專利名稱：A25噬菌體溶解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從噬菌體A25上分離的一種新的蛋白和核酸，及這些蛋白和核酸的診斷和治療用途，也涉及它們作為藥物組分治療鏈球菌感染的用途。這個(gè)發(fā)明也涉及從噬菌體A25鑒定、分離和克隆特定基因，特別是噬菌體A25細(xì)胞裂解酶，稱為PlyA，涉及使用這個(gè)基因和基因產(chǎn)品幫助診斷A組鏈球菌感染，及對預(yù)防A組鏈球菌感染的藥物和治療作用。
背景技術(shù)：
化膿性鏈球菌為革蘭氏陽性A族鏈球菌屬細(xì)菌，人類幾種疾病的病原菌，包括咽炎和/或扁桃體炎，皮膚感染(膿皰病，丹毒，膿皮病等形式)，急性風(fēng)濕熱(ARF)，鏈球菌感染后腎小球腎炎(PSGN)，猩紅熱(SF)和中毒性休克綜合征(TSLS)。急性風(fēng)濕熱是全球引起小兒心臟病的最常見的病因。例如，據(jù)估計(jì)，在印度，超過600萬學(xué)齡兒童患有風(fēng)濕性心臟瓣膜病。在美國，“喉嚨痛”是 第三大常見病，其中大約30%是由兒童化膿性鏈球菌引起。在美國每年大約有1-2億美元的醫(yī)療費(fèi)用用于治療約25-35百萬例鏈球菌咽炎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到噬菌體A25核酸和蛋白序列的分離和說明，以及使用該核酸和蛋白序列的診斷和治療作用，特別是對A組鏈球菌。此外，根據(jù)已確定一個(gè)開放讀碼框推導(dǎo)出一個(gè)多肽。利用現(xiàn)有的序列數(shù)據(jù)手段，分離的PlyA細(xì)胞裂解酶的裂解作為開展診斷和治療用途。因此，一方面，本發(fā)明提供噬菌體A25全長核酸序列的分離方法和序列說明，如SEQ ID N0:1。發(fā)明的第二個(gè)部分為噬菌體A25多肽全長序列的分離方法和序列說明，如SEQ ID N0:2。下面對序列診斷和治療效用做詳細(xì)的說明和描述。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了致病性鏈球菌感染的診斷方法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，含有A組鏈球菌細(xì)胞的臨床樣品與本發(fā)明所述的PlyA多肽進(jìn)行預(yù)處理。如果樣品中存在的A組鏈球菌細(xì)胞，預(yù)處理臨床樣品可以使抗體檢測到裂解酶裂解的組分。一種診斷致病性鏈球菌感染的方法，可包括:a)提供可能含有鏈球菌的患者樣品；b)讓樣品與PlyA多肽接觸；和c)檢測樣品中的A組鏈球菌分析物；其中，如果在待測樣品中存在A組鏈球菌分析物，表明主體受鏈球菌感染。一個(gè)實(shí)施方式中，PlyA多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:2的序列相似性大于80%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，PlyA多肽包括SEQID NO:2。本發(fā)明可能用到的診斷測試方式，包括酶聯(lián)免疫吸附檢測，橫向流動檢測，或放射免疫法。在這些方式中，可以直接利用PlyA蛋白和/或針對鏈球菌抗原制備抗體，并按照試劑盒說明來測試病人樣品中是否存在致病性鏈球菌。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或放射免疫法的方法對本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是熟知的。PlyA可直接用于檢測臨床樣品中的A組鏈球菌細(xì)胞。例如，一個(gè)PlyA的結(jié)合域被標(biāo)記，用本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員熟知的如化學(xué)熒光或蛋白質(zhì)標(biāo)記，然后被標(biāo)記的PlyA直接與從主體分離的可能含有致病鏈球菌的樣品共培養(yǎng)。觀察到樣品中的結(jié)合標(biāo)記物，如熒光，表明主體受到致病性鏈球菌的感染。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了 PlyA在活性測定中的作用如熒光素-熒光素酶檢測，以幫助診斷致病性鏈球菌感染。在這樣一個(gè)測定方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品直接與PlyA —起培養(yǎng)。如果樣品中含有的致病性鏈球菌，PlyA將與細(xì)菌結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌的裂解，隨后釋放通常存在與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的ATP或其他組件，如酶。然后裂解液用熒光素-熒光素酶檢測。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品可直接添加到具有熒光素-熒光素酶的PlyA中,加熒光素-熒光素酶前無需收集細(xì)胞裂解液。如果是樣品中存在致病性鏈球菌，裂解的細(xì)菌細(xì)胞釋放的ATP會引發(fā)熒光素-熒光素酶系統(tǒng)的陽性反應(yīng)，從而在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生可檢測的光。可以知道，PlyA也可以作為處理或預(yù)防細(xì)菌感染的用途，這種用途包括施加PlyA的治療有效劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，PlyA作為一個(gè)藥物組分與適宜的藥學(xué)載體用于治療細(xì)菌感染，包括致病性A組鏈球菌感染。包含PlyA的藥物組分能治療哺乳類動物的鏈球菌感染，包括但不限于人類。一個(gè)實(shí)施方式提供了用藥物組分治療鏈球菌咽炎和其他A組鏈球菌疾病的用途。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了本發(fā)明在制備治療細(xì)菌感染藥物過程中所需的多肽的用途，即，噬菌體A25 PlyA裂解酶，包括有生物活性PlyA片段，突變，變種，類似物或衍生物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供本發(fā)明中多肽，即，噬菌體A25 PlyA裂解酶，包括片段，突變，變種，類似物或衍生物的用途，用于制備治療鏈球菌感染的藥劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于制備特異的PlyA抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體是PlyA或亞基或片段的特異單克隆抗體。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗體是多克隆抗體，來自小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，綿羊，馬，豬，牛，或任何本領(lǐng)域常用的其他制備多克隆抗體的哺乳動物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體可以是嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體或片段。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中一個(gè)持續(xù)繁殖細(xì)胞系產(chǎn)生一種PlyA或亞基或片段特異的單克隆抗體。本發(fā)明提供的進(jìn)一步實(shí)施方式中用PlyA或片段的抗體，或用抗體來制備PlyA或片段，標(biāo)記抗體(如熒光或其他已知的熒光蛋白質(zhì)或化學(xué)品)，耦合到噬菌體蛋白質(zhì)，用于監(jiān)測與病人樣品中的細(xì)菌的特定蛋白結(jié)合，幫助檢測致病性鏈球菌。PlyA蛋白可直接被熒光標(biāo)記，用于檢測病人樣品中存在的致病性鏈球菌。本發(fā)明的另一個(gè)部 分提供了預(yù)防或治療細(xì)菌感染的方法，包括施加藥物治療有效劑量，藥品的有效成分包含一定量的具有治療效果的PlyA，其序列如SEQ IDNO:2所示。本發(fā)明的另一個(gè)部分提供的藥物組分，包括如SEQ IDNO:2所示有效劑量的PlyA和適宜的藥學(xué)載體。一個(gè)具體實(shí)施方式
