專利名稱：噬菌體φmru多核苷酸和多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將抑制分子遞送至微生物細(xì)胞，具體說是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的組合物和方 法。具體說，本發(fā)明涉及新鑒定的噬菌體<pmru，包括噬菌體誘導(dǎo)、噬菌體顆粒、噬菌體基因 組、噬菌體多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這些多肽的表達(dá)載 體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用所公開的噬菌體、多肽、多核苷酸、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞 來探測(cè)、靶向并抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
在新西蘭，農(nóng)業(yè)活動(dòng)是溫室氣體排放的主要來源。因此，減少農(nóng)業(yè)溫室氣體排放對(duì) 于新西蘭完成京都議定書的義務(wù)是重要的。議定書要求在首次承諾期(2008-2012)結(jié)束前 溫室氣體減排至1990年水平。為此，農(nóng)業(yè)部門和新西蘭政府成立了田園溫室氣體研究聯(lián)合 會(huì)(PGGRC)尋求降低新西蘭的農(nóng)業(yè)溫室氣體排放的方法。PGGRC活動(dòng)的一個(gè)重要部分是研究減少來自新西蘭放牧反芻動(dòng)物的甲烷排放量。 出于兩個(gè)原因，減少反芻動(dòng)物甲烷排放量具有商業(yè)利益。首先，不履行京都議定書承諾將迫 使政府購(gòu)買碳排放額度。目前預(yù)計(jì)該項(xiàng)將花費(fèi)三億五千萬美金。第二，甲烷的產(chǎn)生導(dǎo)致瘤 胃中產(chǎn)生的總能量損耗8-12%。可利用這種能量來提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能。甲烷在瘤胃中由稱為產(chǎn)甲烷菌的微生物產(chǎn)生，這種微生物屬于古細(xì)菌(Archaea) 界廣古菌門(euryarchaeota)的一部分。多數(shù)產(chǎn)甲烷菌依靠CO2和H2作為它們唯一的能 量來源，但是一些能使用乙酸或甲基化合物生長(zhǎng)。瘤胃中中存在多種不同屬的產(chǎn)甲烷古菌， 但是甲烷短桿菌屬中的種，尤其是反芻甲烷短桿菌(M. ruminantium)和史氏甲烷短桿菌 (M. smithii)被認(rèn)為是新西蘭反芻動(dòng)物中主要的產(chǎn)甲烷菌，反芻甲烷短桿菌目前是PGGRC 基金資助基因組測(cè)序項(xiàng)目的研究對(duì)象。該項(xiàng)目第一次對(duì)于瘤位產(chǎn)甲烷菌的基因組進(jìn)行測(cè) 序，旨在對(duì)甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)的生物學(xué)建立更好的理解，以發(fā)現(xiàn)抑制甲烷 產(chǎn)生的靶點(diǎn)。減少瘤胃中甲烷產(chǎn)生需要抑制產(chǎn)甲烷菌或使其甲烷生成通路失活。一種抑制甲烷 產(chǎn)生的方法是將特異性抑制分子遞送至產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞中?？赏ㄟ^(例如)使用特異性靶向 產(chǎn)甲烷菌的試劑如噬菌體達(dá)到這種目的。已對(duì)數(shù)種非瘤胃產(chǎn)甲烷菌的噬菌體進(jìn)行表征，但 是沒有報(bào)道關(guān)于能夠感染或裂解瘤胃產(chǎn)甲烷菌的噬菌體。因此，鑒定能夠感染產(chǎn)甲烷菌細(xì) 胞和/或遞送抑制劑的噬菌體極具優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種分離的噬菌體(pmru，包括本文詳述的以整體或部分形式生產(chǎn)的噬菌體顆粒和/或噬菌體基因組，以及分離的噬菌體多核苷酸和多肽。本發(fā)明還涉及一種分離的多肽，其包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:l-69的噬菌體氨 基酸序列。在一個(gè)具體方面，所述多肽包含選自SEQ ID NO :2-5和62-68的氨基酸序列。 另一方面，所述多肽包含SEQ ID NO :63的氨基酸序列。在另一方面，所述多肽為片段，例如 包含至少一個(gè)延伸自SEQ IDNO 63中殘基32-186的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含至少一種噬菌體多肽的編碼序列。在 一個(gè)方面，所述多核苷酸包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 1-69的氨基酸序列的編碼序列。在 一個(gè)具體方面，所述多核苷酸包含選自SEQ IDNO :2-5和62-68的序列的編碼序列。在另一 方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO 63的編碼序列。在另一方面，所述多核苷酸包含某編碼 序列的片段，該編碼序列編碼，例如，至少一個(gè)延伸自SEQ ID NO 63中殘基32-186的氨基 酸序列。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQ IDNO :74_142的 噬菌體核酸序列。.