突變的噬菌體裂解基因e、含有該裂解基因的裂解質(zhì)粒載體和在制備菌影疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了突變的噬菌體裂解基因E、含有該裂解基因的裂解質(zhì)粒載體和在制備菌影疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種突變噬菌體裂解基因E（Eprom）是通過將噬菌體phiX174的裂解基因E的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行突變后獲得的，突變后的E基因使得培養(yǎng)菌的溫度從現(xiàn)有的28℃變成37℃，而且具有更高的裂解效率、更高的起始誘導(dǎo)濃度和規(guī)?；a(chǎn)能力，發(fā)酵罐培養(yǎng)裂解效率高達(dá)99.99997%。將Eprom與pBV220連接后即得高效裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom。將pBV-Eprom轉(zhuǎn)化到胸膜肺炎放線桿菌中，誘導(dǎo)Eprom基因表達(dá)，得到胸膜肺炎放線桿菌菌影。本發(fā)明的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保護(hù)效力，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，且能夠?qū)Σ煌逍偷男啬し窝追啪€桿菌強(qiáng)毒株的攻擊提供良好的交叉免疫保護(hù)。
【專利說明】突變的噬菌體裂解基因E、含有該裂解基因的裂解質(zhì)粒載體和在制備菌影疫苗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及噬菌體裂解基因E在制備疫苗中的應(yīng)用，尤其涉及一種突變的噬菌體裂解基因E，本發(fā)明還涉及含有該基因的裂解載體以及該裂解載體在制備菌影疫苗，特別是豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗中的用途，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌菌影(Bacterial ghost)是一種沒有細(xì)胞漿和核酸的空細(xì)菌體。將PhiX174噬菌體E裂解基因在細(xì)菌中表達(dá)，該基因編碼蛋白在細(xì)菌細(xì)胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在滲透壓的作用下使菌體破裂，細(xì)菌胞內(nèi)細(xì)胞漿和核酸成分通過此隧道被排出，形成一種空的細(xì)菌外殼，即為“細(xì)菌菌影”。細(xì)菌菌影是由內(nèi)膜(cytoplasmic membrane),胞衆(zhòng)間隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)組成，因此細(xì)胞壁在很大程度上被完整保存下來。在有些菌株的外膜上還有一層S-layer，也成為細(xì)菌菌影的成分之一。細(xì)菌菌影本身可作為一種很好的疫苗，因?yàn)檫@種形式保留了和活菌一樣的細(xì)菌胞膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體識(shí)別的高度保守結(jié)構(gòu)PAMP (pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖,妝聚糖，CPG, OmpA,菌毛等，能有效地被DC和巨噬細(xì)胞所吞噬。目前，菌影通過靜脈、皮下、氣體等途徑免疫已經(jīng)在小鼠、兔子、豬等動(dòng)物模型中取得了良好的免疫保護(hù)效果?；魜y菌菌影(VCG)經(jīng)皮下注射小鼠誘導(dǎo)血清產(chǎn)生高水平的抗霍亂特異性IgG抗體。同時(shí)顯示，針對(duì)VCG的抗體足以保護(hù)新生小鼠免遭霍亂弧菌的感染。另外，細(xì)菌菌影還可以用作一種極好的遞送系統(tǒng)，通過在細(xì)菌裂解之前對(duì)細(xì)菌進(jìn)行外膜的人工改造，將外來抗原，核酸或藥物等其它成分錨定于胞膜的內(nèi)、外側(cè)，或充于胞漿周質(zhì)。這樣制備的重組菌影擁有完好的，天然的細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)，能同時(shí)激發(fā)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。其菌毛等表面黏附結(jié)構(gòu)，又使之能靶向黏附在特異性的組織，如胃腸道和呼吸道的黏膜表面，進(jìn)而較易被機(jī)體吞噬細(xì)胞，如PP結(jié)(Peyer’ s Patches)的M細(xì)胞所識(shí)別捕獲，故而可有效遞送疫苗抗原至黏膜表面和誘發(fā)相關(guān)黏膜免疫應(yīng)答。Eko等人將沙眼衣原體(C.trachomatis)抗原在霍亂菌的內(nèi)膜表達(dá),然后裂解制備的重組菌影(VCG)有效地激發(fā)了生殖道黏膜的Thl型免疫應(yīng)答，現(xiàn)在正在著手進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。與傳統(tǒng)的原核系統(tǒng)表達(dá)蛋白相比，重組細(xì)菌菌影有幾大優(yōu)勢(shì):(I)重組蛋白被整合在一個(gè)具有高度免疫原性的環(huán)境中；(2)對(duì)蛋白的大小要求范圍寬泛，但蛋白的分子量最好在2000到200，OOODa之間；(3)重組蛋白被直接表達(dá)后整合到細(xì)菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫動(dòng)物，而不必要象以前制備免疫原時(shí)要先分離純化重組蛋白；(4)整合在細(xì)胞壁的重組蛋白是以天然的構(gòu)象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重組的蛋白通過原核系統(tǒng)大都以包涵體的形式表達(dá)，只能通過變性、復(fù)性的方法在一定程度上恢復(fù)蛋白活性。(5)菌影的制備相對(duì)簡(jiǎn)單，可用發(fā)酵技術(shù)獲得，而不需進(jìn)行復(fù)雜的純化工作；可以凍干的形式貯存于室溫。[0003]裂解基因E的表達(dá)可在λ pL/pR-cI857或在IacPO-1acIq啟動(dòng)阻遏系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄控制下完成。一些含有不同抗性標(biāo)記、復(fù)制起始區(qū)和基因E表達(dá)控制的特異性裂解質(zhì)粒已經(jīng)被構(gòu)建出來。λ PR啟動(dòng)子和溫敏阻遏物cI857在30°C以下能抑制基因E的表達(dá)，高于30°C會(huì)導(dǎo)致阻遏物CI857熱滅活而誘導(dǎo)E基因表達(dá)。為了制備菌影，細(xì)菌須在28°C條件下生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后升溫到42°C誘導(dǎo)其裂解。
