一種半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶聯(lián)免疫吸附測定法(EnzymeLinked TmmunoSorbent Assay)，簡稱 ELISA，米用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，對受檢物質(zhì)進行定性或定量分析的一種檢測方法。由于其具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。它以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗體、抗原的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實驗技術(shù)。
[0003]酶聯(lián)免疫吸附測定法的檢測結(jié)果在于加入底物后的顏色反應(yīng)。傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法通常是將酶的底物通過化學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)轭伾盘柣蛘呋瘜W(xué)發(fā)光信號，這種方式的酶聯(lián)免疫吸附法對于高濃度的目標物的測定具有很大的優(yōu)勢。然而對于低濃度的目標物，尚存一些問題，比如說:在低濃度時，產(chǎn)生的顏色信號非常小，以至于不能區(qū)分是否產(chǎn)生了顏色信號；并且，在實際的目標物分析中，沒有目標物存在的情況下，也有可能因為非特異性吸附而產(chǎn)生淡的顏色信號。因此需要一種顏色更容易辨認的信號產(chǎn)生方式，比如說產(chǎn)生不同的顏色。近年來，隨著表面等離子共振技術(shù)(SPR)的發(fā)展與成熟，對于將表面等離子共振引入傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法也越來越引起人們的興趣。該項技術(shù)的特點在于所用的貴金屬材料的表面等離子體共振信號與該金屬的結(jié)構(gòu)參數(shù)極其相關(guān)。利用該項技術(shù)用肉眼檢測銅離子的檢測限能達納摩爾級別?；谫F金屬的表面等離子體共振性質(zhì)的高敏感性與顏色的豐富性使得等離子酶聯(lián)免疫吸附法成為了一種非常有潛力的檢測技術(shù)。
[0004]雖然SPR檢測技術(shù)在ELISA領(lǐng)域有非常好的應(yīng)用前景，然而與傳統(tǒng)的ELISA相比，基于表面等離子體共振的酶聯(lián)免疫吸附法檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用卻相對滯后，迄今為止還沒有相關(guān)的商品化儀器報導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法。該方法具有操作簡單、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可操作性強。使用該方法能夠直接用于檢測各種生物樣品，有望在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)臨床檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有顯著的經(jīng)濟效益。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
(I)顯色納米金的制備:首先根據(jù)檸檬酸鈉還原法合成所需要的金種溶膠，其粒徑為15±5 nm ;然后根據(jù)金種生長法，合成十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)包裹的納米金(CTAB0Au)，其粒徑為45± 15 nm。
[0007](2)目標物的可視化免疫分析:首先根據(jù)經(jīng)典ELISA，捕獲抗體一抗原一檢測抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，然后將鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶(HRP)與生物素化的檢測抗體相結(jié)合，從而將HRP鏈接在抗體上；加入底物后，反應(yīng)一段時間，加入鹽酸終止酶促反應(yīng)；同時生成了黃色的TMB2+。此時加入事先制備好的CTAB包裹的納米金，TMB2+就會與納米金發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生明顯的顏色變化，高靈敏檢測抗原蛋白。
[0008]其具體方法步驟為:
(1)在合成前將所需要用到的玻璃器皿全部用王水浸泡，然后用大量的水沖洗，最后用超純水潤洗干凈；
(2)合成粒徑在15±5nm的納米金:采用檸檬酸鈉還原法合成，在劇烈攪拌下將100mL、2.5X104 M氯金酸放在120°C油浴鍋中回流30 min ;然后向其中加入10 mL lwt%的檸檬酸鈉溶液，在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)20 min，然后關(guān)閉加熱，繼續(xù)攪拌回流至室溫。
[0009](3)合成粒徑在45± 15 nm的納米金:采用金種生長法合成，首先配制生長液60mL，其中含有氯金酸2.5X10 4 M，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)0.01 M，然后加入0.1 M的抗壞血酸(Vc)3 mL，攪拌2 min，最后加入上述15 nm左右的納米金30 mL，混合均勾后在30 °C的水浴中放置6 -8ho
[0010](4)將上述納米金在10000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，沉淀用等量的0.1 M的CTAB重新分散。
[0011](5)將試劑盒從冰箱中取出，并恢復(fù)至室溫；按照傳統(tǒng)ELISA的方式將抗體抗原和酶連接在一起，然后向其中加入相應(yīng)的TMB顯色劑，孵育30min后加入2 M的HCl終止反應(yīng)，并生成相應(yīng)量的TMB2+。
[0012](6)最后將用0.1 M重新分散的納米金加入到酶標板的孔中，不同量的TMB2+和納米金將會發(fā)生不同的刻蝕效果，從而出現(xiàn)不同的顏色。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
(I)傳統(tǒng)ELISA方法只產(chǎn)生一種顏色變化(黃色由淺到深)，而本發(fā)明所述可視化半定量免疫分析法能夠產(chǎn)生兩種顏色變化，從而大大增加了本方法用于肉眼檢測的準確度。
[0014](2)本發(fā)明所述可視化半定量免疫分析法相比于傳統(tǒng)ELISA方法顯色敏感度更高，檢出限更低。
[0015](3)顯色納米金制備簡單，成本低，重現(xiàn)性高。