在特定方面，所述多核苷酸包含選自SEQ IDNO :75-78和135-141，或更 具體是SEQ ID N0:136的核酸序列。在另一方面，所述多核苷酸是包含例如延伸自SEQ ID NO 136中核苷酸94-558的核酸序列的片段或寡核苷酸。此外，本發(fā)明包括一種分離的多 核苷酸或其片段，該多核苷酸或其片段能與SEQ ID N0:74-142中任一核酸序列雜交。本發(fā) 明還包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有任一所述核酸序列的互補(bǔ)物、反向互補(bǔ)物、 反向序列或其片段。本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，其包含含有至少一種噬菌體多肽的編碼序列的多核苷 酸。在一個(gè)方面，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)選自SEQ IDNO 1-69的氨基酸序列的編碼序 列。在一個(gè)特定方面，所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO :2-5和62-68中至少一個(gè)氨基酸序列 的編碼序列。在另一方面，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)SEQ ID NO :63的氨基酸序列的編碼 序列。在另一方面，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)延伸自SEQ ID NO :63中殘基32-186的氨 基酸序列的編碼序列。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及以完整或部分形式產(chǎn)生如本文詳述的噬菌體cpmru 的表達(dá)載體。具體說，所述表達(dá)載體可產(chǎn)生噬菌體顆粒、噬菌體基因組或修飾的噬菌體，包 括其任何變化形式、衍生物、變體或片段。本發(fā)明還涉及包含至少一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，例如微生物宿主細(xì)胞。本發(fā)明尤其涉及本文公開的多肽或多核苷酸的抗體。在某些方面，所述抗體針對(duì) 至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69的多肽序列或其片段。在另一方面，所述抗體針對(duì)選自SEQ ID NO :74-142的多核苷酸的至少一個(gè)片段或其互補(bǔ)或修飾序列。在另一方面，所述抗體包 含與至少一種細(xì)胞抑制劑，例如本文詳述的抗-甲烷生成化合物(如，溴代乙磺酸)、抗體和 抗體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素產(chǎn)生的一種或多種融合物或偶聯(lián)物。本發(fā)明還涉及例如SEQ ID NO :1_69中至少一項(xiàng)的修飾的噬菌體多肽，其包括如本 文所述的生物學(xué)活性變化形式、片段、變體和衍生物。本發(fā)明還涉及例如針對(duì)SEQ ID NO 1-69中至少一項(xiàng)的修飾的抗體，其包括如本文所述的生物學(xué)活性變化形式、片段、變體和衍 生物。本發(fā)明還涉及編碼這些修飾多肽的多核苷酸，以及所公開多核苷酸的變化形式、片 段、變體和衍生物，包含這些多核苷酸的表達(dá)載體以及包含這些載體的宿主細(xì)胞。在具體方 面，本發(fā)明的組合物和方法使用這些修飾的多核苷酸或多肽，或?qū)?yīng)的表達(dá)載體或宿主細(xì)
5胞。此外，本發(fā)明涉及噬菌體多肽，如SEQ ID NO: 1-69中至少一種或其修飾序列，包括 與至少一種細(xì)胞抑制劑，如本文詳述的抗-甲烷生成化合物(如，溴代乙磺酸)、抗體和抗體 片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素形成的融合物或偶聯(lián)物。本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含分離多肽如SEQ ID N0:l-69中至少一種 或其修飾序列。本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物包含針對(duì)，例如SEQ ID NO: 1-69中至 少一種或其修飾序列的抗體。本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物包含分離的多核苷酸，如 SEQ ID N0:74-142中至少一種或其互補(bǔ)或修飾序列。本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物 包含本發(fā)明表達(dá)載體或本發(fā)明含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述組合物可包含本文所述生物 學(xué)活性變化形式、片段、變體和衍生物中的任何一種。所述組合物可包含至少一種細(xì)胞抑制 劑(如，作為融合物或偶聯(lián)物)并可配制成，例如，藥物組合物或食品補(bǔ)充劑，具體是反芻動(dòng) 物飼料組分。本發(fā)明還涉及作為按照所公開方法靶向和/或抑制微生物細(xì)胞，特別是產(chǎn)甲烷菌 細(xì)胞的試劑盒的一部分的本發(fā)明組合物。