中，包括設(shè)計(jì)治療A組鏈球菌感染的藥物組分。另一個(gè)實(shí)施方式中設(shè)計(jì)的藥物組分用于治療局部或全身性，或其他抗生素類藥物無效的感染。一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中也指出本發(fā)明所述的藥物組分也可以作為獸藥。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是用于治療哺乳動物感染，包括但不限于人類。另一個(gè)實(shí)施方式為用本發(fā)明所述的組分包含本發(fā)明中的多肽，即A25噬菌體PlyA裂解酶，包括片段，突變，變種，類似物或衍生物組成，用來凈化老化的表面，消除可能由A組鏈球菌引起的污染。結(jié)合下面的附圖進(jìn)行詳細(xì)說明，能使本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)更加明顯。


圖1為A25細(xì)胞裂解酶(PlyA) DNA序列和其“推導(dǎo)出”的蛋白質(zhì)序列。圖2鏈球菌噬菌體中細(xì)胞裂解酶PlyA序列(SEQ ID NO:2)與以前披露的細(xì)胞裂解酶的比較圖。SEQ ID NO:2和此前披露(YP_950557.1，公認(rèn)的細(xì)胞裂解酶(鏈球菌噬菌體SMP))的細(xì)胞裂解酶的序列同源性為80.5% (387/481)。圖3(a)組氨酸標(biāo)記PlyA重組蛋白純化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。在大腸桿菌(一種還原酶缺陷型宿主菌XE.coli Origami DE3 (emd bioscience)里表達(dá)后,經(jīng)過組氨酸標(biāo)記的PlyA在鎳-NTA親和層析柱(Qiagen)純化，然后通過濃縮和變性后，在4_20%SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。該片段通過分析DNA序列可以預(yù)測為52.5KD。圖3 (b)為GAS噬菌體A25中的PlyA和PlyC細(xì)胞裂解酶活性測定比較分析圖。和PlyC的活性分析比較。在8個(gè)小時(shí)培養(yǎng)后，指數(shù)生長后，19615號化膿性鏈球菌被溶解在KE緩沖溶液(0.1M KPO4, 5mM EDTA, pH 6.7)中，然后被放置在酶標(biāo)孔中。把經(jīng)過鎳-NTA親和層析柱(Qiagen)純化的PlyA和PlyC稀釋在KE緩沖溶液中(0.1M KPO4, 5mM EDTA, 3mMBME, pH6.7)，然后再加入到包括有化膿性鏈球菌底物作為指示試劑的酶標(biāo)孔中。然后，每間隔6分鐘，通過分析底物的混濁度減少來分析PlyA和PlyC的活性.其中底物為在8個(gè)小時(shí)培養(yǎng)后，指數(shù)生長后，被KE緩沖溶液(0.1M KPO4, 5mM EDTA, pH 6.7)清洗的19615號化膿性鏈球菌，每孔200微升(λ /孔)。樣品是溶解在KE緩沖溶液，為每孔10微升(λ /孔)。

圖4噬菌體Α25的DNA基因序列圖5噬菌體Α25的蛋白序列圖6顯示了一個(gè)橫向流動裝置，其中rPlyA處理A組鏈球菌，使其釋放完整的A組抗原，啟動橫向流動裝置中的特異的A組抗原檢測。詳細(xì)描述本發(fā)明涉及A25噬菌體細(xì)胞裂解酶基因的鑒定，測序和分離，A25噬菌體細(xì)胞裂解酶基因是在噬菌體生命周期時(shí)細(xì)菌細(xì)胞裂解過程中所需的一個(gè)蛋白。本發(fā)明還涉及細(xì)胞裂解酶溶解某種細(xì)菌的方法，這在診斷過程中可用來檢測這些細(xì)菌。此處所述的實(shí)施方式是在以前描述的檢測基礎(chǔ)上提高檢測的靈敏度/特異性。在這個(gè)附加的權(quán)利要求和說明書中所用到的，“一個(gè)”，“一”和“這個(gè)”等形式包括多個(gè)的含義，除非文中另有明確說明外。例如，“這個(gè)方法”的含義是包括一個(gè)或多個(gè)方法，和/或，這里描述的多個(gè)步驟，和/或?qū)﹂喿x本說明等的本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人士是顯而易見的意思理解。除非另有定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都是通用的，對本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說這些都是熟知的。雖然與這里描述的所有方法和材料的類似或等同物都可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或檢測，現(xiàn)在所述的是較優(yōu)選的方法和材料。此處提到的所有出版物的全部被納入作為本發(fā)明的參考。
定義“治療”，是指根據(jù)病人執(zhí)行藥品或?qū)崿F(xiàn)藥品性能的過程，用于預(yù)防(防范)或治療病人的患痛或疾病。此處所用的“抗體”包括完整的分子，也可以是片段，例如Fab和F (ab’)2，能夠結(jié)合表位的決定因素。該抗體可以是單克隆，多克隆抗體，嵌合，人性化，或單鏈抗體或片段。連接PlyA多肽、亞基或片段的抗體可以用完整二聚體，多肽片段，含有的靶標(biāo)小肽作為免疫抗原接種到載體分子產(chǎn)生。常用的載體可以化學(xué)耦合到包括牛血清白蛋白和球蛋白等多肽。雙肽可用于免疫動物(例如小鼠，大鼠或兔子)。一個(gè)“治療有效數(shù)量”或“治療有效劑量”是指從足夠到減少的數(shù)量或劑量，可預(yù)防或改善細(xì)菌感染相關(guān)的癥狀?！捌巍笔侵溉魏我环N蛋白質(zhì)或多肽，其中包括至少5個(gè)氨基酸殘基(最好，至少有10個(gè)氨基酸殘基，至少15個(gè)氨基酸殘基，至少有20個(gè)氨基酸殘基，至少有25個(gè)氨基酸序列酸殘基，至少有40個(gè)氨基酸殘基，至少有50個(gè)氨基酸殘基，至少有60個(gè)氨基酸殘基，至少有70個(gè)氨基酸殘基，至少有80個(gè)氨基酸殘基，至少有90個(gè)氨基酸殘基，至少有100個(gè)氨基酸殘基，至少有125個(gè)氨基酸殘基，至少有150個(gè)氨基酸殘基，至少有175個(gè)氨基酸殘基，至少有200個(gè)氨基酸殘基，或至少有250個(gè)氨基酸殘基)的氨基酸序列來自親本的蛋白質(zhì)或多肽，或由至少10個(gè)堿基對的核苷酸序列(最好至少有20個(gè)堿基對的，至少有30個(gè)堿基對的，至少有40個(gè)堿基對的，至少有50個(gè)堿基對的，至少有50個(gè)堿基對的，至少有100個(gè)堿基對的核酸至少有200個(gè)堿基對)來自親本的核苷酸。任何指定的片段可能具備或不具備親本核苷酸或蛋白質(zhì)或多肽的功能。此處所用的“類似”，是指與本發(fā)明中所述的具有預(yù)期活性和治療效果的核苷酸、蛋白或多肽一樣，具有相同或相似的活性或功能的核苷酸，蛋白質(zhì)，或多肽，(例如，A組鏈球菌細(xì)胞壁裂解活性，或能幫助診斷、預(yù)防或治療鏈球菌感染)，但不一定包括與優(yōu)選實(shí)施方式中的序列相同或相似的序列，如SEQ ID NOS:1或2，或具有如SEQ ID NOS:1或2中相同或相似的結(jié)構(gòu)。由于此處所用的核酸或核苷酸序列或蛋白質(zhì)的氨基酸序列或多肽，如果滿足至少下列標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)，則與具有預(yù)期活性的核苷酸、核酸或蛋白質(zhì)或多肽是類似的:(a)核酸，核苷酸，蛋白質(zhì)或多肽序列與這里所述的具有預(yù)期活性的核酸，核苷酸，蛋白質(zhì)或多肽序列至少有30 % (最好，至少有35 %，至少40 %，至少45 %，至少50 %，至少55 %，至少60 %，至少65 %，至少有70 %，至少75 %，至少有80 %，至少85 %，至少有90 %，至少有95 %或至少99%)相似性；(b)在嚴(yán)格的條件下雜交產(chǎn)生的核苷酸序列編碼的多肽是由至少5個(gè)氨基酸殘基(更多最好的，至少有10氨基酸殘基，至少有15個(gè)氨基酸殘基，至少有20個(gè)氨基酸殘基，至少有25個(gè)氨基酸殘基，至少有40個(gè)氨基酸殘基，至少有50個(gè)氨基酸殘基，至少有60個(gè)氨基酸殘基，至少有70個(gè)氨基酸殘留，至少有80個(gè)氨基酸殘基，至少有90個(gè)氨基酸殘基，至少有100個(gè)氨基酸殘基，至少有125個(gè)氨基酸殘基，或至少有150個(gè)氨基酸殘基)組成；或(c)是由核苷酸序列編碼的多肽與這里所述的具有治療效果的核苷酸編碼的多肽至少有30%是至少有30% (最好，至少有35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少有70%，至少有75%，至少80%，至少85%，至少有90%，至少有95%或至少99%)的相同序列。