一種穩(wěn)定的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 同型半脫氨酸是含硫氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)由蛋氨酸脫甲基生成。近期的研究表明，同 型半脫氨酸通過(guò)產(chǎn)生超氧化物及過(guò)氧化物損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變凝血因子功能，增加血 栓形成傾向，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成，使屯、血管疾病發(fā)病率及死亡率增加，因此測(cè)定 血中同型半脫氨酸的濃度在臨床上意義十分重要。
[0003]測(cè)定血漿中同型半脫氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法（HPLC)、循環(huán)酶 法、巧光偏振免疫分析法（FPIA)、酶聯(lián)免疫分析法巧IA)、氨基酸分析儀測(cè)定法、離子色譜 法、毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜、電化學(xué)法等。
[0004] 其中，高效液相色譜法（HPLC):先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半脫氨酸 轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與巧光劑進(jìn)行衍生生成同型半賊氨酸一巧光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后 的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，因此流動(dòng)相將其洗脫下來(lái) 的次序也不同，根據(jù)運(yùn)一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開(kāi)，W巧光檢測(cè)器檢測(cè)洗脫下同型半 脫氨酸一巧光物質(zhì)復(fù)合物的巧光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可 W測(cè)定血總同型半脫氨酸的水平。該方法是經(jīng)典的參考方法，但是操作復(fù)雜，耗時(shí)比較久， 且成本較大，逐漸被其他方法取代。
[0005] 循環(huán)酶法：目前主要用同型半脫氨酸轉(zhuǎn)甲基酶及腺巧同型半脫氨酸酶的循環(huán)擴(kuò)增 作用，再加上腺巧脫氨酶、嚷嶺核巧憐酸化酶、黃嚷嶺氧化酶、過(guò)氧化物酶等，或腺巧脫氨 酶、谷氨酸脫氨酶等顯色反應(yīng)測(cè)定同型半脫氨酸含量。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可W直接上生化 儀使用，快速，準(zhǔn)確方便。但是由于使用的工具酶較多，連續(xù)催化反應(yīng)步驟復(fù)雜，試劑質(zhì)量和 反應(yīng)線性都需不斷校正，對(duì)使用維護(hù)要求。由于各個(gè)蛋白酶的穩(wěn)定性和活性要求不同，故測(cè) 定試劑制造中較難找到理想的穩(wěn)定條件，因此穩(wěn)定性受到一定的限制。且測(cè)定主要影響因 素為血氨，此外原料酶價(jià)格昂貴，市面上不容易獲取，導(dǎo)致成本巨大。
[0006] 巧光偏振免疫分析法（FPIA):測(cè)定原理是先用二硫蘇糖醇將標(biāo)本中結(jié)合態(tài)的化y還原成游離形式后，同時(shí)加入腺巧，在S-腺巧-L-同型半脫氨酸水解酶的作用下將Hey轉(zhuǎn) 化為S-腺巧-k同型半脫氨酸（SAH)，然后加入抗SAH單克隆抗體和巧光標(biāo)記的SAH抗原， SAH與巧光標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗SAH抗體，形成大分子的免疫復(fù)合物，最后測(cè)定其巧光偏振 度。此方法要求血標(biāo)本及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室，避免血細(xì)胞內(nèi)Hey的釋放對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。FPIA 法測(cè)定Hey具有較好的精密度，血清與血漿結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性，但FPIA法較適合 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 同樣的，離子色譜法與毛細(xì)電泳法也主要用于實(shí)驗(yàn)研究，極少在臨床上使用，且毛 細(xì)電泳法與高效液相色譜方法相似，還存在操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異 比較大等缺點(diǎn)。
[0008] 酶聯(lián)免疫分析法巧IA):該方法是臨床上測(cè)定同型半脫氨酸常用方法，優(yōu)點(diǎn)在于 操作比較簡(jiǎn)單快捷，并且重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，但是該方法大部分需要手工操作，耗時(shí)較長(zhǎng)， 且試劑昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提出了一種靈敏度高、熱穩(wěn)定 性好、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)的穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑 盒，包括試劑1和試劑2，
[0011] 所述試劑1的組分為：肥Y還原劑：l-200mmol/L，絲氨酸：1.O-lOOmmol/L，NA畑： 0. 5-0. 8g/L，LDH:50-200KU/L;
[0012] 所述試劑2的組分為：穩(wěn)定劑：0.l-lOg/l，脫硫酸P-合成酶：l-lOOKU/l，脫硫酸 P-分解酶：l-l〇〇KU/L。
[0013] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑1中所述的HCY還原劑為T(mén)CEP、琉 基乙酸、邸TA的混合物。當(dāng)同型半脫氨酸在細(xì)胞內(nèi)積聚，并進(jìn)入血液循環(huán)后，大部分W氧化 型存在，并與蛋白結(jié)合，還原型同型半脫氨酸在血中僅占1%。測(cè)定血中總同型半脫氨酸的 含量，一般需采用還原劑將氧化型同型半脫氨酸還原為還原型同型半脫氨酸。HCY還原劑的 試劑很多，但是因?yàn)槎加羞€原性，所W極易被氧化，都不穩(wěn)定，另外現(xiàn)有技術(shù)中有些試劑為 干粉或者為3試劑，在使用中極其不便。本發(fā)明還原劑中的TC陽(yáng)相對(duì)于其他它還原劑相對(duì) 穩(wěn)定，并且使用的PH范圍最廣。