該試劑盒包括a)至少一種本文所列的組合物； 以及b)任選地包括，用其(例如)靶向細(xì)胞或抑制產(chǎn)甲烷菌或其他微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù) 制的使用說明書。本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生噬菌體的方法，所述方法包括a)在適合產(chǎn)生噬菌體條件下 培養(yǎng)表達(dá)載體或含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含噬菌體基因組的至少一部 分；以及b)從培養(yǎng)物中回收該噬菌體。在特定方面，該噬菌體包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:l-69或其修飾序列的多肽。在另一些方面，該噬菌體包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 74-142或其修飾序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生噬菌體多肽的方法，所述方法包括a)在適合多肽表達(dá)條 件下培養(yǎng)表達(dá)載體或含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含至少一種噬菌體多肽的 編碼序列的至少一部分；以及b)從培養(yǎng)物中回收該多肽。在特定方面，所述多肽包含至少 一個(gè)選自SEQ ID NO: 1-69或其修飾序列的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生噬菌體多肽的方法，該多肽如SEQ IDN0:1_69中至 少一種，包括與至少一種細(xì)胞抑制劑，如本文詳述的抗-甲烷生成化合物(如，溴代乙磺 酸)、抗體和抗體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素形成的融合物或偶聯(lián)物。 此類方法包括a)在適合多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)表達(dá)載體或包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所 述表達(dá)載體包含至少一種噬菌體多肽的編碼序列；b)形成噬菌體融合物或偶聯(lián)物(如，通 過表達(dá)融合序列或與細(xì)胞抑制劑化學(xué)偶聯(lián))；以及c)回收該融合物或偶聯(lián)物。在特定方面， 所述多肽包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 1-69或其修飾序列的氨基酸序列。此外，本發(fā)明涉及一種抑制微生物細(xì)胞(如抑制其生長(zhǎng)或復(fù)制)，具體是產(chǎn)甲烷菌 細(xì)胞的方法，該方法包括a)任選產(chǎn)生或分離至少一種噬菌體多肽；以及b)將所述細(xì)胞與 所述噬菌體多肽接觸。在一個(gè)特定方面，所述多肽包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:l-69或其 修飾序列的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還包括一種抑制微生物細(xì)胞(如抑制其生長(zhǎng)或復(fù)制)，具體是產(chǎn)甲烷 菌細(xì)胞的方法，該方法包括a)任選產(chǎn)生或分離至少一種噬菌體多肽，其還包含至少一種 細(xì)胞抑制劑；以及b)將所述細(xì)胞與所述噬菌體多肽接觸。在一個(gè)特定方面，所述多肽包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69或其修飾序列的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)和/或測(cè)定噬菌體水平或?qū)?yīng)的噬菌體多肽或多核苷 酸水平的方法，該方法包括1)將來自對(duì)象的樣品與抗體接觸，所述抗體針對(duì)噬菌體多肽 (如，SEQ ID NO 1-69中至少一種或其修飾序列)或?qū)?yīng)的多核苷酸；和2)檢測(cè)與樣品中 多肽或多核苷酸形成的抗體復(fù)合物的存在或水平。此類方法還可用于檢測(cè)和/或測(cè)定微生 物細(xì)胞，具體是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的水平。本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)和/或測(cè)定噬菌體水平或?qū)?yīng)的噬菌體多多核苷酸(如噬 菌體編碼序列)水平的方法，該方法包括1)將來自對(duì)象的樣品與互補(bǔ)多核苷酸(如與SEQ ID NO 74-142中任一項(xiàng)或其修飾序列互補(bǔ)的序列)接觸；以及2)測(cè)定與樣品中噬菌體多 核苷酸形成的雜交復(fù)合物的存在或水平。此類方法還可用于檢測(cè)和/或測(cè)定微生物細(xì)胞， 具體是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的水平。在特定方面，本發(fā)明的方法使用體內(nèi)或體外表達(dá)組件。在其它方面，本發(fā)明使用重 組、合成或半合成方法產(chǎn)生的多肽，或內(nèi)源性方法產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的其它方面和實(shí)施方式如下文所述。附圖簡(jiǎn)要說明用本發(fā)明特定實(shí)施方式和附圖作為參考對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。

