專利名稱：羊基因組中被噬菌體φC31整合酶識別的DNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種羊基因組中被噬菌體Φ031整合酶識別的DNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是21世紀發(fā)展最為迅速的生物高新技術(shù)之一，它是通過基因工程技術(shù)將外源基因整合入宿主動物基因組內(nèi)，從而使其得以表達和遺傳的生物技術(shù)。其中， 外源基因轉(zhuǎn)入宿主基因組是其中關(guān)鍵一環(huán)。外源基因轉(zhuǎn)入宿主基因組的方式有兩種，隨機整合和位點特異整合。前者因為其整合位置的不確定性和致癌的潛在危險性，影響了其在轉(zhuǎn)基因動物制備中的實際應(yīng)用。而位點特異性整合，由于其整合位置的明確性和可操作性， 使得其越來越受到人們的青睞。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物中的應(yīng)用中，位點特異性重組系統(tǒng)有很多，已得到應(yīng)用的有Cre\lox P系統(tǒng)，F(xiàn)LP-FRT系統(tǒng)、R-RS系統(tǒng)以及I-Sce I系統(tǒng)，應(yīng)用最多是Cre\lox P系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要首先引入Iox P序列，然后通過一定的途徑激活Cre重組酶的活性，以實現(xiàn)在Iox P位點的特異整合或重組。近來，人們發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌噬菌體中存在一種(tC31整合酶(phiC31integrase)。 該酶可以催化細菌基因組中的attB位點和噬菌體基因組中的attP位點之間的同源重組 (Kuhstoss S. and Rao RN. J. Mol. Biol. 1991,222(4) :897-908)。其中，attB 由稱為 BOB， 的序列組成，而attP由POP’組成。O是核心序列，是attB和attP所共同的。而其兩側(cè)的序列是B、B’和P、P’，被稱為臂。噬菌體DNA是環(huán)狀的，重組時被整合入細菌染色體中，成為線性序列。整合反應(yīng)發(fā)生后，形成兩個新的雜種att位點，左側(cè)稱為attL，由Β0Ρ’組成， 而右側(cè)為attR，由Ρ0Β’組成。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在動物基因組中也存在一些位點，可以在整合酶的介導下，將帶有attB序列的外源基因整合入宿主基因組內(nèi)，這些位點的核心序列與噬菌體基因組中attP位點的核心序列具有一定的同源性，被稱為“假attP位點”。研究表明，相比較傳統(tǒng)的Cre酶或Flp酶，Φ031整合酶介導的外源基因的整合具有三個優(yōu)點一、高效整合；二、無需輔助因子；三、單向整合，不會發(fā)生回復切除。這些優(yōu)點使得Φ031整合酶在生物工程上具有重要的利用價值，被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因動物制備、基因治療、基因組修飾等。目前，已經(jīng)在人、小鼠、大鼠、果蠅和牛的基因組中分離出多個假attP位點，并證明了 Φ031整合酶在這些物種中具有介導外源基因位點特異性整合的作用。在轉(zhuǎn)基因羊的制備中，同源重組和Cre酶系統(tǒng)的應(yīng)用報道較多。而Φ031整合酶系統(tǒng)在山羊基因組內(nèi)的應(yīng)用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的羊細胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)中還沒有成功的使用0C31整合酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不足，提供一種羊(Capra hircus)基因組中被噬菌體Φ031整合酶識別的DNA及其應(yīng)用，以及相應(yīng)的含有該DNA的載體和轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的第一方面是提供一種羊基因組中被噬菌體Φ031整合酶識別的DNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或者SEQ ID NO. 4所示。本發(fā)明的第二方面是提供所述的羊基因組中被噬菌體Φ C31整合酶識別的DNA的應(yīng)用，用于在羊細胞中整合目的基因。本發(fā)明中，所述在羊細胞中整合目的基因的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方法，優(yōu)選的包括以下步驟將含有目的基因和attB位點的載體、和含鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因的載體混合后轉(zhuǎn)染羊細胞，然后篩選陽性克隆細胞株。