[0004]E蛋白介導(dǎo)的裂解已經(jīng)成功地應(yīng)用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌、支氣管敗血博德特氏桿菌、幽門螺旋桿菌、霍亂弧菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌等。范圍如此之大說明了只要E基因裂解盒被引入到適當(dāng)?shù)妮d體中，E蛋白介導(dǎo)的裂解可能會(huì)在每個(gè)革蘭氏陰性菌中發(fā)生。[0005]目前，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的制備細(xì)菌菌影的裂解質(zhì)粒載體系統(tǒng)都是在上述28°C條件下培養(yǎng)增殖細(xì)菌，然后再升溫到42°C誘導(dǎo)E基因的表達(dá)制備細(xì)菌的菌影。但是，大多數(shù)細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)溫度都是37°C，28°C條件下培養(yǎng)使得很多細(xì)菌的生長(zhǎng)速度大大下降，而且不利于天然表面抗原的形成，影響疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。本發(fā)明將E基因的啟動(dòng)區(qū)突變后不但使得初始培養(yǎng)溫度從28°C提高到37°C，克服了菌影制備速度慢和免疫原性差的缺陷，而且裂解效率也提高了 I-2個(gè)數(shù)量級(jí)。更為關(guān)鍵的是，基于突變后的E基因Eprom構(gòu)建的裂解載體PBV-Eprom能夠利用發(fā)酵罐大量地制備胸膜肺炎放線桿菌的菌影，使規(guī)?；a(chǎn)成為可能，而該方面并未見相關(guān)的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的經(jīng)過突變的噬菌體裂解基因E。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一種含有上述突變噬菌體裂解基因的裂解載體。
[0008]本發(fā)明的目的之三是將上述裂解載體應(yīng)用于制備菌影疫苗。
[0009]本發(fā)明的目的之四是提供一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法以及由該方法獲得的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0010]本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0011]本發(fā)明利用基因突變技術(shù)，對(duì)PhiX174噬菌體裂解基因E以及上游的調(diào)控基因進(jìn)行隨機(jī)突變，使啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生基因突變，突變后的Eprom基因能使E基因的CI857抑制子在更高的溫度抑制E基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得培養(yǎng)溫度從現(xiàn)有的裂解質(zhì)粒載體的28°C變成突變后的37°C，而且具有更高的裂解效率和規(guī)模化生產(chǎn)能力。
[0012]本發(fā)明的一種突變的噬菌體裂解基因E，命名為Ερι.οπι，其核苷酸序列為SEQ IDNO:1所示。
[0013]將本發(fā)明突變噬菌體裂解基因與原核表達(dá)載體相連接后，即得到裂解載體；作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，例如，可以將序列SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列與pBV220載體相連接，可得到一種高效裂解載體pBV-Eprom ;經(jīng)檢測(cè)，pBV-Eprom的裂解效率可高達(dá)99.99997%。
[0014]因此，本發(fā)明提出了所述的突變的噬菌體裂解基因E在制備菌影疫苗中的應(yīng)用。
[0015]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括:
[0016](I)構(gòu)建含有本發(fā)明所述的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體；
[0017](2)將該裂解載體轉(zhuǎn)化到胸膜肺炎放線桿菌中，得到含有裂解載體的胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子；
[0018](3)將該胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0019](4)誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)，收集形成的菌影，得到豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0020]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的裂解載體是通過將SEQ ID NO:1所示的序列克隆入PBV220載體中得到的。
[0021]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中該胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子在37°C進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
[0022]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中在42°C溫度條件下誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)。
[0023]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中當(dāng)胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子濃度為0D_等于0.8時(shí)開始升溫誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)。