圖1A-1B.反芻甲烷短桿菌原噬菌體(pmru，顯示推定整合位點(diǎn)序列attL和 attR(圖1A)和預(yù)測(cè)的噬菌體功能模塊和基因結(jié)構(gòu)(圖1B)。圖IC 用滅菌空氣(氧壓)進(jìn)行噬菌體誘導(dǎo)。圖ID 用絲裂霉素C對(duì)噬菌體進(jìn)行初始誘導(dǎo)。圖IE 誘導(dǎo)(氧氣刺激)和未誘導(dǎo)的反芻甲烷短桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝 膠電泳。第2和第4泳道英駿公司(Invitrogen)的Ikb DNA梯標(biāo)記物。第1和第3泳道 分別代表使用引物對(duì)R1F-L2R對(duì)分離自誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的反芻甲烷短桿菌培養(yǎng)物的DNA進(jìn)行 PCR的產(chǎn)物。圖2.原噬菌體cpmru開放閱讀框注釋和注解。圖3.原噬菌體(pmru開放閱讀框注釋、功能預(yù)測(cè)和注解。圖4A-4B.反芻甲烷短桿菌原噬菌體Pmni序列信息，包括噬菌體<pmru的編碼序列 (圖4A)和氨基酸序列(圖4B)。圖5.噬菌體Cpmru ORF 2058與馬爾堡甲燒桿菌(M. marburgensis)的PeiP和沃 氏甲烷桿菌(M-wolfeii)的PeiW的序列比對(duì)。圖6 使用LogoBar創(chuàng)建的來自反芻甲烷短桿菌的信號(hào)肽序列的蛋白質(zhì)序列標(biāo)識(shí)， 顯示了核心共有信號(hào)。圖7 :0RF2058對(duì)反芻甲烷短桿菌靜息細(xì)胞的抑制效應(yīng)。圖8 :0RF2058對(duì)反芻甲烷短桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)和甲烷產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式定義如本文所述，“改變的”編碼噬菌體多肽的核酸序列包括那些具有不同的核苷酸缺 失、插入或取代，得到優(yōu)選編碼相同或功能等同多肽的多核苷酸的核酸。編碼的多肽或抗體
7也可以是“改變的”，并包含氨基酸殘基的缺失、插入或取代，產(chǎn)生沉默改變并得到功能等同 的多肽。只要多肽的生物學(xué)活性(如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞通透或細(xì)胞裂解)或免疫學(xué)活性(如 一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn))得以保留，可在殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/ 或兩親特性相似的基礎(chǔ)上，有意進(jìn)行氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸可以包括天冬氨酸 和谷氨酸；帶正電的氨基酸可以包括賴氨酸和精氨酸；具有親水性值相似的不帶電極性頭 部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷胺酰胺， 絲氨酸和蘇氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。如本文所用“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其任何片段，并且指 天然產(chǎn)生的、重組的、合成或半合成的分子。本發(fā)明的序列包含至少5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、100、150、200、250 個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少 5-10、10-20、20-30、30-40、40_50、 50-100、100-150、150-200或200-250或250-4000個(gè)氨基酸，并且優(yōu)選保持原始序列的生 物學(xué)活性(如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞通透或細(xì)胞裂解)或免疫學(xué)活性(如一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合位 點(diǎn))。當(dāng)本文引用“氨基酸序列”指代天然產(chǎn)生多肽分子的氨基酸序列、氨基酸序列，以及類 似術(shù)語時(shí)，并不意于將氨基酸序列限制為與全長(zhǎng)分子相關(guān)的完整原始氨基酸序列。本文所用“擴(kuò)增”指產(chǎn)生核酸序列的其它拷貝，通常使用本發(fā)明熟知的聚合酶鏈反 應(yīng)(PCR)技術(shù)操作(Dieffenbach，C. W.和G. S. Dveksler (1995)《PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷 泉港出版社，紐約普萊恩維尤》(PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY))。
