一種用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，與應用性基礎醫(yī)學研究和臨床研究相聯系；涵蓋腫瘤學、診斷學，糖生物學。
【背景技術】
[0002]肝癌(HCC)是一種多基因參與，多因素介導，發(fā)病機制復雜的常見惡性腫瘤。肝癌發(fā)病率世界第六，致死率世界第二，約50%的肝癌發(fā)生在我國。絕大多數患者發(fā)病隱匿，出現臨床癥狀后就醫(yī)時已屬晚期，喪失了治療的良機，因此早期診斷對于提高患者的生存率至關重要。目前，肝癌的主要的臨床檢測為超聲成像檢測和肝癌血清標志物AFP的檢測。超聲成像因操作者的不同而容易產生誤差，而AFP作為診斷標志物檢測和診斷準確率會比超聲成像更低。因此，很多研究仍在致力于尋找新的肝癌診斷標志物。
[0003]在蛋白質不同的翻譯后修飾中，糖基化最為常見，幾乎50%的蛋白質都被認為具有糖基化修飾。糖鏈結構在眾多病理過程中產生特異性的改變，如類風濕性關節(jié)炎、囊腫性纖維化、動脈粥樣硬化以及多種腫瘤。因此蛋白質分子的聚糖結構改變可以作為腫瘤的分子診斷標志物，亦可成為潛在的腫瘤治療靶點。例如，已被FDA批準作為HCC的診斷標志物的L3型甲胎蛋白(AFP-L3)是巖藻糖基化的AFP。巖藻糖修飾能賦予聚糖很多獨特的功能特性，其在輸血反應、凝集素介導的白細胞和內皮的粘附、宿主和微生物相互作用和個體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。此外，巖藻糖還參與構成某些重要粘附分子的聚糖結構，與腫瘤轉移關系密切。在癌癥中發(fā)現sialyl Lewisx和sialyl Lewis 3含量增多，許多腫瘤中A和B型血型抗原丟失伴隨著H血型抗原和Lewisy表達升高。
[0004]目前檢測糖蛋白聚糖結構變化的技術方法有生物質譜、液相色譜和植物凝集素親和印跡等，其中植物凝集素是一類存在于多數植物中的糖蛋白，其最大特點是能夠識別糖蛋白和糖脂中的聚糖，特別是細胞膜中復雜結構的聚糖即細胞膜表面決定簇，它們與聚糖的結合是非共價且可逆的。AAL是一種親和α連接巖藻糖(Terminal a Fuc和土Sia-Lex)的植物凝集素，結合珠蛋白(Hp)是一種急性反應性蛋白，能與血紅蛋白結合，防止體內鐵的丟失和減少腎損害。其分子量為90kDa，是由兩個α和兩個β亞基組成的四聚體，亞基間通過二硫鍵相連。結合珠蛋白在體內合成初期是一條分子量為38kDa的多肽，由三部分組成，即α、β亞基區(qū)域及N-末端的信號肽序列，在翻譯后修飾過程中，信號肽被水解掉，同時通過膜相關的酶體系將核心寡糖合并入β區(qū)域。結合珠蛋白β亞基含有4個潛在的1糖基化位點，分別為4迎184)811207^迎211和4迎241。在前期工作中，發(fā)現相比于健康正常人，肝癌患者血清單位Hp親和楊樹茹凝集素(AAL)能力顯著升高，說明肝癌患者的單位Hp巖藻糖基化聚糖含量升高。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種具有較高準確率的用于肝癌血清學預測的試劑盒。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于診斷肝癌的結合珠蛋白試劑盒，其特征在于，包含Fuc-Hp半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量檢測ELISA板包括反相AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板。
[0007]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒還包含一個HCC預測模型:
[0008]P = exp(-1.109+3.928*Fuc_Hp)/[1+exp(-1.109+3.928*Fuc_Hp)]
[0009]其中，所述的Fuc-Hp值的計算方法為:每個血清樣品中AAL結合Hp的實際OD值與相同血清樣品中Hp蛋白的實際OD值的比值，所述的血清樣品中AAL結合Hp的實際OD值通過反相AAL-ELISA板檢測得到，血清樣品中Hp蛋白的實際OD值通過Protein-ELISA板檢測得到，該模型區(qū)分肝癌和健康正常人的Cut off值為0.6100。
[0010]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒還包含AAL，其濃度為5 μg/mLo
[0011]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒還包含用于封閉反相AAL-ELISA板的封閉劑，為3% BSA溶液。
[0012]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒還包含血清稀釋液，所述的血清稀釋液含有 0.1M Tris-HCU0.15M NaClUmM CaCl2^P ImM MgCl 2，pH 為 7.5。
[0013]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的試劑盒還包含用于Protein-ELISA板的捕獲抗體。
[0014]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的試劑盒還包含用于反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的酶標Hp抗體。
