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一種轉(zhuǎn)基因植株dna的提取方法

文檔序號:9611717閱讀:1230來源:國知局
一種轉(zhuǎn)基因植株dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學技術(shù)領(lǐng)域,具體的說是設(shè)及一種轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前,擬南芥和煙草是最常用模式植物,在基因功能研究中起到舉足輕重的作用。 在轉(zhuǎn)基因工作中,經(jīng)常需要提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA,比如轉(zhuǎn)基因鑒定、插入位點檢測、拷貝數(shù) 分析等。由于每個轉(zhuǎn)基因株系的插入位點和拷貝數(shù)存在差異,通常需要提取幾十株甚至幾 百株植株的DNA,工作量巨大。因此如何一次性獲得質(zhì)量好且量足夠的轉(zhuǎn)基因植株DNA,是 轉(zhuǎn)基因研究工作開展的前提。 陽00引常規(guī)擬南芥和煙草提取DNA的方法由W下兩種:SDS法和CTAB法。
[0004]SDS法,步驟如下:(1)取新鮮的擬南芥葉片2-3片加入2血的離屯、管中,加入 液氮,玻璃棒研碎;(2)研磨W后,加入600-700μL的提取液,混勻,然后在60°C下水浴 20-60min;(3)4°C下12OOOr/min離屯、lOmin;(4)取上清液至一新管,加入等體積的氯仿: 異戊醇(24 :1),4°C下12 00化/min離屯、7min; (5)取上清液至一新管,加入70%體積的異 丙醇,混勻,4°(:下1200化/111111離屯、15111111;(6)棄上清,70%乙醇洗2次沉淀,吹干;(7)溶 于 20-30μL含有 0.Img/mLRNase的(1地2〇 中。 陽0化]CTAB法,步驟如下:(1)取一片大小為0. 5cmX2cm的新鮮葉子用液氮快速冷凍后 放置于1. 5mL的巧pendorf管中用末端燒溶合藍槍頭娠碎;(2)研磨W后,加入600μL的提 取液,顛倒離屯、管數(shù)次混勻,然后在65°C下水浴60min;做取出后加等體積的酪:氯仿:異 戊醇(25:24:1)抽提液,混勻,用E:ppendo;rf離屯、機于 4°C,10000;r/min離屯、5min。(4)將 上清液轉(zhuǎn)至新的離屯、管中,加入RNaseA至終濃度為1μg/mL,在37°C下放置30min。再加 入等體積的酪:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提液抽提一次,同樣用化pendorf離屯、機于4°C, 1000化/min離屯、5min; (5)將上清液轉(zhuǎn)至新的離屯、管中,用等體積的氯仿/異戊醇抽提一 次。將水相轉(zhuǎn)至新的離屯、管中,加入1/10體積3mol/L的NaAc(抑5. 2),3倍體積的100% 乙醇后-70°(:放置8~12111111,沉淀0臟;(6)4°(:,10000以111111離屯、10111111。棄去上清液,用 70%乙醇洗涂DNA沉淀兩次;(7)放置于室溫驚干后,加入20μLTE緩沖液溶解DNA后保 存于-20°C用于PCR實驗。
[0006] 上述兩種DNA的提取方法主要存在的缺陷或不足之處為:
[0007] (1)現(xiàn)行方法存在使用大量有毒試劑的問題,比如β-琉基乙醇、異戊醇和飽和 酪,運些試劑均有毒且發(fā)出難聞的氣味,對實驗操作者帶來風險,并且容易污染環(huán)境。
[0008] (2)直接在1. 5血或2血的巧pendorf管中利用槍頭對樣品進行研磨,通常研磨不 充分,容易導致DNA提取失敗,并且不適合大規(guī)模轉(zhuǎn)基因樣品DNA的提取。
[0009] (3)DNA提取率低,難W滿足多項實驗檢測的需要。
[0010] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解,而不應(yīng) 當被視為承認或W任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對現(xiàn)有擬南芥和煙草提取DM的方法的不足,本發(fā)明的目的是提供一種適合于 大規(guī)模轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草DNA的提取方法。 陽012]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0013] 一種轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方法,包括W下步驟:
[0014] (1)先將2%CTAB提取液置于65°C水浴鍋中預熱,在使用前搖勻;
[0015] (2)取轉(zhuǎn)基因煙草或擬南芥葉片l-2g置于研鉢中,向研鉢中加入預熱后的CTAB提 取液2. 4mU再加入l-2g石英砂,將其研磨成勻漿液,得到勻漿液;
