包括海豚鏈球菌、 嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、淺綠氣球菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿 菌、乳酸桿菌、點(diǎn)狀氣單胞菌等）。
[0076] (2)取lmL菌液，離心后，溶于100yL無(wú)菌水，100°C水浴15min，立即冰浴3min，稍 離心，取上清備用。
[0077] (3)取2 y L核酸樣點(diǎn)樣于適當(dāng)大小的尼龍膜上（尼龍膜劃好格子，長(zhǎng)和寬做好標(biāo) 記）。
[0078] (4)在2 x SSC中簡(jiǎn)單洗膜，120°C下烘烤尼龍膜30min。（可保存于4°C)
[0079] (5)將上述轉(zhuǎn)膜好的尼龍膜（點(diǎn)樣面朝上）放入適量體積的DIGEasyHyb緩沖液 (事先預(yù)熱至40°C)，溫和震蕩30min，進(jìn)行預(yù)雜交。
[0080] (6)取適量地高辛標(biāo)記的DNA探針，沸水浴中變性5min，后立即置于冰上冷切。將 變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的DIGEasyHyb緩沖液中，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。 (雜交液中探針濃度約為25ng/mL)
[0081] (7)倒出（5)中預(yù)雜交液，在膜上加入（6)中的探針雜交液，40°C溫和震蕩孵育至 過(guò)夜。
[0082] (8)用足量的2XSSC，0. 1%XSDS，室溫（15?25°C)連續(xù)振蕩洗膜兩次，每次 5min〇
[0083] (9)用足量的0.5XSSC，0. 1%XSDS(預(yù)熱到洗滌溫度），65°C連續(xù)振蕩洗膜兩次， 每次15min〇
[0084] (10)在雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌步驟后，將膜簡(jiǎn)單的用洗滌緩沖液漂洗lmin?5min(37°C 下振蕩）；
[0085] (11)在100mL(每100cm膜）封閉溶液工作液中孵育30min(37°C下振蕩）；
[0086] (12)在20mL(每100cm膜）抗體溶液工作液中孵育30min?lh(37°C下振蕩）；
[0087] (13)在100mL(每100cm膜）洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min(37°C下振蕩）；
[0088] (14)在20mL(每100cm膜）檢測(cè)緩沖液中平衡2min?5min(37°C下振蕩）；
[0089] (15)將DNA點(diǎn)樣的膜面朝上，置于雜交袋中，向膜上加入lmLCSH) ready-to-use，防止產(chǎn)生氣泡，立即封口使CSH)平均分布在膜的表面。擦去溢出雜交袋多 余液體，15°C?25°C孵育5min。
[0090] (16)將濕膜置于37°C孵育10min。
[0091] (17)在15°C?25°C條件下，采用圖像系統(tǒng)曝光5min?20min。
[0092] (18)結(jié)果
[0093] 無(wú)乳鏈球菌菌株均有斑點(diǎn)反應(yīng)，其他菌株均無(wú)斑點(diǎn)反應(yīng)發(fā)生。
[0094] (19)結(jié)果驗(yàn)證
[0095] 以上經(jīng)過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)顯示為陽(yáng)性，均可通過(guò)其他生理生化及分子生物學(xué)方法檢測(cè)無(wú) 乳鏈球菌的存在；經(jīng)過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)為陰性的，通過(guò)生理生化及分子生物學(xué)方法檢測(cè)確認(rèn)均不 含無(wú)乳鏈球菌。表明本檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0096] 本發(fā)明的試劑盒的試驗(yàn)結(jié)果判定是利用無(wú)乳鏈球菌促溶血因子cfb基因片段的 特異性，作DNA與DNA的斑點(diǎn)分子雜交，根據(jù)有無(wú)斑點(diǎn)反應(yīng)，可特異性檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 羅非魚無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含 有： (1) 經(jīng)地高辛標(biāo)記的有471堿基的序列1所述的探針； (2) 未經(jīng)標(biāo)記的作為對(duì)照用471堿基的序列1所述的探針； (3) 序列2和序列3所述的用于探針制備及樣品DNA擴(kuò)增正向引物、反向引物的一對(duì)無(wú) 乳鏈球菌特異性引物； (4) 尼龍膜、封閉試劑、堿基磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體、堿性磷酸酶發(fā)光底物、雜交液 顆粒。
2. 如權(quán)利1所述的羅非魚無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，其特征在 于該試劑盒的試驗(yàn)結(jié)果判定是利用無(wú)乳鏈球菌促溶血因子cfb基因片段的特異性，作DNA 與DNA的斑點(diǎn)分子雜交，根據(jù)有無(wú)斑點(diǎn)反應(yīng)，可特異性檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌。
3. 如權(quán)利1所述的羅非魚無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒的制備方 法，其特征在于利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通過(guò)PCR合成了經(jīng)地高辛標(biāo)記的 探針，通過(guò)斑點(diǎn)分子雜交，這些探針可用于檢測(cè)病料樣品中無(wú)乳鏈球菌特異性核酸的存在 或鑒定無(wú)乳鏈球菌病原。
【專利摘要】本發(fā)明涉及羅非魚無(wú)乳鏈球菌特異性核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，屬于水產(chǎn)生物制品，它公開了該試劑盒用特定引物通過(guò)PCR合成了地高辛標(biāo)記的無(wú)乳鏈球菌探針，通過(guò)斑點(diǎn)分子雜交，這些探針可用于檢測(cè)病料樣品或菌株煮沸后的上清液中有否無(wú)乳鏈球菌特異性核酸的存在，用于判定是否有無(wú)乳鏈球菌感染。本發(fā)明涉及的試劑盒利用病料組織DNA提取物或待檢菌株水煮后的上清液作斑點(diǎn)分子雜交，均可在16h～24h內(nèi)完成檢測(cè)并報(bào)告結(jié)果，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-46, C12Q1-14
【公開號(hào)】CN104593509
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510046623
【發(fā)明人】可小麗, 盧邁新, 劉志剛, 朱華平, 高風(fēng)英, 曹建萌, 王淼
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月29日