一種多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制備和分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控核酸分析芯片的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有樣品前處理，核酸提取與純化，核酸擴(kuò)增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制備和分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸作為基本的遺傳物質(zhì)，攜帶著各種信息，對其結(jié)構(gòu)、功能的認(rèn)識，有利于研究物種的遺傳、進(jìn)化以及疾病診斷等。微流控芯片在核酸分析方面有著廣泛和極其重要的應(yīng)用，如基因突變檢測、病原體基因鑒定、食品安全檢驗(yàn)。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)雖然能實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增檢測，但需要人工進(jìn)行復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作，如樣品前處理，核酸提取，DNA擴(kuò)增等多個步驟，而且需要核酸提取儀，PCR擴(kuò)增儀，基因分析儀等多臺儀器，其檢測結(jié)果受人為因素的影響較大，需要專業(yè)技術(shù)人員和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。微流控芯片具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點(diǎn)，它可以在幾分鐘甚至更短的時間內(nèi)進(jìn)行上百個樣品的同時分析，并且可以在線實(shí)現(xiàn)樣品的預(yù)處理及分析全過程。PCR技術(shù)和微流控技術(shù)的相結(jié)合，能實(shí)現(xiàn)核酸操作過程的自動化、全封閉，簡化了人工的操作過程，避免了過程污染，提高了核酸檢測的效率和準(zhǔn)確性。
[0003]集成化的微流控芯片通常將微流體控制與分析單元集成在芯片上，如微栗、微閥、微傳混合器、微流量控制器等，使體積微型化和功能集成化，在較短時間內(nèi)精確完成從樣品制備到結(jié)果顯示的全部過程。盡管大規(guī)模集成的微全分析系統(tǒng)還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，但隨著微流控芯片的運(yùn)用與發(fā)展，針對特定功能的微流控芯片及系統(tǒng)發(fā)展迅速，如靜態(tài)腔式微流控PCR系統(tǒng)、具有樣品前處理功能的核酸提取系統(tǒng)、集成化的溫控系統(tǒng)、微型化的檢測系統(tǒng)。目前，由于各功能模塊的研究突破，促進(jìn)了集成化的發(fā)展，但形成一個完整的集成化系統(tǒng)還存在著很大的技術(shù)難度。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)具有多功能的集成化微流控核酸分析芯片，本研究團(tuán)隊(duì)早已開展過特定功能的微流控核酸分析芯片研究，如趙樹彌等在分析化學(xué)上發(fā)表的《集成核酸提取的實(shí)時熒光PCR微全分析系統(tǒng)》。此論文報(bào)道的集成核酸提取芯片是針對血液裂解液，在芯片上做核酸提取與PCR反應(yīng)，不能對血液樣品直接進(jìn)行測試。Emily A.0blath等在Lab ona chip 上發(fā)表的〈〈A microfluidic chip integrating DNA extract1n and real-timePCR for the detect1n of bacteria in saliva》，文中的這種微流控芯片雖然能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品的直接處理，但是氧化鋁膜易碎，芯片制作困難，而且芯片是開腔式設(shè)計(jì)，易造成氣溶膠污染，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。Wu Qingqing等在Analytical chemistry上發(fā)表的((Integrated glass microdevice for nucleic acid purificat1n, loop-mediatedisothermal amplificat1n, and online detect1n》，文中的這種芯片是集核酸抽提，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增及在線分析的整合芯片，但是該芯片采用微柱法提取核酸，提取效率和微柱的可靠性需進(jìn)一步研究，芯片上沒有集成裂解功能，樣品需要手工裂解后再加入到芯片中，而且只能做等溫?cái)U(kuò)增，使用條件有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明技術(shù)解決問題:克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有樣品前處理，核酸提取與純化，核酸擴(kuò)增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制備和分析方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種多功能的集成化微流控核酸分析芯片，所述芯片是在同一塊微流控芯片上將樣品前處理、DNA提取、擴(kuò)增功能模塊集成，能實(shí)現(xiàn)核酸分析結(jié)果輸出的多功能的集成化微流控核酸分析芯片；
[0007]所述芯片包括基底，液路層基片，彈性薄膜，氣路層基片四層結(jié)構(gòu)；
[0008]液路層基片的上表面嵌有多個試劑腔、多個混合腔和DNA提取腔，下表面嵌有裂解腔、廢液腔和多個擴(kuò)增反應(yīng)腔，上下表面腔體間的連接通過微通道和微孔道實(shí)現(xiàn)；