[0016](4)本發(fā)明所述半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法由傳統(tǒng)ELISA試劑盒和顯色納米金組成，原料易得，容易實現(xiàn)商品化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明所述的等離子體酶聯(lián)免疫吸附試驗法的示意圖。其中左半部分為傳統(tǒng)的ELISA不意圖，右半部分為等尚子傳感不意圖。
[0018]圖2是本發(fā)明所述的顯色納米金的透射電鏡圖。
[0019]圖3是應(yīng)用等離子酶聯(lián)免疫吸附法進行抗原的檢測(前列腺特異抗原，ProstateSpecific Antigen)的比色圖與光譜圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
以下實施例結(jié)合附圖來說明應(yīng)用本發(fā)明制備的微流控芯片進行實際樣品分析的操作過程:
(I)在合成前將所需要用到的玻璃器皿全部用王水浸泡，然后用大量的水沖洗，最后用超純水潤洗干凈；
(2)合成粒徑在15±5nm的納米金:采用檸檬酸鈉還原法合成，在劇烈攪拌下將100mL、2.5X104 M氯金酸放在120°C油浴鍋中回流30 min ;然后向其中加入10 mL lwt%的檸檬酸鈉溶液，在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)20 min，然后關(guān)閉加熱，繼續(xù)攪拌回流至室溫。
[0021](3)合成粒徑在45± 15 nm的納米金:采用金種生長法合成，首先配制生長液60mL，其中含有氯金酸2.5X10 4 M，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)0.01 M，然后加入0.1 M的抗壞血酸(Vc)3 mL，攪拌2 min，最后加入上述15 nm左右的納米金30 mL，混合均勾后在30°C的水浴中放置6 ho
[0022](4)將上述納米金在10000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，沉淀用等量的0.1 M的CTAB重新分散。
[0023]首先制備粒徑為45 nm左右的納米金，并將納米金用0.1 M的CTAB重新分散，附圖2為該粒徑的納米金的透射電鏡圖。
[0024]在本實例中，所選的目標物為前列腺特性性抗原，因此需要將相應(yīng)的抗體和酶連接起來，具體實施方法如下:將載有捕獲抗體的酶標板固定，向其中加入100 uL PSA抗原溶液，用搖床在室溫下孵育2.5 h，捕獲抗體和抗原將自動連接，然后用清洗液洗滌四次，并將孔中的水吸干；再向其中加入100 uL生物素化的檢測抗體，用搖床室溫下孵育I h，重復(fù)清洗步驟；然后向各孔中加入100 uL鏈霉親和素-辣根過氧化酶(HRP)，室溫下孵育45min;最終使所有的抗體、抗原和酶按照圖1左半部分的方式連接。
[0025]然后加入100 uL TMB顯色劑，孵育30 min后加入50 uL 2 M HCl終止反應(yīng)。最后加入100 uL納米金(4.182 nM)反應(yīng)5 min。
[0026]圖3即為采用此等離子酶聯(lián)免疫吸附法測定PSA的比色圖和光譜圖，該比色圖從左往右PSA濃度依次為0，0.15，0.40，0.60，0.80，1.0，2.0，3.0 ng/mL，該方法目視比色的檢出限為0.15 ng/mL。
[0027]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1.一種半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法，其特征在于:所述檢測方法包括以下步驟: (1)顯色納米金的制備:首先根據(jù)梓檬酸鈉還原法合成納米金，其粒徑為15±5nm ;然后根據(jù)金種生長法，合成十六烷基三甲基溴化銨包裹的納米金，其粒徑為45±15 nm ; (2)可視化檢測蛋白抗原:首先根據(jù)經(jīng)典ELISA法，捕獲抗體一抗原一檢測抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，然后將鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶與生物素化的檢測抗體相結(jié)合，從而將辣根過氧化物酶鏈接在抗體上；加入相應(yīng)的TMB顯色劑后，反應(yīng)30min，加入鹽酸終止酶促反應(yīng)；同時生成了黃色的TMB2+;此時加入步驟(I)制備好的十六烷基三甲基溴化銨包裹的納米金，TMB2+就會與納米金發(fā)生反應(yīng)，從而將原來單一的黃色變化轉(zhuǎn)變?yōu)榧t一黃雙色變化，通過目測溶液顏色的變化可以對目標抗原進行半定量分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法，其特征在于:步驟(I)中檸檬酸鈉還原法具體步驟為在劇烈攪拌下將100 mL、2.5X104 M氯金酸放在120°C油浴鍋中回流30 min ;然后向其中加入10 mL lwt%的檸檬酸鈉溶液，在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)20 min，然后關(guān)閉加熱，繼續(xù)攪拌回流至室溫。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法，其特征在于:所述金種生長法為首先配制生長液60 mL，其中含有氯金酸2.5X10 4 M、十六烷基三甲基溴化銨0.01 M，然后加入0.1 M的抗壞血酸3 mL作為還原劑，攪拌2 min，最后加入納米金30 mL，混合均勻后在30°C的水浴中放置6-8 h，合成十六烷基三甲基溴化銨包裹的納米金。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述半定量可視化酶聯(lián)免疫分析方法，其特征在于:步驟(2)中黃色TMB2+和十六烷基三甲基溴化銨包裹的納米金的反應(yīng)時間為5~30 min,反應(yīng)溫度為室溫。
【專利摘要】發(fā)明公開了一種半定量可視化酶聯(lián)免疫分析新方法，包括以下步驟：（1）顯色納米金的制備（2）酶聯(lián)免疫吸附及顯色反應(yīng)。本發(fā)明原料易得，成本低，無需任何復(fù)雜檢測設(shè)備，通過肉眼即可判斷檢測結(jié)果，并且方法操作簡單，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，能夠直接用于半定量快速檢測各種臨床標志蛋白，有望在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)臨床檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
【IPC分類】G01N21/78, G01N33/53
【公開號】CN105223347
【申請?zhí)枴緾N201510604707
【發(fā)明人】郭隆華, 許梢華, 馬小明, 林振宇, 邱彬, 陳國南
【申請人】福州大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月22日