一對(duì)特異識(shí)別綿羊krt25基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。該多肽由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由15個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連氨基酸。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊KRT25基因進(jìn)行敲除或修飾，以解析綿羊KRT25基因的功能、構(gòu)建綿羊KRT25基因突變庫(kù)或獲得相關(guān)疾病模型，為綿羊育種及醫(yī)藥研發(fā)服務(wù)。
【專利說(shuō)明】-對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽及其編 碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白是毛囊和皮膚生物學(xué)功能重要的決定因子之一，在一定程度上決定羊毛的 品質(zhì)和產(chǎn)量。內(nèi)根鞘角蛋白基因一般分為酸性的I型角蛋白基因（KRT25, KRT26, KRT27， KRT28)和呈中性或堿性的II型角蛋白基因（KRT71，KRT72, KRT73, KRT74)，它們都在毛囊 內(nèi)根鞘特異性表達(dá)。所編碼的蛋白質(zhì)參與毛囊的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。R〇gers(2004)研究證明 I 型內(nèi)根鞘角蛋白基因 （Rogers GE. Hair follicle differentiation and regulation. International Journal of Developmental Biology, 2004, 48:163-170)在羊的內(nèi)根鞘中 特異性表達(dá)。由此可見，KRT25基因可作為綿羊抗病育種及羊毛細(xì)度育種的一個(gè)重要候選 基因。在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊KRT25基因進(jìn)行敲除或修飾，可解析綿羊KRT25基因的 功能，為綿羊育種及醫(yī)藥研發(fā)服務(wù)。
[0003] 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術(shù)是一個(gè)高效的基因打靶新工具。轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物家族中有一 種蛋白（TALEs)能夠識(shí)別、結(jié)合DNA。TALE與DNA序列特異性結(jié)合主要是由TAL結(jié)構(gòu)內(nèi)34 個(gè)恒定氨基酸序列介導(dǎo)。將TALEs與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域相連接，形成TALENs，從而 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA序列的精確修飾。TALENs是一種異源二聚體分子（兩單位的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到一單位的催化性結(jié)構(gòu)域），能夠切割兩個(gè)相隔較近的序列，從而使得 特異性增強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。 本發(fā)明利用這對(duì)多肽構(gòu)建獲得的一對(duì)重組的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)能夠特異性地 識(shí)別綿羊KRT25基因。本發(fā)明還利用這對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子構(gòu)建獲得的一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活 子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs)，能夠?qū)d羊KRT25基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地靶向修飾。
[0005] 具體地，本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽（命名為特異多肽對(duì)），由多肽甲和多肽乙組 成；所述多肽甲由16個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連氨 基酸；所述多肽乙由15個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連 氨基酸；
[0007] 所述多肽甲中的16個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位 氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第 488-489位氨基酸殘基和第522-523位氨基酸殘基。
[0008] 所述多肽乙中的15個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位 氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基和第 488-489位氨基酸殘基。
[0009] 所述多肽甲具體可如序列表的序列2所示。
[0010] 所述多肽乙具體可如序列表的序列4所示。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一對(duì)DNA分子（命名為特異DNA分子對(duì)），由編碼所述多肽甲的DNA 分子甲和編碼所述多肽乙的DNA分子乙組成。
[0012] 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷 酸和第1564-1569位核苷酸。
[0013] 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的15個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核 苷酸。
[0014] 所述DNA分子甲具體可如序列表的序列1所示。
[0015] 所述DNA分子乙具體可如序列表的序列3所示。
[0016] 本發(fā)明還保護(hù)所述特異多肽對(duì)在特異識(shí)別和靶向修飾綿羊KRT25基因中的應(yīng)用。 所述綿羊KRT25基因，其NCBI GI為57619200。