[0024]再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了由以上所述的方法制備得到的豬傳染性胸膜肺炎菌
影疫苗。及
[0025]所述的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗在制備防治豬傳染性胸膜肺炎藥物中的應(yīng)用。
[0026]相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0027]1、本發(fā)明通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變后的Eprom基因可以使E基因的CI857抑制子在更高的溫度抑制E基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得培養(yǎng)溫度從現(xiàn)有的裂解質(zhì)粒載體的28°C變成突變后的37°C，而且具有更高的裂解效率(高達(dá)99.99997%，比突變前高I-2個(gè)數(shù)量級(jí))、更高的起始誘導(dǎo)濃度(從突變前的OD6tltl0.4變?yōu)橥蛔兒蟮腛D6tltl0.8)和規(guī)?；a(chǎn)能力(可以利用發(fā)酵罐批量制備胸膜肺炎放線桿菌菌影)。
[0028]2、安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性，接種后的豬只無任何不良反應(yīng)。
[0029]3、免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，接種本發(fā)明豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗后，可顯著刺激免疫豬產(chǎn)生高滴度的抗體，并能有效保護(hù)各免疫豬抵抗不同血清型胸膜肺炎放線桿菌強(qiáng)毒株的攻擊，說明本發(fā)明豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的交叉免疫保護(hù)效果。而且相較于常規(guī)滅活苗和經(jīng)28°C誘導(dǎo)表達(dá)的菌影疫苗，本發(fā)明的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗具有更高的免疫原性和免疫保護(hù)效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為突變的噬菌體裂解基因E (Eprom)的構(gòu)建示意圖；
[0031]圖2為發(fā)酵罐規(guī)?；苽湫啬し窝追啪€桿菌CVCC265株菌影的裂解曲線；
[0032]圖3為胸膜肺炎放線桿菌菌影(ghost)的透射電鏡觀察結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。[0034]試驗(yàn)材料
[0035]菌株及質(zhì)粒
[0036]大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于弘博生物技術(shù)有限公司，噬菌體PhiX174購(gòu)于Promega (北京)生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒pBV220的構(gòu)建過程可按照以下文獻(xiàn)構(gòu)建:張智清，姚立紅，侯云德，含PrPl啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用，病毒學(xué)報(bào)，1990，6（2），111-116。
[0037]胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株購(gòu)買自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。
[0038]實(shí)施例1突變的噬菌體裂解基因的克隆
[0039]根據(jù)GenBank中噬菌體PhiX174裂解基因E的編碼序列設(shè)計(jì)引物:
[0040]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0041]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0042]上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I，由哈爾濱博仕合成。以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴(kuò)增裂解基因E =PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，其中 MgSO4 2mM，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U(TaKaRa)，模板 DNA 10ng。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C308，30個(gè)循環(huán)，721: 5min。PCR擴(kuò)增后的E基因經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用DNA酶對(duì)E基因進(jìn)行酶切，回收10-50bp的DNA片段。取I μ I回收后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μ L:10x Taq buffer，Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 DNA10ng。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s, 42。。30s, 72。。30s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C5min。電泳結(jié)果為小于276bp的smear。
[0043]以特異性的引物L(fēng)ysis E_U和Lysis E_L對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，其中MgSO4 2mM，上、下游引物各I μ M，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer,Taq?DNA 聚合酶 2U( TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C 預(yù)變性 5min，94°C 30s, 59°C30s, 72°C 308，30個(gè)循環(huán)，721: 5min。獲得含有突變的噬菌體裂解基因E的擴(kuò)增產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收。突變的噬菌體裂解基因E的擴(kuò)增過程見附圖1。