由于此處所用多肽具有與本發(fā)明中優(yōu)選的實(shí)施方式中的多肽具有“類似的結(jié)構(gòu)” 是指與優(yōu)選實(shí)施方式中的多肽具有相似的二維、三維或四維結(jié)構(gòu)的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知決定多肽的結(jié)構(gòu)的方法，包括但不限于，X射線晶體學(xué)，核磁共振和晶體的電子顯微鏡?！把苌铩笔侵溉魏我环N蛋白質(zhì)或多肽，包括通過氨基酸殘基替換，刪除或增加，或通過一個(gè)核酸或核苷酸的替換、刪除或突變改變親本的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。衍生出的核酸、核苷酸蛋白或多肽擁有與親本多肽相同或相似的功能?！霸\斷”，是指診斷，預(yù)知，監(jiān)測，特征，選擇患者，其中包括參加臨床試驗(yàn)，并確定可能具有特定疾病或臨床事件風(fēng)險(xiǎn)的患者或那些最有可能需要特定的治療服務(wù)的患者，或評估或監(jiān)測病人對特定的治療服務(wù)反應(yīng)?！獋€(gè)多核苷酸或多肽的“變異”(V)，此處使用的術(shù)語，是指多核苷酸和多肽分別不同于參照的多核苷酸或多肽。多聚核苷酸的變異一般都有限，那樣參照的核苷酸序列與變異核苷酸序列總的來說在許多地方是相同和密切相關(guān)的。核苷酸序列變異所造成的改變也可能會沉默。也就是說，變異可能不會改變由核苷酸編碼的氨基酸序列。這些沉默的變異僅限于改變成與參照物核苷酸編碼相同的氨基酸序列?；蛘撸诤塑账嵝蛄械淖儺惪赡軙淖儏⒄蘸塑账峋幋a的多肽的氨基酸序列。這種核苷酸的改變可能導(dǎo)致氨基酸替換，添力口，刪除，融合，及參照序列編碼的多肽的表達(dá)終止。多肽變異一般都有限，因此參照序列與變異序列總的來說在許多地方是相同和密切相關(guān)的。例如，由于替換，添加，刪除，融合，和終止表達(dá)，一個(gè)變異多肽和參考多肽氨基酸序列中可能會有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列不同，這是在任何融合表達(dá)中都可能存在或不存在。這些變異可以是氨基酸組成的改變(如不同的等位基因或自然氨基酸序列的變化，例如，作為mRNA或mRNA前處理改變的結(jié)果，如選擇性剪接或限制性蛋白水解的結(jié)果)。此外，改變也可能出現(xiàn)在翻譯后修飾差異(如糖基化，酰化，磷酸化，異戊二烯，脂化)。 用本發(fā)明檢測PlyA或檢測PlyA存在量或表達(dá)量的方法，一種核酸可以與本發(fā)明中的核酸，或和它的反向互補(bǔ)序列，或與編碼衍生物的核酸序列，或和反向互補(bǔ)核酸在低嚴(yán)格度情況下“雜交”。通過實(shí)施方式中的方法，但不限于這種方法，使用的低嚴(yán)格性程序如下(見 Shilo 和 Weinberg, 1981 年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.78，6789-6792)。含有 DNA 的濾紙?jiān)?40°C含有 35% 甲酰胺，5 X SSC 的 50mM Tris_HCl(pH 值 7.5)，5mM EDTA, 0.1% PVP,0.1%聚蔗糖(Ficoll)，1% BSA和500 μ g/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中預(yù)處理6小時(shí)。雜交在相同的溶液中進(jìn)行，稍作下列修改:0.02% PVP,0.02%聚蔗糖(Ficoll)，0.2%BSA,100 μ g/ml鮭魚精子DNA，10% (重量/體積)硫酸葡聚糖，和5_20X IO6CPM 32P標(biāo)記的探針。濾紙?jiān)陔s交混合液中40° C孵育18-20小時(shí)，然后在含有2X SSC，25mM Tris-HCl (pH7.4)，5mMEDTA和0.1%的SDS的洗滌液中55° C洗滌1.5小時(shí)。更換洗滌液后在60° C培養(yǎng)1.5小時(shí)。過濾器干燥后放射自顯影。如果有必要，濾紙第3次在65-68°C洗滌。重新放射自顯影到膠片。本領(lǐng)域熟知的低嚴(yán)格性條件也可以在本發(fā)明中采用。(如使用的跨物種雜交)。本發(fā)明也提供與PlyA核酸雜交的核酸(例如，一個(gè)序列如SEQ IDNO:1所示，或它的反向互補(bǔ)序列，或衍生物及其在高嚴(yán)格度條件下的反向互補(bǔ)核酸序列)。通過樣品但不限于樣品，設(shè)置高嚴(yán)格度條件的程序如下。含有DNA的濾紙?jiān)?XSSC 50mM的Tris-HCl (pH
7.5)，ImM 的 EDTA,0.02% 的 PVP, 0.02%聚蔗糖(Ficoll)分離，0.02% BSA 和 500 μ g/ml 變性鮭魚精子DNA的緩沖液中65°C預(yù)雜交8小時(shí)到過夜。濾紙中含有100 μ g/ml變性鮭魚精子DNA和5-20X 106CPM32P-探針的預(yù)雜交混合物在65°C雜交48小時(shí)。在含有2XSSC，0.01% PVP，0.01%聚蔗糖(Ficoll )，和0.01%的牛血清白蛋白溶液中37°C清洗濾紙I小時(shí)。然后在顯影前用0.1XSSC 50°C洗45分鐘。其他在本領(lǐng)域熟知的高嚴(yán)格度條件都可以用于本發(fā)明。本發(fā)明也提供與PlyA核酸雜交的核酸(例如，序列如SEQ IDNO:1所示，或它的反向互補(bǔ)序列，或衍生物編碼的核酸及其在中等嚴(yán)格度條件下的它的反向互補(bǔ)核酸序列)。如但不限于以下中等嚴(yán)格度程序條件:固定DNA的濾紙?jiān)诎? X SSC，5 XDenhardt’ s溶液，0.5% SDS和100微克/毫升變性鮭魚精子DNA的溶液中55° C預(yù)處理6小時(shí)。雜交在包含5-20 X IO6CPM32P標(biāo)記的探針的同樣溶液進(jìn)行。濾紙?jiān)陔s交混合液中55° C孵育18-20小時(shí)，并在含有I X SSC和0.1 % SDS溶液中60°C洗滌30分鐘，洗2次。濾紙吸干后放射自顯影。濾紙?jiān)诤? X SSC，0.1 % SDS溶液中37° C洗滌I小時(shí)。其他本領(lǐng)域常用的中等嚴(yán)格度條件也適用(例如，SambiOOk等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約；奧蘇貝爾等編輯，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊，1987-1997年。1994-1997年約翰.威利父子公司)。這里所說的“蛋白質(zhì)”和“多肽”是可以互換使用的。一般描述本發(fā)明提供說明A組鏈球菌特異的噬菌體細(xì)胞裂解酶(PlyA)A25的核酸和蛋白序列的方法，特別是對對A組鏈球菌，以及這些核酸和多肽序列診斷和治療的用途。本發(fā)明提供的PlyA全長核酸序列如SEQ ID N0:1所示。SEQ ID NO:2的序列分析說明:與鏈球菌屬噬菌體中的推斷的細(xì)胞裂解酶具有80%的同源性(圖2)，是SEQ ID NO:2和此前披露的細(xì)胞裂解酶間最高序列同源性。通過與其他酶比對，進(jìn)一步分析噬菌體A25的DNA，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)功能域，兩個(gè)“CPL-7”功能域被認(rèn)為與調(diào)解底物結(jié)合有關(guān)。以往的研究表明，細(xì)胞裂解酶的治療能力與單個(gè)細(xì)胞裂解酶消除鏈球菌的定殖能力有關(guān)(Nelson 等，2001 ，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA.98:4107-4112)。本文提供的序列數(shù)據(jù)可以用來作為開展診斷和治療用途的工具。設(shè)想PlyA可用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染，也包括執(zhí)行具有治療效果的PlyA多肽的有效數(shù)量。因此，本發(fā)明的另一個(gè)部分提供了診斷致病性鏈球菌感染的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可能含有A組鏈球菌細(xì)胞的臨床樣品與此處提供PlyA多肽一起預(yù)處理。如果樣品中存在的A群鏈球菌細(xì)胞，臨床樣品的預(yù)處理裂解了 A組鏈球菌細(xì)胞，使細(xì)胞裂解成分可在檢測中作為抗體?！N致病性鏈球菌感染的診斷方法，可包括:a)提供可能含有鏈球菌的患者樣品；b)樣品與PlyA多肽接觸；和c)檢測樣品中存在A族鏈球菌分析物，其中，待測樣品中的存在A組鏈球菌，表明主體感染鏈球菌。