所述的attB位點的序列為GTGC ACGGCCCACGTGGCCACTAGTACTTCTCGAGGTCGACGATGTAGGTCACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAG GGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCATCATGATGAACGGGTCGAGGTGGCG GTAGTTGATCCCGGCGAACGCGCGGCGCACCGGGAAGCCCTCGCCCTCGAAACCGCTGGGCGCGGTGGTCACGGTGA GCACGGGACGTGCGACGGCGTCGGCGGGTGCGGATACGCGGGGCAGCGTCAGCGGGTTCTCGACGGTCACGGCGGGC ATGTCGACGGTATCGATAAG。所述的含有目的基因和attB位點的載體和含鏈霉菌噬菌體OC31 整合酶基因的載體的質(zhì)量比可以是I : 3 I : 50。所述的轉(zhuǎn)染的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方法，優(yōu)選的采用脂質(zhì)體介導的細胞轉(zhuǎn)染法。本發(fā)明中，所述的羊細胞可以是本領(lǐng)域的常規(guī)羊細胞，優(yōu)選的為小羊耳皮膚成纖維細胞。本發(fā)明的第三方面是提供含有所述的DNA的載體。本發(fā)明的第四方面是提供含有所述的載體的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的第五方面是提供含有所述的DNA的序列的引物。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明首次在羊基因組內(nèi)尋找到4個假attP位點，這4個位點可被鏈霉菌噬菌體Φ C31整合酶識別，因此可以使含attB位點的外源基因在整合酶的介導下以較高的整合率整合到羊基因組中的該位點，從而得到攜帶外源基因的羊細胞，為0C31整合酶系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)制備中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖I是PCR擴增產(chǎn)物進行電泳圖。I :挑選的I號克隆DNA酶切自連產(chǎn)物；22 :挑選的22號克隆DNA酶切自連產(chǎn)物23 :挑選的23號克隆DNA酶切自連產(chǎn)物；B :空白；C1 :未轉(zhuǎn)染的正常羊細胞DNA酶切自連產(chǎn)物；C2 pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒對照；M :lkb Marker (從上到下為:10k、8k、6k、5k、4k、3. 5k、3k、2. 5k、2k、l. 5k、lk、750bp、500bp、250bp)。圖2是PCR產(chǎn)物電泳圖。I :1號克隆細胞DNA ;B :空白；C :未轉(zhuǎn)染的正常羊細胞 DNA;M:100bp Marker (IOObp Marker 從上到下順序為 lk、900bp、800bp、700bp、600bp、 500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp)。
具體實施例方式本發(fā)明通過將含有attB序列及外源基因的質(zhì)粒和含有鏈霉菌噬菌體<tC31整合酶基因的質(zhì)粒，按一定比例混合，轉(zhuǎn)染羊皮膚成纖維細胞，然后篩選陽性克隆株，提取陽性細胞基因組DNA，利用反向PCR技術(shù)，將擴增產(chǎn)物進行測序分析，通過序列比對，尋找羊基因組序列和載體attB序列融合序列，鑒定得到了羊基因組的4個假attP位點。下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。本發(fā)明的實施例中所用到的含有目的基因綠色熒光蛋白和attB位點的質(zhì)粒 pEGFP-Nl-attB以及含鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因的質(zhì)粒pCMVInt的構(gòu)建參考申請?zhí)栁?0051011476. 3的中國發(fā)明專利申請。本實施例中所用的細胞，為上海醫(yī)學遺傳研究所松江科研基地提供的小羊耳皮膚成纖維細胞。實施例I細胞的轉(zhuǎn)染和篩選(I)轉(zhuǎn)染前準備羊耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)。待細胞長至60-70%單層后，棄培養(yǎng)基，用無血清DMEM F12培養(yǎng)液洗2次，在10% FBS (胎牛血清)條件下連續(xù)培養(yǎng)4天。轉(zhuǎn)染前2-3h換培養(yǎng)液一次，以刺激細胞生長。