[0044]實(shí)施例2裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom的構(gòu)建及培養(yǎng)條件的篩選
[0045]將實(shí)施例1所克隆的裂解基因E純化后用EcoR I/BamH I雙酶切，用T4 DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16°C過夜連接并熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，得到裂解載體。
[0046]選取20個(gè)含裂解載體的大腸桿菌TGl的菌落，分別接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB中，37°C過夜震蕩培養(yǎng)(220r/min)，然后轉(zhuǎn)接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)0.4左右。此時(shí)將溫度迅速升高到42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(shí)，肉眼觀察裂解效率?？梢杂^察到不同的試驗(yàn)結(jié)果，有的試管在37°C過夜培養(yǎng)時(shí)即呈現(xiàn)裂解現(xiàn)象，菌液較稀薄，并可見少量細(xì)菌碎片，轉(zhuǎn)接后37°C培養(yǎng)也呈現(xiàn)裂解現(xiàn)象，0D_值無法達(dá)到0.4 ;有的試管37°C過夜培養(yǎng)裂解效果不明顯，但轉(zhuǎn)接后繼續(xù)37°C培養(yǎng)卻呈現(xiàn)明顯的裂解現(xiàn)象，也無法使0D_值達(dá)到0.4 ;只有I個(gè)試管得到了想要的結(jié)果，即37°C過夜培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接后繼續(xù)37°C培養(yǎng)均未呈現(xiàn)出裂解現(xiàn)象，OD600達(dá)0.4時(shí)溫度升高到42°C并誘導(dǎo)4-5小時(shí)后卻呈現(xiàn)出明顯的裂解現(xiàn)象，菌液澄清透明并可見大量的菌體碎片。將37°C培養(yǎng)裂解的菌液和不裂解的菌液分別進(jìn)行質(zhì)粒提取和突變E基因的序列測(cè)定，分析比較不同培養(yǎng)條件下裂解質(zhì)粒中突變E基因的變異情況，并獲得了在37°C條件下培養(yǎng)不裂解的質(zhì)粒載體。對(duì)該質(zhì)粒載體進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，裂解基因E的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了突變，突變后的E基因命名為Ερι.οπι，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，含有EpiOm的裂解載體命名為pBV-Eprom。
[0047]實(shí)施例3含裂解載體pBV-Eprom的重組胸膜肺炎放線桿菌的構(gòu)建
[0048]1、構(gòu)建含有SEQ ID NO:1所示的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體；
[0049](I)合成SEQ ID NO:1所示的突變的噬菌體裂解基因E的序列；
[0050](2)設(shè)計(jì)引物:
[0051]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0052]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0053]以特異性的引物L(fēng)ysis E-U和Lysis E-L對(duì)上述合成的突變的噬菌體裂解基因E的序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，其中MgSO4 2mM,上、下游引物各I μ Μ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)，72°C 5min。獲得突變的噬菌體裂解基因E的擴(kuò)增產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收。
[0054](3)將純化后的突變的噬菌體裂解基因E的擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoR I/BamH I雙酶切，用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16°C過夜連接并熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定無誤后，得到裂解載體pBV-Eprom。
[0055]對(duì)于pBV-Eprom的構(gòu)建屬于本領(lǐng)域的常規(guī)操作，以上方法只是其中一種可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可有多種選擇。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以按照實(shí)施例I和實(shí)施例2的方法構(gòu)建得到裂解載體pBV-Eprom。即使得到的載體序列與本發(fā)明的不同，也可以通過定點(diǎn)突變的方法得到與本案記載的Eprom序列完全相同的載體，而在此過程中不需要付出任何的創(chuàng)造性勞動(dòng)。
[0056]2、將裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom及突變前的pBV_E (裂解基因選擇未突變的E基因，其余構(gòu)建過程與pBV-Eprom相同)分別電擊轉(zhuǎn)化到胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株(氨節(jié)青霉素敏感株)中，電穿孔儀(Micro-pulser, Bio-Rad, USA)的電擊參數(shù)為:12.5kV/cm、200 Ω、25 μ f、5.2ms。
[0057]3、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR進(jìn)行鑒定。