在一個(gè)部分，PlyA多肽包括的氨基酸序列與SEQIDNO:2的同源性大于80%，85%，90%，95%，98%，或99%。在另一個(gè)部分，PlyA多肽包括SEQ ID NO: 2所述序列。診斷測試格式，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，橫向流動檢測，或放射免疫法，都可用于本發(fā)明。在這些格式，可以直接利用PlyA蛋白或可準(zhǔn)備抗體等蛋白質(zhì)，如試劑盒所示用于以監(jiān)測病人樣品中存在的致病性鏈球菌。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或放射免疫法的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明的一個(gè)部分，提供了致病性鏈球菌感染的診斷方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，PlyA或一個(gè)片段包含一個(gè)結(jié)合域，如用化學(xué)熒光或蛋白質(zhì)標(biāo)記，然后標(biāo)記的PlyA直接與可能被致病性鏈球菌感染的主題分離的樣品孵育。觀察到樣品中的熒光表明存在致病性鏈球菌感染。一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中提供PlyA或包含一個(gè)結(jié)合域的一個(gè)片段的用途，在熒光素-熒光素酶檢測中幫助診斷致病性鏈球菌感染。在本實(shí)驗(yàn)方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品直接與PlyA或包含一個(gè)結(jié)合域的一個(gè)片段培養(yǎng)。如果樣品中含有致病性鏈球菌，PlyA或包含一個(gè)結(jié)合域的片段將與細(xì)菌結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌裂解，釋放通常存在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的ATP或其他組件，如酶。然后裂解液用熒光素-熒光素酶檢測。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品可和熒光素-熒光素酶一起直接添加到PlyA或含有一個(gè)結(jié)合域的片段中，無需在加入熒光素-熒光素酶前收集細(xì)胞裂解液。如果樣品存在致病性鏈球菌，從裂解細(xì)菌釋放的ATP會引發(fā)熒光素-熒光素酶系統(tǒng)的陽性反應(yīng)，導(dǎo)致從反應(yīng)混合物中釋放可檢測的光。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，PlyA作為一個(gè)藥物組分和適宜的藥物載體一起用來處理細(xì)菌感染，包括有致病性A組鏈球菌引起的感染。設(shè)想包括PlyA的藥物組分能治療哺乳動物的鏈球菌感染，包括但不限于人類。在進(jìn)一步實(shí)施方式中使用物組分專門治療組A族鏈球菌感染，包括鏈球菌咽炎(“咽喉炎”)，急性風(fēng)濕熱，風(fēng)濕熱，猩紅熱，急性腎炎，壞死性筋膜炎。一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，包括PlyA的藥物組分用于治療人類疾病。本發(fā)明的另一個(gè)部分用于制備特異的PlyA抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體是PlyA或亞基或片段的特異單克隆抗 體。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗體是多克隆抗體，來自小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，綿羊，馬，豬，牛，或任何本領(lǐng)域常用的其他制備多克隆抗體的哺乳動物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體可以是嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體或片段。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中一個(gè)持續(xù)繁殖細(xì)胞系產(chǎn)生一種PlyA或生物活性亞基或片段特異的單克隆抗體。診斷作用因此，本發(fā)明的另一個(gè)部分提供了致病性鏈球菌感染的診斷方法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可能含有A組鏈球菌細(xì)胞的臨床樣品與此處所述的PlyA多肽預(yù)處理。如果樣品中存在的A組鏈球菌，細(xì)胞臨床樣品的預(yù)處理裂解了 A組鏈球菌，使細(xì)胞裂解組分作為抗體用于檢測?？捎糜诒景l(fā)明的診斷測試方式，包括酶聯(lián)免疫吸附檢測，橫向流動檢測，或放射免疫法檢測。在這些方式中，可以直接利用PlyA蛋白或需要準(zhǔn)備文中所述蛋白質(zhì)的抗體，如試劑盒中所述的方法來監(jiān)測病人樣品中存在的致病性鏈球菌。酶聯(lián)免疫吸附檢測法或放射免疫法的程序是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以用如化學(xué)熒光或熒光蛋白標(biāo)記PlyA的結(jié)合域，然后標(biāo)記的PlyA，直接與可能含有致病性鏈球菌的樣品孵育。觀察到樣品中的熒光(或其他檢測底物結(jié)合)表明存在致病性鏈球菌感染。案例也提供了用PlyA在熒光素-熒光素酶檢測中診斷致病性鏈球菌感染。在本檢測方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品可直接與PlyA共培養(yǎng)。如果樣品中含有的致病性鏈球菌，PlyA將與細(xì)菌結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌的裂解，然后釋放ATP或其他通常存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的組分，如酶。然后用熒光素-熒光素酶檢測裂解液。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，可能含有致病性鏈球菌的樣品同時(shí)和突光素-突光素酶一起直接添加到PlyA中，無需在添加熒光素-熒光素酶前加收集裂解液。如果是樣品中存在致病性鏈球菌，從裂解細(xì)菌釋放的ATP會引發(fā)熒光素-熒光素酶檢測系陽性反應(yīng)，從反應(yīng)混合物中產(chǎn)生可檢測的光。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，被PlyA裂解的鏈球菌釋放出的任何其他細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物，酶，蛋白質(zhì)，細(xì)胞壁片段，或碳水化合物也可以用本領(lǐng)域其他任何常用檢測方法檢測。另外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以用PlyA多肽或亞基或片段的抗體，該抗體被標(biāo)記后(如用熒光或其他已知的熒光蛋白或化學(xué)物)，耦合到噬菌體蛋白，與測病人樣品中的特異的細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合，從而協(xié)助致病性鏈球菌的檢測。多肽可直接標(biāo)記后用于檢測病人樣品中存在的致病性鏈球菌?？捎糜诒景l(fā)明的進(jìn)一步的診斷測試方式，包括酶聯(lián)免疫吸附檢測或放射免疫法。在這些方式中，可以直接利用PlyA蛋白或準(zhǔn)備文中所述蛋白質(zhì)的抗體，如在試劑盒中所述方法監(jiān)測病人樣品中存在的致病性鏈球菌。酶聯(lián)免疫吸附檢測法或放射免疫法的程序是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明的另一個(gè)部分提供致病性鏈球菌感染的診斷方法，包括:a)收集可能感染鏈球菌的患者樣品；二)樣品與熒光標(biāo)記的PlyA接觸；和c)測量與樣品結(jié)合的熒光多肽的數(shù)量，其中有能檢測到結(jié)合的熒光表明樣品中存在鏈球菌。本發(fā)明的另一部分提供了一個(gè)檢測樣品中鏈球菌的方法，包括:a)收集可能感染鏈球菌的患者樣品山)樣品與PlyA共培養(yǎng)；c)收集細(xì)胞裂解液，d)細(xì)胞裂解液與熒光素-熒光素酶共培養(yǎng)；和e)測量產(chǎn)生的光的強(qiáng)度，其中產(chǎn)生的光強(qiáng)的增加，表明樣品中存在的鏈球菌。