[0014] 作為優(yōu)選，所述的TCEP、琉基乙酸、EDTA按質(zhì)量比5-7:1. 5-2. 5:1混合。將HCY還 原劑的濃度限定在l-200mmol/L的原因在于還原劑濃度過(guò)小不能將血清中的HCY完全還 原，導(dǎo)致結(jié)果偏低。如果HCY濃度大了，會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)，從而影響整個(gè)結(jié)果。HCY還原劑的 濃度是TCEP的濃度，琉基乙酸、邸TA按TCEP的用量調(diào)整。TCPE與琉基乙酸和邸TA按上述 比例混合使用，更加穩(wěn)定，從而使試劑更加穩(wěn)定。
[0015] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑2中所述的穩(wěn)定劑為可溶性淀粉 和谷脫甘膚的混合物?，F(xiàn)有技術(shù)中同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒一般采用甘油、乙二醇、BSA等 常規(guī)的試劑做穩(wěn)定性，導(dǎo)致穩(wěn)定效果一般，本發(fā)明中采用的可溶性淀粉與谷脫甘膚都是含 有較多琉基的酶，單獨(dú)做穩(wěn)定性存在的時(shí)候，熱穩(wěn)定性較差，但是通過(guò)不斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將可 溶性淀粉和谷脫甘膚共同作為穩(wěn)定劑使用時(shí)，可W大幅度提高同型半脫氨酸檢測(cè)試劑的 穩(wěn)定效果，可W達(dá)到在4°C下至少保存1年W上。
[0016] 作為優(yōu)選，所述可溶性淀粉和谷脫甘膚按質(zhì)量比10 :0. 8-2混合。穩(wěn)定劑的濃度 是可溶性淀粉的濃度，谷脫甘膚按可溶性淀粉的用量調(diào)整。若穩(wěn)定劑的濃度過(guò)高，則成本較 大，但若穩(wěn)定劑的濃度過(guò)低，則達(dá)不到應(yīng)有的效果。
[0017] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑1和試劑2均還包括緩沖液 10-200mmol/l，其中緩沖液為T(mén)RIS、Good'S緩沖液、MOPS、肥陽(yáng)S、S乙醇胺、憐酸鐘緩沖液、 憐酸鋼緩沖液中的一種或多種。
[0018] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑1和試劑2均還包括保護(hù)劑，保護(hù) 劑占試劑1或試劑2的質(zhì)量百分比的0. 1-20%，其中保護(hù)劑為BSA、薦糖、海藻糖、甘油、乙 二醇、山梨醇、PEG6000中的一種或多種。
[0019] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑1和試劑2均還包括表面活性劑， 表面活性劑占試劑1或試劑2的質(zhì)量百分比的0. 01-1 %，其中表面活性劑為曲拉通系列、吐 溫系列、brij-35、二月桂甘油硫酸醋中的一種或多種。
[0020] 在上述穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒中，試劑1和試劑2均還包括防腐劑 0.l-5g/l，其中，防腐劑為疊氮鋼、proclin300、MIT、硫酸慶大霉素、硫柳隸中的一種或多 種。
[0021] 本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒原理為：氧化型HCY被轉(zhuǎn)化成游離HCY，游 離HCY在CBS催化下和絲氨酸反應(yīng)生成k脫硫酸山-脫硫酸在C化催化下又生成HCY、丙 酬酸和畑3;該循環(huán)反應(yīng)生成的丙酬酸可W用乳酸脫氨酶LDH和NADH檢測(cè)到，NADH轉(zhuǎn)變成 NAD+的速率與樣品中HCY含量成正比。
[0022] 反應(yīng)原理的反應(yīng)式如下：
[0023]
[0026] 在340nm處測(cè)定NADH降低速率可獻(xiàn)則得同型半脫氨酸的含量。
[0027] 本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒可W使液體試劑盒。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
[0029] 本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定方便，雙試劑無(wú)需配制，為液態(tài)試劑， 可W直接使用，且檢測(cè)速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，線性范圍廣，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，可 W達(dá)到在4°C下至少保存1年W上，另外原料成本較低，完全滿足臨床檢驗(yàn)的需要。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒與對(duì)比例1進(jìn)口試劑盒的血清中同 型半脫氨酸含量的相關(guān)性曲線。
[0031] 圖2為本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒與對(duì)比例2、6、7試劑盒的熱穩(wěn)定性 曲線。
[0032] 圖3為本發(fā)明穩(wěn)定的同型半脫氨酸檢測(cè)試劑盒與對(duì)比例3、4、5試劑盒的還原劑熱 穩(wěn)定性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033] W下是本發(fā)明的具體實(shí)施例結(jié)合【附圖說(shuō)明】，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描 述，但本發(fā)明并不限于運(yùn)些實(shí)施例。
[0034] 本發(fā)明試劑盒測(cè)定血清中同型半脫氨酸含量的測(cè)試條件為：方法：速率法；主/副 波長(zhǎng)：340nm/405nm;樣本/試劑1/試劑2 : 16. 5/250/25 ;溫度：37°C;血清+試劑1時(shí)間： l-5min;加入試劑2后的反應(yīng)時(shí)間：3-5min;校正類(lèi)型：線性；校準(zhǔn)方法：兩點(diǎn)定標(biāo)；反應(yīng)方 向：向下。
[0035] 測(cè)定步驟：
[0036] 標(biāo)本 16. 5y1
[0037] 試劑 1 250y1
[0038] 混勻，置于37°C解育l-5min
[0039] 試劑 2 25y1
[0040] 混勻，37°C解育1. 5min后，連續(xù)檢測(cè)l-3min，計(jì)算AA/min。
[0041] 計(jì)算結(jié)果
[0042]
[004引樣品要求：
[0044]1、樣本為