本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記試劑，具體涉及一種開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在硫醇化合物的高效液相色譜分析中，馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢：(1)與傳統(tǒng)的芳基鹵化物、苯并呋喃磺酰鹵等試劑相比，它們與硫醇反應(yīng)速度快，在室溫及生理pH下即可進(jìn)行。(2)對巰基的選擇性高，加成產(chǎn)物比較穩(wěn)定。(3)自身無熒光或熒光很弱，在與硫醇加成后熒光增強(qiáng)，這種熒光開關(guān)效應(yīng)極大地降低了檢測過程中的背景信號干擾。

然而目前可應(yīng)用的馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑數(shù)量有限，并且與硫醇加成產(chǎn)物熒光開關(guān)效應(yīng)不明顯，合成步驟復(fù)雜，因此有必要開發(fā)一種標(biāo)記反應(yīng)迅速、熒光開關(guān)效應(yīng)好、合成方法簡便的開關(guān)型馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種標(biāo)記反應(yīng)迅速、對硫醇選擇性高、無背景干擾、合成方法簡便的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑；本發(fā)明同時(shí)提供其合成方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑是以咔唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，馬來酰亞胺為反應(yīng)活性基團(tuán)，其化學(xué)名為：N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑的合成方法，包括以下步驟：

(1)將順丁烯二酸酐溶解到乙腈中，常溫下滴加含有3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢，除去溶劑，得到中間體N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸；

(2)用乙酸酐將N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸溶解，加入無水乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢冷卻，再倒入水中淬滅反應(yīng)，回收固體后，經(jīng)干燥、重結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺。

其中：

步驟(1)中順丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑的摩爾比為1.1～1.4:1。

步驟(1)中滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)0.8～1小時(shí)。

步驟(1)中反應(yīng)完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。

步驟(2)中無水乙酸鈉與N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸的摩爾比為1:5～8。

步驟(2)中加入無水乙酸鈉后，在100℃下反應(yīng)0.8～1小時(shí)。

步驟(2)中采用乙腈重結(jié)晶三次。

所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑的應(yīng)用，即檢測硫醇濃度的方法，包括如下步驟：

(1)配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液；配制5份硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液，濃度分別為1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制濃度為100mM的N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的乙腈溶液；

(2)依次將50μL PBS緩沖溶液、100μL硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)完畢后，取10μL進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，設(shè)置熒光激發(fā)波長為274nm，熒光發(fā)射波長為363nm，得到硫醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，以硫醇濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制硫醇濃度工作曲線；

(3)將樣品用開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記后，進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，將所得到的峰面積代入硫醇濃度工作曲線中，即可求得樣品中硫醇的濃度。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑是以咔唑?yàn)闊晒鈭F(tuán)，馬來酰亞胺為反應(yīng)活性基團(tuán)，其中馬來酰亞胺環(huán)與咔唑熒光團(tuán)直接相連，由于馬來酰亞胺環(huán)的強(qiáng)吸電子效應(yīng)，使標(biāo)記試劑的量子產(chǎn)率顯著下降，表現(xiàn)為無熒光。

本發(fā)明試劑自身不發(fā)熒光，可在中性條件下選擇性地與硫醇化合物反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光的衍生產(chǎn)物，極大地降低硫醇檢測過程中的背景干擾；標(biāo)記反應(yīng)具有高選擇性，在生理pH值下只和硫醇發(fā)生反應(yīng)；標(biāo)記反應(yīng)速度快，對硫醇的標(biāo)記反應(yīng)可在10分鐘內(nèi)完成；標(biāo)記試劑合成步驟簡單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)率較高，經(jīng)分離提純后，化學(xué)純度達(dá)99.6％以上，具有標(biāo)記反應(yīng)速率快、標(biāo)記產(chǎn)率高、對硫醇選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，有利于增強(qiáng)硫醇類化合物分析的準(zhǔn)確性和靈敏性，可應(yīng)用于生命分析、環(huán)境分析、食品分析等研究領(lǐng)域中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的合成路線圖。