本發(fā)明的另一部分還提供了一個(gè)樣品中鏈球菌的檢測方法，包括:a)收集可能感染鏈球菌的患者樣品；b)在樣品中加入熒光素-熒光素酶和PlyA ；c)測量產(chǎn)生的光強(qiáng)，其中產(chǎn)生的光強(qiáng)增加，表明樣品中存在的鏈球菌。本發(fā)明的另一部分還提供了`產(chǎn)生PlyA或亞基或片段的抗體的方法?？贵w可以是多克隆，單克隆抗體，嵌合，人源化，或單鏈鏈抗體?？贵w可以在小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，綿羊，馬，豬等動物上產(chǎn)生。這些抗體可用于鑒定和分離與PlyA結(jié)合的鏈球菌細(xì)胞壁的組分。這些抗體其他的用途是調(diào)動PlyA到Biacore芯片來開展與鏈球菌細(xì)胞壁結(jié)合的PlyA其結(jié)合位點(diǎn)的親和力或動力學(xué)研究。本發(fā)明的另一個(gè)部分是用PlyA裂解感染的鏈球菌，釋放鏈球菌的DNA。這些釋放的DNA，可以用來PCR分析，鑒定鏈球菌。本發(fā)明的一個(gè)更具體的實(shí)施方式是檢測一個(gè)樣品中的致病性鏈球菌的方法，包括:a)收集可能被鏈球菌感染的病人樣品；b)把PlyA加入到樣品中直到觀察到細(xì)菌的裂解；c)從裂解細(xì)菌中分離DNA; d)利用分離的DNA準(zhǔn)備一個(gè)可用于分析和鑒定的病人樣品中存在鏈球菌的標(biāo)記。治療的用途本發(fā)明另一部分也提供利用PlyA多肽(細(xì)胞裂解酶)治療細(xì)菌感染或預(yù)防體外和體內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞生長的方法。本發(fā)明的功用之一是利用PlyA多肽(細(xì)胞裂解酶)治療由鏈球菌引起的感染或防止鏈球菌的生長，尤其是A組鏈球菌。本發(fā)明的另一個(gè)作用也可以用PlyA細(xì)胞裂解酶作為去污劑。本發(fā)明的也提供利用PlyA多肽(細(xì)胞裂解酶)治療細(xì)菌感染或預(yù)防體外和體內(nèi)細(xì)胞生長的方法。本發(fā)明的功能之一是利用PlyA (細(xì)胞裂解酶)多肽治療由鏈球菌引起的感染或防止鏈球菌的生長，尤其是A組鏈球菌。本發(fā)明的另一個(gè)作用也可以用PlyA細(xì)胞裂解酶作為去污劑。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中通過放置包含有效劑量PlyA和載體的藥物組分來釋放PlyA到嘴、喉嚨或鼻腔，這樣可預(yù)防或治療上呼吸道感染。首選的是，PlyA在適宜的有活性的PH值環(huán)境。如果一個(gè)人與有上呼吸系統(tǒng)疾病的人接觸，PlyA將依附在粘膜襯里，防止感染細(xì)菌的定殖。應(yīng)用的方式包括但不限于，直接的，間接的，載體和特殊的手段或任何相結(jié)合的方式。PlyA可以通過鼻腔噴霧劑，滴鼻劑，鼻軟膏，洗鼻，鼻注射，鼻包裝，支氣管噴劑和吸入直接應(yīng)用，或通過使用潤喉糖，或通過使用漱口水或漱口水間接使用，或通過藥膏涂抹到鼻孔，鼻梁，或在臉上或任何以上組合或其他類似的方法。PlyA劑量的限制的方式，包括但不限于錠劑，粒劑，糖果，注射劑，含片，片劑，粉劑，噴霧劑，液體，軟膏，和氣霧劑。PlyA做成錠劑，片劑，或含片時(shí)可能會添加糖，玉米糖漿，各種染料，非糖甜味劑，香料，任何粘合劑，或上述的組合。同樣，任何口香糖的產(chǎn)品可能含有阿拉伯膠，棕櫚蠟，檸檬酸，玉米淀粉，食用色素，香料，非糖甜味劑，明膠，葡萄糖，甘油，膠基，蟲膠，糖精鈉，糖，水，白蠟，纖維素，粘合劑等，及其組合。含片可能還進(jìn)一步包含蔗糖，玉米淀粉，阿拉伯膠，膠黃蓍膠，茴香腦，亞麻籽，油樹脂，礦物油，纖維素，粘合劑，及其組合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，食糖替代品使用中的葡萄糖，蔗糖或其他糖類 。PlyA也可以放在鼻噴霧劑中，這里的鼻噴霧劑是載體。噴鼻劑能長效或長期釋放噴霧，制造方法在本領(lǐng)域是熟知的。也可以通過吸入使PlyA能進(jìn)一步下降到支氣管道，包括進(jìn)入肺部。另一個(gè)組分和PlyA的用處是治療或預(yù)防皮膚燒傷和傷口的細(xì)菌感染。組分包括有效數(shù)量的PlyA和載體來釋放PlyA到受傷的皮膚。PlyA的使用方式可以有很多類型和很多載體組合，包括但不限于親水性液體，酒精類液體，水溶性凝膠,乳液,軟膏,疏水性液體底物，礦物油底物，融合的礦物油和凡士林，羊毛脂，脂質(zhì)體，蛋白質(zhì)，如血清白蛋白或明膠，纖維素粉和上述的組合。載體的釋放方式包括治療劑包括但不僅限于涂抹，噴霧，緩釋片，液體吸收擦，及其組合。PlyA可直接用于繃帶上或在其他載體中的一種上。出售的繃帶可以使潮濕或干燥，PlyA以凍干形式在繃帶上。此方法對治療燒傷最有效。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式中，PlyA的殺菌活性是令人滿意的，PlyA可以單獨(dú)或與一個(gè)或多個(gè)附加的治療化合物聯(lián)合治療。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，PlyA可以治療人類的細(xì)菌感染(例如，減輕癥狀或延緩發(fā)病或減緩發(fā)病進(jìn)展)。一個(gè)實(shí)施方式是用來治療鏈球菌咽炎。一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式說明PlyA細(xì)菌裂解酶可用于非人類哺乳動物或人類?？梢栽O(shè)想一個(gè)實(shí)施方式即，PlyA可用于治療被鏈球菌感染哺乳動物，包括人類和非人類的哺乳動物，在這種情況下沒有誰會繼續(xù)用抗微生物治療的傳統(tǒng)模式。設(shè)想PlyA可用于去污。設(shè)想PlyA也可與其他裂解酶或與其他抗生素或抗微生物治療的形式一起進(jìn)行治療。在做人類試驗(yàn)前，PlyA的治療用途可以用合適的動物模型系統(tǒng)測試，包括但不限于大鼠，小鼠，雞，牛，馬，猴，兔等。在用于人類測試前的活體試驗(yàn)，可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何的動物模型系統(tǒng)中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，PlyA在非人類的動物中測試(例如，小鼠，大鼠，猴，兔，豚鼠)，優(yōu)選的非人類動物模式是能感染鏈球菌疾病的動物模型。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，PlyA可用于動物，而在微生物水平上PlyA的效果是在受感染的動物中被確定的?？梢詮腜lyA處理后動物或動物組獲得的細(xì)菌與用對照核酸或蛋白質(zhì)處理的動物或動物組獲得的細(xì)菌進(jìn)行對比，來鑒定PlyA的效果。另一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)PlyAs活性的測試化合物可以在受鏈球菌感染的人類中被鑒定。按照這個(gè)實(shí)施方式，測試化合物或?qū)φ栈衔锖蚉lyA —起加入人類，測試化合物要么減少微生物感染的蔓延，要么消除細(xì)菌感染或改善病癥。治療和預(yù)防性試劑以及他們的用途本發(fā)明提供的治療方法，包括對主體施用有效數(shù)量的PlyA。在優(yōu)選的方式中，PlyA被實(shí)質(zhì)的純化(例如，實(shí)質(zhì)上不含有限制其活性的、或產(chǎn)生不想要的副作用的物質(zhì))。主體最好是動物，包括但不限于如猴子，牛，豬，馬，雞，貓，狗等動物，最好是哺乳動物，最優(yōu)選的是人類。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，主體是一個(gè)非人類的哺乳動物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，主體是人類哺乳動物。用來施用PlyA的各種已知的給藥釋放系統(tǒng)，如包封在脂質(zhì)體、微球或微囊中。導(dǎo)入方法可以在腸內(nèi)或腸外，包括但不限于皮內(nèi)，肌肉注射，腹腔，靜脈注射，皮下注射，滴鼻，硬膜外，外用和口服。組分可通過任何方便的途徑施用，例如通過滴注或推注，通過上皮或粘膜襯里(例如，口腔粘膜，直腸及腸道粘膜等)的吸收，也可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，本發(fā)明的藥物組分可以用任何適宜的途徑被引進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦內(nèi)和鞘內(nèi)注射，腦室導(dǎo)管可用于腦室注射，例如，連接到一個(gè)蓄水池。肺部施用可以通過如吸入器或噴霧器，和制定一個(gè)霧化器進(jìn)行。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的藥物組分可以按想要的方式局部施用與需要治療的區(qū)域，如局部使用于皮膚，可用任何本領(lǐng)域熟知的方法。本發(fā)明的另一個(gè)部分提供的藥物組合物包括用于治療細(xì)菌性感染的PlyA。此外，在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式中包括一種藥物組分用于局部處理細(xì)菌感染。另一個(gè)實(shí)施方式中可能包括一個(gè)藥物組分用于處理系統(tǒng)感染，或處理那些其他抗生素的無效的感染。