(2)轉(zhuǎn)染液的制備A液各取3 μ g純化后的整合酶質(zhì)粒DNA (質(zhì)粒pCMVInt)和I μ g含EGFP目的基因的質(zhì)粒(質(zhì)粒pEGFP-Nl-attB)，用不含血清DMEM F12培養(yǎng)液定容稀釋到400 μ 1，輕輕混勻，室溫靜置5min。B液10 μ I脂質(zhì)體2000用不含血清DMEM F12培養(yǎng)液定容稀釋到400 μ 1，輕搖混勻，室溫靜置5min。B液加入到A液中，輕輕搖勻，室溫(25°C )靜置20min，即配得Iipo2000/DNA/DMEM F12混合液，備用。(3)轉(zhuǎn)染傾去培養(yǎng)液，用3ml不含血清DMEM F12培養(yǎng)液漂洗細胞二次，傾去培養(yǎng)液。將配制好的Iipo2000/DNA/DMEM F12混合液緩慢加入培養(yǎng)板中，前后搖幾次。使培養(yǎng)液完全覆蓋細胞。37°C，5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)6小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液。用無血清DMEM F12徹底清洗4次，加入2ml含有10% FBS的DMEM F12培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24小時。(4)篩選吸去DMEM F12培養(yǎng)液，加入含有G418 (500ng/ μ I)的DMEMF12培養(yǎng)液， 37°C,5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。實施例2細胞克隆的挑取和DNA的收集(I)選擇培養(yǎng)持續(xù)12天后，顯微鏡下鏡檢，可看到獨立的細胞克隆。對G418抗性細胞，在紫外燈下能夠發(fā)出綠色熒光的細胞克隆進行挑取。吸去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，在顯微鏡下，于細胞克隆處加10 μ I O. 25%的胰酶(胰蛋白酶)溶液，待細胞逐漸變圓后，用移液槍吸取，轉(zhuǎn)移至6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。(2)待細胞長至90%的密度，每孔用Iml胰酶消化細胞。消化后的細胞用PBS清洗2遍,4000gX IOmin離心收集細胞。400 μ I STE(細胞裂解液)吹勻細胞，加蛋白酶K至終濃度為lOOyg/ml，混勻。將裂解細胞的懸液放置于37°C水浴中過夜。將溶液冷卻至室溫，加等體積(400 μ I) O. 5mol/L Tris-HCl (pH 8. O)平衡的苯酚，緩慢輕柔地來回顛倒離心管lOmin，使兩相最終混合。4°C離心5000g，15min。用移液管將上層水相移至一個潔凈離心管中。向水相中加入一半體積(200 μ I) 苯酚和200 μ I氯仿，4°C離心5000g, IOmin0將上層全部的水相移至另一離心管中(I. 5ml離心管)，向其中加入等體積 (400 μ I)的氯仿，4°C離心 5000g,5min。將上層全部的水相移至另一離心管中(I. 5ml離心管)，于室溫加2倍體積 (800 μ I)的無水乙醇，轉(zhuǎn)動離心管使溶液充分混合，室溫靜置15min，4°C離心lOOOOg， lOmin，可見管底膠狀DNA沉淀。70%乙醇清洗DNA, lOOOOg, 5min,棄去液體，自然晾干。100 μ I TE溶解DNA，得每個細胞克隆的DNA溶液。實施例3反向PCR鑒定整合位點(I)斷裂點5’端序列鑒定在載體pEGFP-Nl-attB的attB序列上游200 800bp左右設(shè)計一對反向PCR引物Gl和G2，序列分別為Gl :5，-CTGAACCTGAAACATAA-3，；G2 :5’ -CACCTTGATGCCGTTCTT-3’。取10μ g細胞DNA，用2μ I Hind III酶切，37°C，過夜；酶解反應(yīng)液用酚/氯仿抽提后，無水乙醇沉淀，20μ I TE溶解；溶解后的DNA片段，加入I μ 1T4DNA Ligase，200 μ I體系，16 °C反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物用酚/氯仿抽提、無水乙醇沉淀后，溶于20 μ I 7jC，即模板DNA。PCR 反應(yīng)體系LA Buffer 2. 5μ I ；d NTP mixture 4 μ I ;引物各 I μ I ;模板 DNA I μ I ；LA TaqE O. 25 μ I ；dd H2O 15. 5 μ I ;共 25 μ I。反應(yīng)條件94°C5min, 94°C lmin, 58°C Imin, 72°C 3min, 32cycles,最后，72°C延長 lOmin。將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)果如圖1，其中，大于Ikb的條帶即為包含基因組的擴增條帶。