[0015]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的試劑盒還包含底物溶液。
[0016]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預測的試劑盒還包含終止液。
[0017]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝癌的結合珠蛋白試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說明書。
[0018]本發(fā)明中提及的Hp蛋白由前期糖蛋白質組學工作確定單位Hp親和AAL能力顯著增強，說明肝癌患者的單位Hp巖藻糖基化聚糖含量增多。
[0019]本發(fā)明主要是建立并優(yōu)化反相AAL-ELISA和Protein-ELISA方法，確定最優(yōu)的捕獲AAL濃度、血清樣品的上樣量、血清稀釋液及選擇酶標抗體；并選擇合適的反相AAL-ELISA封閉劑。排除Hp抗體與其它抗原的交叉反應，確立反相AAL-ELISA和Protein-ELISA對Hp的檢測范圍和重復性，構建可用于臨床血清樣品篩查的Fuc-Hp半定量檢測系統。
[0020]如圖1所示，本發(fā)明通過反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的制備，聯合并行分析血清中Hp的巖藻糖(Fuc)和蛋白的表達水平，用于肝癌和健康正常人血清中單位Hp蛋白中結合巖藻糖的含量(Fuc-Hp)的定量檢測。并根據Fuc-Hp的檢測數據和臨床資料的回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數可用于原發(fā)性肝細胞肝癌的早期篩查。
[0021]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0022]本發(fā)明通過反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的制備與檢測，分別形成AAL-抗原-Hp抗體復合物和Hp抗體-抗原-酶標抗體復合物，以AAL結合Hp的吸光度(0D值)與Hp蛋白的吸光度比值作為衡量單位Hp蛋白中結合巖藻糖的含量(Fuc-Hp)，通過對臨床資料進行回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數，獲得受試者工作曲線(ROC)以及判別(Cutoff)值，該函數對于HCC的診斷靈敏度和特異度分別為68.36%和95.92%,AUC為0.836。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高通量性，高特異性，檢測快速準確等突出優(yōu)點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。本發(fā)明適用于肝癌高發(fā)現場或者肝病人群大規(guī)模篩查，對于提高肝癌的診斷率，實現早期干預治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0023]圖1為高通量Fuc-Hp檢測系統原理示意圖；
[0024]圖2為反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的線性檢測范圍圖；
[0025]圖3為Fuc-Hp檢測系統構建的ROC曲線圖；
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0027]實施例
[0028]—、一種用于肝癌血清學預測的結合珠蛋白試劑盒，包含如下組分:
[0029]1、Fuc-Hp半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量檢測ELISA板包括反相AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板。
[0030]2、HCC預測模型:
[0031]P = exp(-1.109+3.928*Fuc_Hp)/[1+exp(_1.109+3.928*Fuc_Hp)]
[0032]其中，所述的Fuc-Hp值的計算方法為:每個血清樣品中AAL結合Hp的實際OD值與相同血清樣品中Hp蛋白的實際OD值的比值，所述的血清樣品中AAL結合Hp的實際OD值通過反相AAL-ELISA板檢測得到，血清樣品中Hp蛋白的實際OD值通過Protein-ELISA板檢測得到，該模型區(qū)分肝癌和健康正常人的Cut off值為0.6100。
[0033]3、AAL (Vector，L-1390)，其濃度為 5 μ g/mL。
[0034]4、用于封閉反相 AAL-ELISA 板的封閉劑(3% BSA in PBS，pH7.2-7.4)。
[0035]5、血清稀釋液(含有 0.1M Tris-HCU0.15M NaClUmM CaCljP ImM MgCl 2，pH7.5)。
[0036]6、用于 Protein-ELISA 板的捕獲抗體(R&D system, Catalog Number DHAPGO)。
[0037]7、用于反相 AAL-ELISA 板和 Protein-