這些組分包括具有治療有效數(shù)量成分，和適宜的藥學(xué)載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，“適宜的藥學(xué)上的”是指由聯(lián)邦監(jiān)管機(jī)構(gòu)或州政府，或在美國藥典或其他普遍公認(rèn)的藥典中列出的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)可在動物身上使用，尤其是人類?！拜d體”是指藥物施用時(shí)的稀釋劑，助劑，輔料，或運(yùn)輸載體。這些藥物載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油，動物，植物或合成油，如花生油，大豆油，礦物油，香油等。藥物組合用于靜脈注射時(shí)水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和糖水和甘油溶液也可以被作為液體載體，特別是注射溶液。合適的藥用輔料，包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，大米，面粉，粉筆，硅膠，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙二醇，乙二醇，水，乙醇等等。組分，如果需要，也可以含有少量的潤濕或乳化劑，或PH緩沖劑。這些成分可以以溶液，混懸劑，乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，散劑，緩釋制劑等形式。組分也可以制定為栓劑，用傳統(tǒng)的粘合劑和載體，如甘油三酯。口服制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)載體，如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。在E.W.Martin的“雷明頓的醫(yī)藥科學(xué)”中描述適合制藥載體的例子。這些組分將包含治療有效數(shù)量的噬菌體A25核酸或PlyA的，最好是純化過的形式，和適量的載體，用來為主體提供正確的施用方式。藥物形式需要適合施用的方式。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥劑組分是按照適宜人類靜脈注射藥劑組成的例行程序制作的。通常情況下，靜脈注射的成分是在無菌水液體緩沖液。在必要的情況下，成分可能還包括一種溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以減輕注射部位疼痛。一般來說，成分單獨(dú)或以單位劑型形式混合在一起，例如，干凍粉或無水裝在密封的容器如安瓿或sachette，表明活性劑的數(shù)量。藥物組分通過輸液施用，它可以用包含無菌醫(yī)藥級水和鹽的輸液瓶來配置。藥物組分可以通過注射施用，成分可以在施用前，小瓶注射用無菌水或鹽可以用于與藥劑成分混合。治療細(xì)菌感染疾病的PlyA的有效劑量是由前面描述的標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)確定的，此外，可采用體外實(shí)驗(yàn)幫助確定最佳劑量范圍。規(guī)定使用的精確劑量依賴于給藥途徑，疾病或失調(diào)癥狀的嚴(yán)重性，并應(yīng)根據(jù)醫(yī)生和每個(gè)科目的具體情況判定。然而，合適的靜脈注射劑量范圍一般約20-500微克活性化合物每公斤體重。適合鼻腔給藥劑量范圍一般約
0.01皮克/每公斤體重到I毫克/公斤體重。有效劑量可以從體外或動物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線推斷。本發(fā)明還提供了一個(gè)醫(yī)藥包或制藥工具包，包括一個(gè)或多個(gè)容器裝有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的藥物組合物。這樣的容器可以作為一種標(biāo)識，以政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的生產(chǎn)規(guī)范、使用或銷售藥品或生物產(chǎn)品的形式，這種標(biāo)識也反映了(a)被生產(chǎn)、使用或銷售人類藥物的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)(b)使用說明，或兩者兼而有之。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的藥物組合可以非常好的用于在需要治療的局部位置，例如，通過但不限于在手術(shù)過程中局部灌注，局部注射，導(dǎo)管的方式導(dǎo)入，或植入，這里說的植入可以是多孔，非多孔或膠狀物質(zhì)，包括膜，如sialastic膜，纖維或高分子材料如 Elvax (即 Ruan 等，1992 年，Proc Natl Acad Sci USA, 89:10872-10876)。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物施用可以通過直接注射霧化吸入。在另一種實(shí)施方式中,PlyA可以被釋放到泡囊,特別是脂質(zhì)體。(見Langer (1990)科學(xué)249:1527-1533; Treat等，脂質(zhì)體的傳染性疾病和癌癥的治療，Lopez-Berestein andFidler(eds.), Liss, N ew York, pp.353-365(1989);Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327;同上.)在另一個(gè)實(shí)施方式中PlyA可以釋放在受控的釋放系統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，需要一個(gè)泵(見 Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwaldet al.(1980) Surgery 88: 507 ; Saudek et al.(1989) N.Engl.J.Med.321: 574) 在另一個(gè)實(shí)施方式中需要用到聚合材料(Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton,Fla.(1974) ;ControlledDrug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen andBa 11 (eds.), Wiley, N.Y.(1984) ; Ranger and Peppas, J.(1983) Macromol.Sc1.Rev.Macromol.Chem.23:61;see also Levy et al.(1985)Science 228:190;During etal.(1989)Ann.Neurol.25:351;Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71:105)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)受控制的釋放系統(tǒng)放在治療靶標(biāo)附近如導(dǎo)氣管，從而減少藥量，僅為系統(tǒng)用量的一部分(見 e.g., Goodson, in Medical Applications of ControlledRelease (1984) supra, vol.2, pp.115-138)。另一個(gè)種可控釋放系統(tǒng)在 Langer (1990,Science 249:1527-1533)的綜述中有提到。