[0009]氣路層基片下表面含有凹陷的多個微閥氣腔和上表面凸起的卡合接頭，氣路層基片中心以微孔道貫穿；
[0010]液路層基片的下表面與基底鍵合，上表面與彈性薄膜下表面鍵合，以氣路層基片的下表面與彈性薄膜上表面鍵合形成一塊完成的多功能的集成化微流控核酸分析芯片。
[0011]所述基底是硅片、玻璃，或能與液路層基片材料鍵合的材料。
[0012]所述液路層基片和氣路層基片的材料是PDMS，PC, PMMA或PS多種聚合物材料。
[0013]所述卡合接頭為卡合結(jié)構(gòu)，利用PDMS具有的彈性，實(shí)現(xiàn)接口密封。
[0014]—種多功能的集成化微流控核酸分析芯片的方法，實(shí)現(xiàn)步驟如下:
[0015](1)液路層基片通過模具生成，此模具分上模具和下模具兩種，結(jié)構(gòu)為尺寸與基片凹陷大小相同的凸顯結(jié)構(gòu)，兩者構(gòu)成組合模具，使用該組合模具通過注塑法可快速生成液路層基片；
[0016](2)氣路層基片也是通過模具生成，此模具分為上模具和下模具兩種，結(jié)構(gòu)尺寸與基片凸凹大小相同但相反的凹凸結(jié)構(gòu)，兩者構(gòu)成組合模具，使用該組合模具通過注塑法可快速生成氣路層基片；
[0017](3)以等離子體清洗基底、液路層基片、彈性薄膜、氣路層基片鍵合成一塊完整的微流控核酸分析芯片。
[0018]—種多功能的集成化微流控核酸分析芯片進(jìn)行分析的方法實(shí)現(xiàn):
[0019](1)樣品加載
[0020]芯片上核酸分析所需要的試劑事先加載到多個試劑腔里，而樣品直接加載到起始的試劑腔即可；
[0021](2)裂解試劑混合
[0022]裂解所試劑在受外力的驅(qū)動下，從每個試劑腔流經(jīng)微通道進(jìn)行擾動混合，流動到對應(yīng)的混合腔進(jìn)行開口比混合和自由擴(kuò)散混合，混合后進(jìn)行到裂解腔內(nèi)；
[0023](3)加熱裂解
[0024]根據(jù)試劑里面的酶活性需求，對裂解腔內(nèi)的試劑加熱，DNA被釋放到溶液中；加熱裂解后的溶液與每個試劑腔的試劑在對應(yīng)的混合腔進(jìn)行擾動和自由擴(kuò)散混合，又經(jīng)過開口比的混合形式被驅(qū)動到DNA提取腔內(nèi)；
[0025](4)硅膠膜上DNA吸附、清洗、洗脫
[0026]在提取控內(nèi)，基于固相萃取法，采用硅膠膜提取核酸，DNA在高鹽(3-5M鹽酸胍)低pH(5.0-6.5)條件下能吸附在硅膠膜上，低鹽(2.5mMtris-HCL或者水溶液)高pH(8-8.5)條件下被釋放，可純化DNA，獲得高質(zhì)量DNA ;提取后的DNA在其中一個試劑腔的清洗試劑I進(jìn)行清洗，在另一個試劑腔的清洗試劑II又再一次清洗去除雜質(zhì)，清洗后的廢液均被抽至廢液腔內(nèi)，然后再經(jīng)另外試劑腔中的洗脫試劑進(jìn)行DNA的洗脫；
[0027](5)反應(yīng)試劑的混合以及擴(kuò)增反應(yīng)
[0028]基于PCR或等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于擴(kuò)增硅膠膜上洗脫下來的DNA上的一段特異的基因片段，在其中一個試劑腔的試劑一部分進(jìn)入一個擴(kuò)增反應(yīng)腔，另一部分與DNA溶液混合進(jìn)入另一個擴(kuò)增反應(yīng)腔，相同溫控條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)擴(kuò)增的結(jié)果可判別特定基因的存在性以及含量的相對量。
[0029]本發(fā)明的原理在于:
[0030](1)該微流控芯片由4層構(gòu)成，液路層基片和氣路層基片分別通過模具注塑生成，整塊微流控芯片以等離子體清洗基底、液路層基片、彈性薄膜、氣路層基片等鍵合生成。
[0031](2)基于固相萃取法，采用硅膠膜提取核酸，DNA在高鹽(3-5M鹽酸胍)低pH(5.0-6.5)條件下能吸附在硅膠膜上，低鹽(2.5mMtris-HCL或者水溶液)高pH(8-8.5)條件下被釋放，可純化DNA，獲得高質(zhì)量DNA。
[0032](3)基于PCR或等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于擴(kuò)增一段特異的基因片段，根據(jù)擴(kuò)增的結(jié)果可判別特定基因的存在性以及含量的相對量。
[0033]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0034](1)相對于傳統(tǒng)的核酸實(shí)驗(yàn)操作方法，本發(fā)明的微流控芯片核酸分析方法操作簡單，只需要添加樣品即可，在芯片內(nèi)部就能實(shí)現(xiàn)樣品的處理，核酸提取與擴(kuò)增反應(yīng)，直接給出結(jié)果。
[0035](2)液路層基片和氣路層基片可通過組合模具通過注塑法生成，快捷簡單。
[0036](3)與現(xiàn)有的技術(shù)報(bào)道的芯片不同之處，本發(fā)明還具有血液裂解等樣品前處理功會泛。
[0037](4)本發(fā)明有兩個擴(kuò)增反應(yīng)腔可進(jìn)行對照組實(shí)驗(yàn)，不需要在進(jìn)行手工實(shí)驗(yàn)對照，而且本發(fā)明不僅可用于PCR的擴(kuò)增檢測，還可用于諸如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(如LAMP)等核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測。
[0038]總之，本發(fā)明提供了一種具有樣品前處理，核酸提取與純化，核酸擴(kuò)增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片，實(shí)現(xiàn)了“樣品進(jìn)-結(jié)果出”的自動化、全封閉操作，避免了繁瑣復(fù)雜的人工操作，提高了檢測效率。
【附圖說明】
[0039]圖1為本發(fā)明的微流控芯片結(jié)構(gòu)圖；
[0040]圖2為本發(fā)明的微流控芯片解析層圖；
[0041]圖3為本發(fā)明中液路層下模具結(jié)構(gòu)圖；
[0042]圖4為本發(fā)明中液路層上模具結(jié)構(gòu)圖；
[0043]圖5為本發(fā)明中氣路層下模具結(jié)