將反向PCR擴增的產(chǎn)物回收，送測序公司測序。測序結(jié)果通過NCBIBLAST與所用的載體pEGFP-Nl-attB序列進行比對。比對顯示，載體中序列恰好在理論上的attB斷裂區(qū)斷裂，斷裂一端為載體序列，一端為基因組序列，表明該位置恰為整合酶識別位點。(2)斷裂點3’端序列鑒定在載體pEGFP-Nl-attB的attB序列下游200bp左右和pEGFP-Nl-attB載體多克隆位點上游400bp左右設(shè)計一對反向PCR引物G3和G42，序列分別為G3 :5， -TCG CCA CCT CTG ACT TGA GC-3，；G4 :5’ -CCG CCT CAG GAC TCT TCC TT-3’。方法同上，PCR擴增，產(chǎn)物測序，分析測序結(jié)果。通過以上對測序結(jié)果的分析，共得到5個假attP位點。通過生物信息學比對，拼接出羊基因組內(nèi)假attP位點的序列，分別是序列表中SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 共 4 個假 attP 位點。實施例4外源基因在羊基因組假attP位點處整合的檢測
I、PCR擴增根據(jù)羊基因組中的I號克隆的“假attP位點”和載體的attB序列， 設(shè)計一對引物上游引物序列IF 為5’ -TCTGCTCCTGATGACATCTG-3’ ；下游引物序列IR 為5’ -CTTGTGAATCTCAACTATAA-3’。PCR 反應(yīng)體系:1XPCR 緩沖溶液，I. 5mM Mg2+，引物各 10 μ M，200 μ MdNTPs，模板 DNA ( “假attP位點”和載體的attB序列整合后的序列)200ng 500ng, 2U ex-Taq DNA聚合酶(Takara公司)。PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 45s, 58。。lmin, 72°C lmin, 32 個循環(huán)；72°C IOmin0上述一對引物分別位于假attP位點的左臂和attB位點的右臂，當該位點的整合發(fā)生時，假attP位點的左臂和attB位點的右臂即連接形成attR，因此可通過PCR檢測，并根據(jù)引物所在位置，可得知發(fā)生整合后PCR產(chǎn)物的大小。根據(jù)理論計算，PCR產(chǎn)物大小應(yīng)為 550bp。2.將PCR產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果如圖2所示，圖2的電泳結(jié)果顯示發(fā)生整合后PCR 產(chǎn)物大小為550bp，與理論大小一致。因此在I號克隆細胞中，外源基因在整合酶介導下整合于小羊耳皮膚成纖維細胞中的假attP位點。
權(quán)利要求
1.一種羊基因組中被噬菌體0C31整合酶識別的DNA，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 或者 SEQ ID NO. 4 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的羊基因組中被噬菌體4C31整合酶識別的DNA的應(yīng)用，其特征在于，用于在羊細胞中整合目的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述在羊細胞中整合目的基因包括以下步驟將含有目的基因和attB位點的載體、和含鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因的載體混合后轉(zhuǎn)染羊細胞，然后篩選陽性克隆細胞株。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)染的方法采用脂質(zhì)體介導的細胞轉(zhuǎn)染法。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的羊細胞為小羊耳皮膚成纖維細胞。
6.含有如權(quán)利要求I所述的DNA的載體。
7.含有如權(quán)利要求6所述的載體的轉(zhuǎn)化子。
8.含有如權(quán)利要求I所述的DNA的序列的引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了羊基因組中被噬菌體φC31整合酶識別的DNA。本發(fā)明從羊基因組中分離了4個假attP位點，進而能夠?qū)ⅵ誄31整合酶系統(tǒng)應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)制備中，使外源目的基因高效整合于羊基因組中并高效表達。
文檔編號C12N5/10GK102604936SQ20111002439
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者曾溢滔, 馬海燕, 黃淑幀 申請人:上海市兒童醫(yī)院, 上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司