實(shí)施例例1.rA 25細(xì)胞裂解酶蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化為了在異宗大腸桿菌中幫助表達(dá)/純化的S.pyogenes曬菌體A25的細(xì)胞裂解酶，細(xì)胞裂解酶基因一般通過基因改造后插入pET25a等C末端有His標(biāo)記融合蛋白的表達(dá)載體。結(jié)果A25終止密碼子被刪除。融合蛋白被允許在假定A25細(xì)胞裂解酶的起始密碼子編碼蛋氨酸殘基處起始表達(dá)。His標(biāo)記蛋白允許用N1-NTA層析樹脂(Aiagen)來純化蛋白。該改造的片段首先在非表達(dá)載體繁殖，經(jīng)過DNA確認(rèn)后，再轉(zhuǎn)移到pET25a載體。為了表達(dá)，用含有50微克/ml氨芐青霉素的Terrific Broth培養(yǎng)基在37 °C250rpm過夜振蕩培養(yǎng)含PET21A LysNX的大腸桿菌Origami (Novagen)至穩(wěn)定期。翌日，菌株接種到含有50微克/ml氨芐青霉素的Terrific Broth培養(yǎng)基至0D550nm=0.15。在370C 250rpm振蕩培養(yǎng)至0D550nm達(dá)到0.6，然后通過加入IPTG至ImM誘導(dǎo)表達(dá)rA25細(xì)胞裂解酶。繼續(xù)在30° C，250RPM振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。在2至8° C 7700XG離心15分鐘收集細(xì)胞。棄上清，沉淀用抽提液洗滌3遍(0.3M氯化鈉，NaP0450mM, IOmM咪唑，pH值8.0)，然后在2至8° C 6000XG離心10分鐘。棄上清，如上所述洗滌2次以上。第三清洗后，棄上清，沉淀儲存于-20° C備用。為了超聲破碎，用含有ImM PM SF的1/40細(xì)菌菌液體積的預(yù)冷抽提緩沖液重懸冷凍的細(xì)胞沉淀。細(xì)胞懸液在冰上用布蘭森Sonifier450超聲，共7個(gè)周期(一個(gè)周期為4分鐘脈沖，占空比 30%，設(shè)置輸出脈沖3)。完全超聲破碎后，懸浮液在2-8° CIO, 000XG離心25分鐘。根據(jù)生產(chǎn)說明，倒出上清與N1-NTA樹脂SUPERFLOW (QIAGEN)混合用來大量純化。混合液在4° C輕輕振蕩2小時(shí)。柱子用提取緩沖液預(yù)洗一次?；旌衔锷现?，用洗滌緩沖液(0.3M氯化鈉，50MM財(cái)04;，和20mm咪唑，pH值8.0)洗凈，rA25用洗脫緩沖液(0.3M氯化鈉，NaP0450MM和250MM咪唑，pH值8.0)洗脫。洗脫液在KEB緩沖液中透析(KEB:0.1MKP04，EDTA的5麗，3麗β-ME公司，pH值6.7)，透析后，從導(dǎo)管中流出的洗脫液變澄清，然后濃縮至約10mg/ml。通過SDS-PAGE判斷純度。例2.rPlyA處理A組鏈球菌釋放A抗原,啟動特異檢測A組抗原橫向流動檢測。經(jīng)過處理后，A組鏈球菌用于特異檢測A組抗原的橫向流設(shè)備。715:78圖6的結(jié)果如下所示:泳道1:無產(chǎn)物；泳道2:5 微克的 rPlyA/08.08 ；泳道3:15 微克的 rPlyA/D ；泳道4:5微克的rPlyA/08.08，沒有A組鏈球菌；泳道5:泳道2的重復(fù)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rPlyA能在本測試形式中檢測A組鏈球菌。以前沒有出版物報(bào)道A組特異噬菌體中具有適宜的細(xì)胞裂解酶有此用途?？刹捎弥亟MrPlyA來促成這類實(shí)驗(yàn)；利用天然的細(xì)胞裂解酶需要相當(dāng)多的復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化，這將不適于工廠化生產(chǎn)。例3.噬菌體A25中的細(xì)胞裂解酶基因細(xì)胞裂解酶基因包含在噬菌體A25的基因中，其DNA序列尚未披露。為了識別和分離細(xì)胞裂解酶基因，進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)包括標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA、PCR和比較基因組學(xué)等。完整的1446bpDNA序列被確定。然后編碼的細(xì)胞裂解酶作為重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，純化得到。純化的細(xì)胞裂解酶進(jìn)行生化功能評估，具有快速溶解活體A組鏈球菌被確定。然后用A組鏈球菌對其性能進(jìn)行了體外免疫診斷評估測試。例4.實(shí)驗(yàn) 分離抗菌素 DNA (618:61)O Qiagen QIAamp 小量試劑盒.
用Qiagen QIAamp小量試劑盒純化的澄清的A25噬菌體上請液中提取DNA。上請液用DNaseI (20g/ml)處理15分鐘，然后在18000Xg離心5分鐘。上請液中加入EDTA至20mM，然后用與Qiagen溶液等體積的50ug/ml的蛋白酶K在56° C處理10分鐘。然后按照說明書純化DNA。O HindIII 酶切(618:62)純化的A25噬菌體DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切，酶切后DNA用瓊脂糖凝膠電泳分析，用報(bào)道過的相似方法(Pomrenke和Ferretti)檢測4、10和17Kb的片段。〇克隆HindIII酶切片段；DNA部分測序來自A25的HindIII酶切片段與載體Pucl9DNA重組后在大腸桿菌中繁殖。DNA序列終止由互補(bǔ)到PUC19的引物側(cè)翼序列決定。例5.A25細(xì)胞裂解酶的體外殺菌活性。細(xì)胞裂解酶活性通過修改過的濁度還原法確定的(Fischetti VA等，1971，5月IH ;133 (5): 1105-17)。A組鏈球菌菌株12204在Todd-Hewitt培養(yǎng)基生長到靜止期或?qū)?shù)期時(shí)，離心并用含有0.005M EDTA pH 6.70.05M磷酸鹽緩沖液洗一次。洗過的細(xì)胞重懸浮在同樣的緩沖液中至0D600 (分光光度計(jì))約為0.3。細(xì)胞裂解酶活性測定在室溫有蓋微孔板中進(jìn)行。氯仿敏感的A組鏈球菌菌株12204適宜作為噬菌體細(xì)胞裂解酶活性測定的材料。根據(jù)已報(bào)道的方法稍作修改準(zhǔn)備細(xì)胞壁(Hill JE and Lff Wannamaker 1981J.Bact.145:696)。在L3肉湯培養(yǎng)物中加入5% (體積/體積)氯仿在37°C振蕩培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)。細(xì)胞懸液緩慢從氯仿中倒出，細(xì)胞沉淀用含有0.005M EDTA和3mM 2-巰基乙醇(pH值6.7)的0.1M磷酸鹽緩沖液重懸。裂解的細(xì)胞懸液調(diào)整到分光光度計(jì)濃度約0.2用于細(xì)胞裂解酶活性測定。細(xì)胞裂解酶裂解細(xì)胞測定在37°C微孔板進(jìn)行。用如上所述的濁度測定法來檢測其他細(xì)菌對A25細(xì)胞裂解酶的裂解敏感性。對下列細(xì)菌沒有檢測到的裂解活性:金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，奈瑟氏菌屬。rA25的細(xì)胞裂解酶活性也可以用A組鏈球菌的ICT設(shè)備檢測，ICT設(shè)備依賴于裂解酶的能力來快速裂解A組鏈球菌從而提取可被ICT檢測的足夠多的抗體信息的設(shè)備。例6.實(shí)驗(yàn)已確定來自不同的噬菌體的細(xì)胞裂解酶基因序列(它們之間的相似程度不一)。從A25基因組中找到一個(gè)基因，該基因編碼一個(gè)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與已測序的一個(gè)細(xì)胞裂解酶非常相似，方便識別。在公共互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中許多這些序列都是可以得到的。目前主要的阻礙是還未報(bào)道這些噬菌體DNA基因組序列?？朔@個(gè)阻礙的策略是分離所有噬菌體基因組的片段，來確定它們的DNA序列。然后在另一種噬菌體的Internet數(shù)據(jù)庫搜索比對相關(guān)序列。假定A25噬菌體的序列順序與那個(gè)噬菌體的相同，然后根據(jù)一般(如限制性內(nèi)切酶圖譜)途 徑來鑒定的可能片段如細(xì)胞裂解酶基因。