[0058]4、選取含裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom以及pBV_E的胸膜肺炎放線桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落，分別接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，均放置于28°C和37°C過夜震蕩培養(yǎng)(220r/min)，然后轉(zhuǎn)接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，繼續(xù)在28°C或37°C下震蕩培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)到0.4左右。將培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)Eprom和E基因的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(shí)，肉眼觀察裂解效果。試驗(yàn)結(jié)果與大腸桿菌裂解結(jié)果類似，轉(zhuǎn)化pBV-E的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株可以在28°C培養(yǎng)和42°C誘導(dǎo)條件下裂解獲得胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株的菌影；但在37°C培養(yǎng)時(shí)即出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，無法使0D_值達(dá)到0.4，而轉(zhuǎn)化pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株在28°C和37°C培養(yǎng)時(shí)都不出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，只有升溫到42°C才出現(xiàn)裂解現(xiàn)象。[0059]實(shí)施例4裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom裂解效果與胸膜肺炎放線桿菌OD值的關(guān)系
[0060]選取實(shí)施例3中構(gòu)建的含裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落，接種在5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C過夜震蕩培養(yǎng)(220r/min)，然后轉(zhuǎn)接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D6(I(I值達(dá)到0.4、0.6、0.8和1.0左右。取出100 μ L培養(yǎng)物備用，將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42 °C培養(yǎng)以誘導(dǎo)Eprom的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4_5小時(shí)。取誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)物各100 μ I適當(dāng)稀釋后涂TSA瓊脂平板(含10 μ g/mL NAD)進(jìn)行活菌CFU檢測(cè)。觀察發(fā)現(xiàn)，在不同OD6tltl值的情況下，Eprom基因具有很高的裂解效果，即使在0D_值為0.8的情況下開始誘導(dǎo)，也表現(xiàn)出很高的裂解效果(99.99997%，比突變前高I-2個(gè)數(shù)量級(jí))，菌液清澈透明并可見明顯的細(xì)胞碎片。結(jié)果表明，突變后的裂解質(zhì)粒載體PBV-Eprom的裂解效率并不受細(xì)菌OD值的影響，即使在OD值高達(dá)0.8時(shí)開始誘導(dǎo)也仍然能夠進(jìn)行有效的裂解，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)外報(bào)道的細(xì)菌OD值須維持在0.4的水平，為大規(guī)模制備細(xì)菌菌影和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了現(xiàn)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0061]實(shí)施例5發(fā)酵罐大量制備胸膜肺炎放線桿菌菌影
[0062]將含有裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株接種到5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37 °C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右(220r/min)，然后轉(zhuǎn)接l-2mL于IOOmL含50 μ g/mL氨芐青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37°C過夜震蕩培養(yǎng)。次日，將所有IOOmL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含IOOOOmLTSB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL氨芐青霉素和10yg/mL NAD)的發(fā)酵罐中，37°C震蕩培養(yǎng)(220r/min)。發(fā)酵罐設(shè)置參數(shù)為ρΗ7.14-7.18 ；ρ02 40%, Airflow 1.35L/min。當(dāng) OD600 達(dá) 0.8 時(shí)迅速升溫到 42°C條件下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4-5小時(shí)。從開始誘導(dǎo)時(shí)每隔30分鐘取ImL樣品測(cè)0D_值，用于繪制裂解曲線。結(jié)果表明，升溫誘導(dǎo)后0D_值有短暫的升高，至I小時(shí)時(shí)達(dá)到頂峰1.015，之后迅速下降，并在誘導(dǎo)3小時(shí)時(shí)達(dá)到最低值0.315，之后一直維持這一水平。發(fā)酵罐規(guī)模化制備胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影的裂解曲線見附圖2。收獲的胸膜肺炎放線桿菌菌影。另外，取誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)物各100 μ I適當(dāng)稀釋后涂TSA瓊脂平板(含10 μ g/mL NAD)進(jìn)行活菌CFU檢測(cè)。裂解效率檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)物從誘導(dǎo)前的5xl08CFU/ml下降到誘導(dǎo)后的2.6xl03CFU/ml，裂解效率高達(dá)99.99997%。結(jié)果表明，突變后的裂解質(zhì)粒載體pBV-Eprom可以利用發(fā)酵罐大規(guī)模的制備胸膜肺炎放線桿菌的菌影，完全滿足實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0063]實(shí)施例6豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的制備