[0017] 本發(fā)明還保護(hù)所述特異多肽對(duì)在構(gòu)建綿羊KRT25基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。所述綿羊 KRT25 基因，其 NCBI GI 為 57619200。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽對(duì)，并提供了該 多肽對(duì)的編碼基因。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊KRT25基因進(jìn)行敲除或修 飾，以解析綿羊KRT25基因的功能、構(gòu)建綿羊KRT25基因突變庫(kù)或獲得相關(guān)疾病模型，為綿 羊育種及醫(yī)藥研發(fā)服務(wù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為TALENs祀點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果示意圖。
[0020] 圖2為TALEN質(zhì)粒對(duì)（左臂TALEN和右臂TALEN)轉(zhuǎn)染綿羊SEF細(xì)胞72小時(shí)后提 取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測(cè)序結(jié)果（突變序列）。
[0021] 圖3為TALEN質(zhì)粒對(duì)的工作原理示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。以下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
[0023] FastTALE? TALEN快速構(gòu)建試劑盒：上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，Cat No. 1802-030。該試劑盒包含兩個(gè)模塊板：模塊板1包含96個(gè)模塊，每個(gè)模塊識(shí)別連續(xù)的兩 個(gè)堿基；模塊板2包含76個(gè)模塊，其中48個(gè)模塊識(shí)別連續(xù)的兩個(gè)堿基，28個(gè)模塊識(shí)別單個(gè) 堿基。另外，該試劑盒還包括其他組分：溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、感受態(tài)細(xì)胞、 S0C培養(yǎng)基、ddH20 ;TALEN骨架載體，包括左臂骨架和右臂骨架。
[0024] 實(shí)施例1、TALENs質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建
[0025] 1、TALENs 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0026] 米用在線軟件(https://tale-nt. cac. Cornell, edu)設(shè)計(jì)。將綿羊 KRT25 基 因 cDNA序列（NCBI GI為57619200)輸入軟件中，在130-177bp區(qū)域找到靶序列，具體示 意圖如圖1所示。TALENs左臂識(shí)別序列是5 ' -TGCAGCATGCCTGGAA-3 '，右臂識(shí)別序列是 5, -GCTCCCAAAGGCACA-3，。
[0027] 2、TALENs 模塊組裝
[0028] 依照FastTALE? TALEN快速構(gòu)建試劑盒（以下簡(jiǎn)稱"試劑盒"）說(shuō)明書進(jìn)行。具體 步驟如下：
[0029] 1)將左右臂識(shí)別序列分別拆分為9個(gè)模塊，以一個(gè)或兩個(gè)堿基組合為一個(gè)模塊， 依次進(jìn)行標(biāo)記，如首個(gè)標(biāo)記為1，最后一個(gè)標(biāo)記為9,如下所示：
[0030] 左臂 L5:T1 GC2 A3 GC4 AT5 GC6 CT7 GG8 AA9(使用骨架載體 L15)
[0031] 右臂 R5:G1 C2 TC3 CC4 AA5 AG6 GC7 CA8 CA9(使用骨架載體 R11)
[0032] 2)從試劑盒中取出相應(yīng)編號(hào)的9個(gè)模塊，每個(gè)模塊取1. 5微升，并將其加入同一個(gè) PCR管中。
[0033] 3)將溶液1、溶液2從-20°C冰箱取出置于冰盒上，溶液3放置于37°C水浴鍋中溶 解。
[0034] 4)按如下體系加樣，先加入相應(yīng)的TALEN骨架載體（L16或R12)，然后將溶液3、溶 液1、溶液2依次加入步驟2的PCR管中，最后加水補(bǔ)至20微升，短暫離心混勻。
[0035] 連接體系：
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個(gè) TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由15 個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有一個(gè)雙連氨基酸； 所述多肽甲中的16個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第 488-489位氨基酸殘基和第522-523位氨基酸殘基； 所述多肽乙中的15個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基和第 488-489位氨基酸殘基。
2. 如權(quán)利要求1所述的一對(duì)特異識(shí)別綿羊KRT25基因的多肽，其特征在于：所述多肽 甲的氨基酸序列如序列表中的序列2所示；所述多肽乙的氨基酸序列如序列表中的序列4 所示。
3. -對(duì)DNA分子，由編碼權(quán)利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求1 中的所述多肽乙的DNA分子乙組成。
4. 如權(quán)利要求3所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于： 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第 1564-1569位核苷酸； 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的15個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核苷酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲的核苷酸序列如 序列表中的序列1所示，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
6. 權(quán)利要求1所述的一對(duì)多肽在特異識(shí)別和靶向修飾綿羊KRT25基因中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的一對(duì)多肽在構(gòu)建綿羊KRT25基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104250297SQ201410471728
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】柳楠, 李和剛, 趙金山, 劉積鳳, 劉開東, 程明, 賀建寧 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)