在Pomrenke ME和Ferretti JJ.測定的鏈球菌A25和Cl的噬菌體基因組物理圖譜中，(基本微生物學(xué)雜志，6，395-39829 (1989))據(jù)報(bào)道噬菌體A25的DNA已經(jīng)被分離，已經(jīng)確定了幾個(gè)限制性內(nèi)切酶(EcoRI，Aval，HindIII)疑是酶切位點(diǎn)?；谶@一分析，噬菌體基因組的大小可能有34600個(gè)堿基對。當(dāng)我們用這些酶酶切純化的A25噬菌體DNA時(shí)，僅有HinddIII酶切方式與報(bào)道類似。我們繼續(xù)用分子克隆分離這些DNA片段，如重組DNA方法(rDNA)。然后，我們用這些片段中的部分DNA來鑒定上面列出的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)噬菌體pUC19載體中的質(zhì)粒PA25H4包含一個(gè)4KB的酶切片段。4kb片段的末端測序，隨后BLAST分析，結(jié)果說明兩端的最佳配比(_ 70% )是肺炎鏈球菌噬菌體MM11998 (入序列號# DQ113772)，其完整的基因組序列已被確定。一個(gè)結(jié)果是，比對的一端為MM11998坐標(biāo)20959的“次要衣殼”的蛋白質(zhì)。另一個(gè)結(jié)果是，比對為MM11998坐標(biāo)25205的“卷尺”蛋白質(zhì)基因中。而且在MM11998的兩端位點(diǎn)的距離也是4Kb，基于這大于4KB的相似性，推測噬菌體A25的基因組與麗11998的基因組類似。在噬菌體麗11998中，細(xì)胞裂解酶基因接近于終點(diǎn)的“右邊”，從而指導(dǎo)獲得相應(yīng)的rDNA的研究方向。假定(基于Pomrenke和法拉)噬菌體A25的右末端也是HindIII的IOKB酶切片段的末端。這個(gè)片段在大腸桿菌中的載體PUC19的擴(kuò)繁后，像質(zhì)粒PA25H10—樣，如上所述方法獲得這個(gè)片段的末端基因序列。DNA序列的一端被確認(rèn)有HindIII的酶切位點(diǎn)的一端，與插入PA25H4末端的“卷尺”基因同源。因此，在噬菌體A25基因組中，在pA25H4中的IOKBHindIII酶切片段與4KB片段毗鄰。然而，DNA序列的另一個(gè)末端不是含噬菌體末端的細(xì)胞裂解酶基因，而是另一個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)。BLAST這個(gè)片段，與MMl 1998沒有任何同源性。然而，最好的同源性，雖然弱，是與GAS原噬菌體中穴蛋白前面的區(qū)域。因?yàn)榇蠖鄶?shù)噬菌體基因組的穴蛋白與細(xì)胞裂解酶基因毗鄰，因此制定了分離可能小，可能為DNA末端區(qū)域的毗鄰序列的方法。由于在推測的噬菌體A25末端附近有一個(gè)意想不到的HindIII酶切位點(diǎn)(Pomrenke和法拉沒有預(yù)測到)，篩選能切開pA25H10中的IOKB片段的候選酶，用分子克隆方法分析酶噬菌體的末端片段。限制性內(nèi)切酶NheI被選定，可能會酶切產(chǎn)生約2KB適宜大小的末端片段。當(dāng)噬菌體A25的NheI酶切片段的克隆后，質(zhì)粒pNhe7被鑒定。pNhe7的DNA序列說明這個(gè)片段的一個(gè)末端是已經(jīng)在PA25H10中的預(yù)期片段。然而，不幸的是，這個(gè)片段的另一端是另一個(gè)NheI酶切位點(diǎn)，而不是噬菌體末端。但這部分包含了可能的細(xì)胞裂解酶基因(根據(jù)BLAST分析)的一部分，編碼一個(gè)130個(gè)氨基酸殘基的N-端。為了分離A25細(xì)胞裂解酶基因的其余部分，使用了 “PCR-步行”方法。在此方法中，假設(shè)與目標(biāo)片段毗鄰的片段繼續(xù)與相關(guān)的同源基因同源。從同源片段的最保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物(BLAST分析)，假定該同源片段也將包含同樣多的毗鄰區(qū)域的DNA。另一個(gè)引物源自已經(jīng)分離的片段序列。BLAST分析A25細(xì)胞裂解酶的N-末端，發(fā)現(xiàn)最保守的同源物為SpyM3_1096連鎖位點(diǎn)，在化膿性鏈球菌的基因組MGAS315 (補(bǔ)充1139031..1140245序列號# AE014074.1)中編碼一個(gè)假定的細(xì)胞裂解酶基因。BLAST分析SpyM3_1096的C-端區(qū)域，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞裂解酶基因的下 游有一個(gè)區(qū)域在幾個(gè)其他GAS原噬菌體中相應(yīng)位置是保守的。那么在噬菌體A25中該區(qū)域也是保守的，因此根據(jù)該保守區(qū)域設(shè)計(jì)PCR引物。用這個(gè)引物和真正的A25細(xì)胞裂解酶基因引物(來自pNhe7中的序列)對噬菌體A25進(jìn)行了 PCR (降溫)。PCR產(chǎn)物在質(zhì)粒的pEl中擴(kuò)繁。對質(zhì)粒pEl進(jìn)行DNA測序發(fā)現(xiàn)，它包含A25細(xì)胞裂解酶基因序列的毗鄰序列，但不是細(xì)胞裂解酶基因的末端序列。因此，對pEl中的A25細(xì)胞裂解酶基因中的片段進(jìn)行BLAST分析后，繼續(xù)用步行的PCR方法來擴(kuò)增。與這個(gè)細(xì)胞裂解酶基因大片段最具有同源性的基因?yàn)殒溓蚓删wSMP的細(xì)胞裂解酶基因(序列號# ABK91888.1)。因此BLAST分析SMP細(xì)胞裂解酶基因C-末端序列和保守區(qū)域的側(cè)翼序列，用SMP細(xì)胞裂解酶基因的側(cè)翼序列直接設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增A25細(xì)胞裂解酶基因的其余部分，結(jié)果證明這非常有用。用質(zhì)粒PC擴(kuò)繁包含A25完整的細(xì)胞裂解酶基因的PCR產(chǎn)物。最后源自噬菌體基因組的完整的細(xì)胞裂解酶基因經(jīng)過酶切后被完整的克隆鑒定。已報(bào)道的細(xì)胞裂解酶基因序列也用這個(gè)分子克隆驗(yàn)證。`
權(quán)利要求
1.一個(gè)被分離的多肽包括與SEQ IDNO:2相似性大于80%的氨基酸序列，其中，該多肽具有細(xì)胞壁裂解活性。
2.一個(gè)被分離的核酸包括，與SEQ ID NO:1的序列相似性大于80%的核酸序列，該核酸序列編碼一個(gè)具有細(xì)胞壁裂解活性的多肽。
3.診斷致病性鏈球菌感染的方法，包括:a)提供可能含有A組鏈球菌的病人樣品；b)樣品與有效數(shù)量的PlyA多肽接觸，裂解可能存在樣品在中的A組鏈球菌；c)檢測樣品中A組鏈球菌分析物的存在與否，其中，樣品中存在A組鏈球菌分析物說明主體存在鏈球菌感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其 中，PlyA多肽包含一種氨基酸序列，其與SEQID N0:2的序列同源性大于80%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，PlyA多肽包含SEQID NO:2序列。
6.診斷致病性鏈球菌感染的方法，包括:a)提供可能含有A組鏈球菌感染的病人樣品；b)樣品與PlyA多肽接觸；c)檢測是否存在與PlyA多肽結(jié)合的Ply底物，其中，如果存在，那么檢測結(jié)合可以表明在樣品中存在鏈球菌感染。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，PlyA多肽包含一個(gè)氨基酸序列，與SEQID N0:2的序列相似性大于80%ο
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中，PlyA多肽包含SEQID N0:2的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)噬菌體A25的細(xì)胞裂解酶基因的鑒定、測序和分離的方法。該基因表達(dá)一個(gè)用來裂解噬菌體生命周期中細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也進(jìn)一步說明了用裂解酶裂解某種細(xì)菌的方法，該方法在檢測這些細(xì)菌的診斷過程的實(shí)例中也非常有用。
文檔編號G01N33/50GK103080307SQ201180005501
公開日2013年5月1日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者B·蒙梅羅, W·J·帕林, N·圖卡特 申請人:美艾利爾斯卡保羅有限公司