[0064]將實(shí)施例5中收獲的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影用PBS洗滌3次，凍干保存，并對(duì)凍干后的菌影進(jìn)行活菌CFU檢測(cè)。沒有活菌殘留的胸膜肺炎放線桿菌菌影可以直接用作豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0065]將本實(shí)施例中制備的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影用PBS適量稀釋后，以
2.5%的戊二醛固定菌影，置4°C條件下固定2小時(shí)，PBS洗滌3次，離心后經(jīng)四氧化鋨再固定、乙醇逐級(jí)脫水、包埋劑包埋等步驟處理后進(jìn)行透射電鏡觀察。電鏡觀察結(jié)果見附圖3。
[0066]試驗(yàn)例I豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的安全性試驗(yàn)
[0067]1.豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗對(duì)仔豬的安全性試驗(yàn)
[0068]選取15頭4-6周齡的胸膜肺炎放線桿菌血清陰性的健康仔豬，隨即分為3組，每組5頭。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別肌肉注射ImL不同濃度的實(shí)施例6制備的胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株菌影疫苗，分別為5xl0lclCFU/mL、5xl09CFU/mL和5xl08CFU/mL。接種后每天觀察試驗(yàn)豬的食欲、精神狀態(tài)、體溫等；接種后14天剖殺所有試驗(yàn)豬，取心、肝、脾、肺、腎等各臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。試驗(yàn)結(jié)果見表I。
[0069]表I豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗對(duì)仔豬的安全性試驗(yàn)
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種突變的噬菌體裂解基因E，命名為EpiOm,其特征在于:所述的突變的噬菌體裂解基因E的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。
2.一種裂解載體，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因Ε，優(yōu)選的，所述的裂解載體是通過將SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列與pBV220載體相連接得到的。
3.權(quán)利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因E在制備菌影疫苗中的應(yīng)用。
4.一種制備豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括: (1)構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述的突變的噬菌體裂解基因E的裂解載體； (2)將該裂解載體轉(zhuǎn)化到胸膜肺炎放線桿菌中，得到含有裂解載體的胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子； (3)將該胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增殖培養(yǎng)； (4)誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)，收集形成的菌影，得到豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述的裂解載體是通過將SEQID Ν0:1所示的序列克隆入PBV220載體中得到的。
6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(3)中該胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子在37 °C進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(4)中在42°C溫度條件下誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)。
8.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(4)中當(dāng)胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)化子濃度為OD6tltl等于0.8時(shí)開始升溫誘導(dǎo)突變噬菌體裂解基因E的表達(dá)。
9.由權(quán)利要求4-8任何一項(xiàng)所述的方法制備得到的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗。
10.權(quán)利要求9所述的豬傳染性胸膜肺炎菌影疫苗在制備防治豬傳染性胸膜肺炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103451195SQ201310409238
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】王春來, 李剛, 謝芳, 張艷禾 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所