圖2是實(shí)施例1N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的核磁¹HNMR圖。

圖3是實(shí)施例2試劑和其硫醇衍生物的熒光發(fā)射圖。

圖4是實(shí)施例3試劑與巰基化合物的反應(yīng)路線圖。

圖5是實(shí)施例3試劑衍生5種硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

如圖1所示，本發(fā)明的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑的合成共有2步，以順丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑?yàn)樵?，具體合成操作如下：

1、中間體N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸的制備：

在250mL的圓底燒瓶中加入5g順丁烯二酸酐和100mL乙腈，開始攪拌；在順丁烯二酸酐完全溶解后，滴加含有9.7g 3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液，得到白色的懸浮液，并繼續(xù)攪拌1小時(shí)；反應(yīng)完后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到中間體N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸13.7g，產(chǎn)率96％。

2、目標(biāo)產(chǎn)物N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的制備：

用70mL乙酸酐將所得的N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸溶解，加入0.7g無水乙酸鈉，于100℃油浴下反應(yīng)1小時(shí)；冷卻后，倒入水中淬滅反應(yīng)，將固體抽濾并干燥，用乙腈重結(jié)晶三次，得到淡黃色晶體，為目標(biāo)產(chǎn)物N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺。9.6g，產(chǎn)率74％。

產(chǎn)物表征如下：

¹HNMR(CDCl₃,400MHz,ppm)δ8.41(d,1H,Ar-H),8.16(d,1H,Ar-H),7.80-7.85(dd,2H,-CH-CH-,J＝8.0Hz),7.53(m,1H,Ar-H),7.45(dd,2H,J＝8.0Hz),7.41(s,1H,Ar-H),7.3(m,1H,Ar-H),4.4(m,2H,-CH₂-),1.47(t,2H,-CH₃).(圖2)

IR(KBr):3470(NH₂),2962(-CH₃),2875,3056,1600(ph),1644(-C＝O)；

Found:C 74.44,H 4.72,N 9.74,O 11.16；Calculated:C 74.47,H 4.86,N 9.65,O 11.05；MS:m/z 290.1[M+H]⁺.

實(shí)施例2

為了驗(yàn)證熒光標(biāo)記試劑的熒光性質(zhì)，用乙腈配制濃度為1μM的N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺溶液和相同濃度的己硫醇衍生物溶液，如圖3所示，在與己硫醇反應(yīng)前，該試劑幾乎無熒光，反應(yīng)后熒光顯著增強(qiáng)。熒光最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為274nm和363nm。同時(shí)，以色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，計(jì)算了N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺和其硫醇衍生物的熒光量子產(chǎn)率。經(jīng)計(jì)算，N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的量子產(chǎn)率為0.004，與硫醇反應(yīng)后量子產(chǎn)率為0.388。

實(shí)施例3

利用該熒光標(biāo)記試劑檢測咖啡中的硫醇含量，配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液；配制5種硫醇標(biāo)準(zhǔn)品(3-巰基-甲基甲酸丁酯，3-巰基-3甲基丁基醇，2-甲基-3-四氫呋喃硫醇，糠基硫醇，3-巰基-己醇)一系列濃度的乙腈溶液，濃度分別為1μM、10μM、100μM、1mM、10mM，將相同濃度的不同種類的硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液進(jìn)行混合，得到5個硫醇混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；配制濃度為100mM的N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的乙腈溶液。

(2)依次將50μL PBS緩沖溶液、100μL硫醇混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反應(yīng)10分鐘。N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺與硫醇反應(yīng)式如圖4。反應(yīng)完成后取10μL進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，設(shè)置熒光激發(fā)波長為274nm，熒光發(fā)射波長為363nm，得到硫醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，在10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了5種硫醇分析物的完全分離，圖5為濃度為1×10^-6mol/L的硫醇混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。以硫醇濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制硫醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)將咖啡樣品用熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記后，進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，將所得到的峰面積代入工作曲線中，即可求得咖啡樣品中硫醇的濃度。