[0016] 做吸取1. 0血勻漿液加入到2血離屯、管中,置于65°C水浴比,每20min輕搖1 次;
[0017] (4)待水浴結(jié)束后取出離屯、管,向每管勻漿液中加入0. 6mL氯仿,混勻,然后將離 屯、管在常溫、轉(zhuǎn)速為lOOOOr/min下離屯、8min;
[0018] (5)吸取離屯、管中的上清液0. 7血加入到另一個新的2血離屯、管中,再加入0. 5血 的異丙醇,混勻,于-20°C沉淀20min,在常溫、轉(zhuǎn)速為1000化/min下離屯、8min;
[0019] (6)去除上清,用ImL70%的酒精洗涂沉淀1次,移除酒精,然后在常溫、轉(zhuǎn)速為 100(K)r/min下離屯、Imin,再用移液槍吸取離屯、管中剩余的酒精,在室溫下放置5-lOmin;
[0020] (7)往離屯、管中加入200μL的TE緩沖液溶解沉淀,搖勻,使之溶解完全,所得溶液 即為轉(zhuǎn)基因煙草或擬南芥DNA提取液,將其置于-20°C下保存,備用。 陽021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
[0022] (1)本方案提取液中不用有毒難聞的試劑β-琉基乙醇,并且在提取的過程中也 不用有毒難聞的藥品異戊醇和酪,減少實驗對操作者和環(huán)境的影響。
[0023] (2)樣品研磨采用石英砂巧.4ml提取液+轉(zhuǎn)基因植物葉片共同研磨成勻漿的方 式,可W保證每個樣品研磨充分(加入大體積的提取液體2. 4ml,是為了更好的勻漿,加入 石英砂是為了增加摩擦系數(shù)),并且適合于大批量、大規(guī)模提取轉(zhuǎn)基因植株DNA。
[0024] (3)優(yōu)化實驗步驟,本方案只用氯仿抽提一次即可,不用有毒且難聞的酪和異戊 醇,減少有毒試劑的使用量,降低對環(huán)境的污染。
[00巧](4)研磨后吸取勻漿液1ml,而不是常用方法中的600μ以主要是為了增加樣品的 量,便于提取更多的DNA,每20min輕搖一次,主要是為了讓提取液在水浴過程中與樣品的 充分混勻。 陽0%] (5)加氯仿離屯、后,吸取上清液最多0. 7ml,吸取時盡量遠離中間層,減少蛋白質(zhì) 的污染。
[0027] (6)采用0. 7倍體積的異丙醇在-20°C條件下沉淀DNA,20分鐘即可,可W縮短實 驗操作的時間。
[0028] (7)用酒精洗涂DNA沉淀后,采用再次離屯、Imin的方式將殘留酒精完全離屯、到管 底,利用移液槍將其移除,可W加快DNA沉淀中酒精的揮發(fā),節(jié)省實驗操作時間。
[0029] 做200μL的TE緩沖液溶解沉淀,而不是常規(guī)方法中的20-30μL溶解沉淀,可W 充分溶解DNA。
[0030] (9)本方案提取過程中不用液氮,降低實驗成本。
[0031] (10)本實驗方案中,全部采用常溫離屯、,離屯、速度定為100(K)r/min,降低DM提取 對實驗條件的限制,并有助于能耗的降低。
【附圖說明】 陽03引圖1為本發(fā)明方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖;
[0033] 有關(guān)附圖標記的說明:
[0034] A-提取擬南芥DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖;B-提取煙草DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述,但應(yīng)當理解本發(fā)明的保 護范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0036] 除非另有其它明確表示,否則在整個說明書和權(quán)利要求書中,術(shù)語"包括"或其變 換如"包含"或"包括有"等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分,而并未排除其它 元件或其它組成部分。
[0037] 連施例1:本發(fā)巧轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方法(分別提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草各2 株)
[0038] 1. 1主要試劑:提取液2 % CTAB,lOOmmol/L Tris-肥1 (抑8. 0),1. 4mol/L NaCl, lOmmol/L邸ΤΑ ;其他試劑:異丙醇、氯仿、TE緩沖液。
[0039] 1. 2主要儀器:移液槍、離屯、機、水浴鍋、冰箱、電泳系統(tǒng)、美國quawellQ3000超微 量紫外分光光度計等。
[0040] 1. 3提取方法包括如下步驟:
[0041] (1)先將2%CTAB提取液置于65°C水浴鍋中預熱,在使用前搖勻;
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