引入酶切位點(diǎn)并化學(xué) 合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為m; I. 1. 1.3)將步驟I. 1. 1.2)中所得到的m按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶 性表達(dá)方式存在于菌體中； I.I. 1. 4)用鎳柱純化步驟I.I. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，以 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用； 1. 1. 2)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備： 1. 1.2. 1)以步驟I. 1. 1.4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新西 蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型11蛋白抗血清及鼠抗人4群鏈 球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清及 鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于IXIO5 ;所述間接 ELISA是重組M-His融合蛋白作為包被抗原為基礎(chǔ)； I. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋 白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG; I. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟I. 1. 2. 2)所得到的多克隆抗 體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用； 1. 2)免疫納米磁珠的包被： 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液 是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米磁分 離器的磁性強(qiáng)度是0. 4T; 1. 2. 2)依次加入用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC溶液 以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml， 以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清， 用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 1. 2. 3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200yL步驟1. 2. 2)所得到的活化后的磁 珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的 濃度為50-300iig/ml的由步驟I. 1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多 克隆抗體IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離 器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以 15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS緩沖 液的pH= 7. 4 ; 1. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上 清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/L KCl，0? 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0? 5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7. 4 ; I. 2. 5)向各個(gè)離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆?；所?保存緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，a24g/LKH2P04，L44g/LNa2HPO4, 0. 3g/LNaN3, 5g/L牛血清白蛋白，所述保存緩沖液的pH= 7. 4 ; 2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針的制備： 其具體制備方法包括： 2. 1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、600nmolN-羥基琥珀酰亞 胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反應(yīng) 30min后，透析去除過(guò)量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述磷酸 鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述 磷酸鹽緩沖液的pH= 7. 4 ; 2. 2)在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入4-16nmol的步驟I. 1)中所制備的鼠 抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙 二醇PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)Ih; 2.3)用0.2pmPES濾器過(guò)濾除去步驟2. 2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到 50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和 反應(yīng)中的副產(chǎn)物； 2. 4)收集步驟2. 3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽 洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離 心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，置 于4°C保存?zhèn)溆?；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸 二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20,0. 3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH= 7. 4 ;所述 磷酸鹽保存液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉， 10g/L牛血清白蛋白，0. 3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH= 7. 4 ; 3. PBST緩沖液的配制： 其具體配制方法包括： 取 8g NaCL，0.2g KCl，0.24KH2P04，1. 44g Na2HPO4,0.3g NaN3,0.5ml Tween-20 溶解于 800ml蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)整pH至7. 4,再定容至1000ml ; 4) 質(zhì)控品的制備： 4. 1)陽(yáng)性質(zhì)控品：陽(yáng)性質(zhì)控品由滅活的人Ml型A群鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成； 4.2)陰性質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品即經(jīng)臨床確定為人A群鏈球菌陰性的人群的咽拭子；所 述人A群鏈球菌是人A群鏈球菌Ml，3, 5,6, 24血清型。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2. 2)中，依次加入用步驟 1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是lOmg/ml的EDC溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩 沖液配制的濃度是lOmg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活 化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重 懸，得到活化后的磁珠； 所述步驟1. 2. 3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為240iig/ml的由 步驟I. 1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型11蛋白多克隆抗體186溶液各11111， 室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清 后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液； 所述步驟2. 2)中，在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的步驟I. 1)中 所制備的鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修 飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、殼 材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為350nm的羧基磁珠。7. -種基于如權(quán)利要求2所述的基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原 的試劑盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步驟： 1) 將待檢樣本用〇. 5mlPBST緩沖液溶解后將溶解液轉(zhuǎn)入I. 5ml普通離心管中；所述 PBST緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HPO4, 0? 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST緩沖液的pH= 7. 4 ; 2) 向步驟I)中的離心管中加入基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原 的試劑盒中的抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠100-30011 1，室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合 儀上反應(yīng)l〇-45min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清； 3) 添加試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌 液，最后用ImlPBS緩沖液重懸磁珠，制得免疫納米磁珠-菌體抗原復(fù)合物；所述PBS緩沖 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HPO4;所述PBS 緩沖液的pH= 7. 4 ; 4) 取100ill步驟3)得到的免疫納米磁珠-菌體抗原復(fù)合物于另一離心管中，再加入 100Pl基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的試劑盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記的 抗人A群鏈球菌納米探針，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)10-45min，通過(guò)量子點(diǎn) 上的抗體與免疫納米磁珠上的菌體抗原的免疫結(jié)合，量子點(diǎn)被標(biāo)記到菌體抗原表面，形成 磁珠-菌體抗原-量子點(diǎn)"三明治"復(fù)合物； 5) 反應(yīng)完成后，采用納米磁分離器磁分離3min，除去多余的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈 球菌納米探針，用試劑盒中的PBST緩沖液液清洗2遍，復(fù)合物重新分散在100illPBS緩 沖液中，使用熒光酶標(biāo)儀對(duì)其熒光值進(jìn)行檢測(cè)；所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4 ;所述PBS緩沖液的pH= 7. 4 ; 6) 按上述同樣的方法檢測(cè)試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品樣品及一份陽(yáng)性質(zhì)控品 樣品，分別讀取熒光值；四份陰性質(zhì)控品樣品的熒光讀數(shù)的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為 CUT-OFF值；若步驟5)中待檢樣本的檢測(cè)熒光值若大于CUT-OFF值即判斷為待檢樣本中人 A群鏈球菌抗原為陽(yáng)性，反之則判斷為待檢樣本中人A群鏈球菌抗原為陰性；若陽(yáng)性質(zhì)控品 樣品的熒光值小于CUT-OFF值，則表明試劑盒失效； 所述人A群鏈球菌是人A群鏈球菌Ml，3, 5,6, 24血清型。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，向步驟1)中的離心管中 加入基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的試劑盒中的抗人A群鏈球菌免 疫納米磁珠200ii1，室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)20min后取下，將離心管插入 磁力架分離3min，用移液器吸出上清； 所述步驟4)中，取100ill步驟3)得到的免疫納米磁珠-菌體抗原復(fù)合物于另一離心 管中，再加入IOOu1基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人Ml，3, 5,6, 24A群鏈球菌抗原的 試劑盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上 反應(yīng)20min,通過(guò)量子點(diǎn)上的抗體與免疫納米磁珠上的菌體抗原的免疫結(jié)合,量子點(diǎn)被標(biāo)記 到菌體抗原表面，形成磁珠-菌體抗原-量子點(diǎn)"三明治"復(fù)合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待檢樣本包括但不限于咽拭子。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的方法，該方法包括（1）制備抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠；（2）制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針；（3）將待檢樣品用PBST緩沖液溶解后，向溶解液中加入抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合及反應(yīng)后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌，向得到的沉淀物中加入量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針，反應(yīng)后磁分離，以PBST緩沖液洗滌后，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。本發(fā)明具有準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的檢測(cè)人A群鏈球菌的方法，其在人M1，3，5，6，24血清型A群鏈球菌的臨床診斷、病原學(xué)鑒別、流行病學(xué)調(diào)查等方面具有很高的實(shí)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】G01N33/569
【公開(kāi)號(hào)】CN105223351
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410404768
【發(fā)明人】胡征, 楊波, 董俊
【申請(qǐng)人】董俊
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2014年8月18日