術(shù)語“抗體”應(yīng)理解為最廣泛的可能含義，并意于包含完整的單克隆抗體和多克隆 抗體。也意于覆蓋抗體片段和衍生物，只要其顯示生物學(xué)活性。抗體包括免疫球蛋白分子 和免疫球蛋白(Ig)分子的活性部分，即包含特異性結(jié)合抗原(與其免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合 位點(diǎn)的分子。這些包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fe、Fab、 Fab，和Fab2片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。抗體分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何種類，它們之間的差異在于分子中 重鏈的特性。它們也包括亞類，如IgGl、IgG2和其它。輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文提 到抗體時(shí)包括所有類、亞類和類型。還包括嵌合抗體，例如對(duì)于不止一種來源如一種或多種 小鼠、人或反芻動(dòng)物序列具有特異性的單克隆抗體或其片段。還包括羊駝抗體或納米抗體。 應(yīng)理解，本文中提到“抗體”或任何類似術(shù)語包括完整抗體，及其任何片段、變化形式、衍生 物或變體。如本文所用術(shù)語“生物學(xué)活性”或“功能性”指保持一種或多種結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)或生 物化學(xué)功能(如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞通透或細(xì)胞裂解)的多肽。本文所用術(shù)語“細(xì)胞抑制劑”或“抑制劑”指降低或阻礙微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲 烷菌細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制的試劑。細(xì)胞抑制劑可用于降低或阻礙如細(xì)胞分裂。抑制劑可減少或 阻斷例如DNA合成、RNA合成、蛋白質(zhì)合成或翻譯后修飾。抑制劑也可降低或阻斷參與甲烷 生成通路的酶的活性。抑制劑還可靶向細(xì)胞，以便免疫系統(tǒng)組件識(shí)別。抑制細(xì)胞還包括細(xì) 胞殺傷和細(xì)胞死亡，例如通過裂解、凋亡、壞死等實(shí)現(xiàn)。有用的抑制劑包括但不限于如本文 詳述的抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗體和抗體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽 和其他抗生素。本文所用術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指在允許的鹽和溫度條件下多核苷酸通過堿基配對(duì)自然結(jié)合。對(duì)于序列A-G-T，互補(bǔ)序列是T-C-A，反向互補(bǔ)是A-C-T而反向序列是 T-G-A0兩條單鏈分子間的互補(bǔ)性可以是部分的，即僅有一些核酸結(jié)合，或者為完全互補(bǔ)，即 當(dāng)單鏈分子間存在完全互補(bǔ)性時(shí)。核酸鏈間的互補(bǔ)程度對(duì)于核酸鏈間雜交的效率和強(qiáng)度有 顯著性影響。這對(duì)于依賴核酸鏈結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)以及PNA分子的設(shè)計(jì)和使用尤其重要。本文所用術(shù)語“衍生物”指噬菌體多肽的編碼核酸或與之互補(bǔ)的核酸的化學(xué)修飾 形式。此類修飾包括例如，用烷基、?；虬被〈鷼洹Ｔ趦?yōu)選方面，核酸衍生物編碼的多 肽保留天然分子的生物學(xué)或免疫學(xué)功能。衍生多肽是通過糖基化、peg化或任何相似過程修飾的多肽，它保留了其來源序列 的一種或多種生物學(xué)功能(如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞通透或細(xì)胞裂解)或免疫學(xué)功能。本文所用術(shù)語“同源”指一定程度的互補(bǔ)性?？梢允遣糠滞?即，1相同)或完 全同源(即，100%相同)。使用功能性術(shù)語“基本同源”指代至少部分抑制相同序列與靶核 酸雜交的部分互補(bǔ)序列?？稍诘蛧?yán)謹(jǐn)性條件下使用雜交實(shí)驗(yàn)(Southern或northern印跡， 溶液雜交等)檢驗(yàn)對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的抑制?；就吹男蛄谢螂s交探針在低 嚴(yán)謹(jǐn)性條件下將競(jìng)爭(zhēng)并抑制完全同源序列與靶序列的結(jié)合。這并不是說低嚴(yán)謹(jǐn)性條件允許 非特異性結(jié)合；低嚴(yán)謹(jǐn)性條件需要兩條序列的相互結(jié)合是特異性(選擇性)相互作用。如本文所用術(shù)語“雜交”指核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任何過程。本文所用“插入”或“加入”指對(duì)氨基酸或核苷酸序列進(jìn)行改變，與天然產(chǎn)生的分 子相比，導(dǎo)致加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸。本文所用“產(chǎn)甲烷菌”指產(chǎn)生甲烷氣體的微生物，包括甲烷短桿 菌(Methanobrevibacter)> 甲；^ 口耆熱桿菌(Methanothermobacter)> 甲；^ 微菌 (Methanomicrobium)、甲燒桿菌(Methanobacterium)禾口 甲燒乂V疊球菌(Methanosarcina)。 具體的產(chǎn)甲烷菌包括但不限于反芻甲烷短桿(Methanobrevibacter ruminantium)、史 氏甲燒短桿菌(Methanobrevibactersmithii)、酸個(gè)生甲燒短桿菌(Methanobrevibacter acididurans)、巢氏甲燒短桿菌(Methanobrevibacter thaueri)、布氏甲燒桿菌 (Methanobacterium bryantii) > ￥ St ￥ !^υ If lif (Methanobacterium formicicum) > 馬爾堡甲燒嗜熱桿菌(Methanothermobacter marburgensis)、沃氏甲燒嗜熱桿菌 (Methanothermobacter wolfeii)、 f 氏甲;求(Methanosphaerastadtmanae) ￥ 燒微菌(Methanomicrobium mobile)、巴氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina barkeri)、梅氏 甲燒W疊球菌(Methanosarcina mazei)、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoides burtonii) 和泰氏甲烷葉菌(Methanolobustaylorii)。所有產(chǎn)甲烷菌的屬和種均在此術(shù)語涵蓋范圍 內(nèi)。本文所用“微生物細(xì)胞”指天然產(chǎn)生或遺傳修飾的微生物細(xì)胞，包括古細(xì)菌如產(chǎn)甲 烷菌、嗜鹽微生物和嗜酸嗜熱菌，以及真細(xì)菌，如藍(lán)藻、螺旋體、變形細(xì)菌以及革蘭陽性和革 蘭陰性細(xì)菌。術(shù)語“修飾的”指如本文所述的更改的序列和序列片段、變體和衍生物。本文所用“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸序列、寡核苷酸或其片段，以 及天然、重組、合成或半合成來源的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈，并可代表正義或 反以鏈以及編碼或非編碼區(qū)。本發(fā)明的序列最優(yōu)選包括包含至少12、15、30、45、60、75、 90、105、120、135、150、300、450、600、750 個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少 15-30、30-60、60-90、90_120、
9120-150,150-300,300-450,450-600或600-750個(gè)核苷酸或至少1000個(gè)核苷酸或至少 1500個(gè)核苷酸的多肽編碼序列。應(yīng)理解的是本文中每一處提及“核酸序列”或“核苷酸序 列”將包括原始、全長(zhǎng)序列，及其任何互補(bǔ)序列、片段、變化形式、衍生物或變體。術(shù)語“寡核苷酸”指包含至少6、8、10、12、15、18、21、25、27、30或36個(gè)核苷酸或至 少12-36個(gè)核苷酸或至少15-30個(gè)核苷酸的核酸序列，可用于例如PCR擴(kuò)增、測(cè)序或雜交實(shí) 驗(yàn)。如本文所用，“寡核苷酸”基本等同于“擴(kuò)增物”、“引物”、“寡聚物”、“寡核苷酸”以及“探 針”，如本領(lǐng)域通常定義的那樣。本文所用“多肽”指本發(fā)明的分離多肽，其獲自任何物種，優(yōu)選微生物，以及任何 天然、合成、半合成或重組的來源。具體說，噬菌體多肽可獲自產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞，如甲烷短桿 菌(Methanobrevibacter)細(xì)胞，具體是反芻甲烷短桿菌或史氏甲烷短桿菌細(xì)胞。對(duì)于 重組產(chǎn)生，本發(fā)明多肽可獲自微生物或真核細(xì)胞，例如大腸桿菌(Escherichia)、鏈球菌 (Str印tomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)、沙門菌(Salmonella)、酵母、昆蟲細(xì)胞如果蠅細(xì) 胞、動(dòng)物細(xì)胞如COS和CHO細(xì)胞或植物細(xì)胞。應(yīng)理解的是本文中每一處提及“多肽”將包括 原始、全長(zhǎng)序列，及其任何片段、變化形式、衍生物或變體。本文中所用單數(shù)或復(fù)數(shù)形式的術(shù)語“多核苷酸” 一般指任何核酸序列，例如，任何 聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA，或者修飾的RNA或DNA。 包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)的DNA，單鏈和雙鏈RNA以及包括單鏈和 雙鏈區(qū)的RNA，包含DNA和RNA的雜交分子(可為單鏈或(更典型的)雙鏈或包含單鏈和雙 鏈區(qū))。也包括含有RNA或DNA或者RNA和DNA的三鏈區(qū)。具體說，包括mRNA、cDNA和基因 組DNA及其任何片段。該術(shù)語包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基如含氚堿基或非常見堿基如肌 苷的DNA和RNA。本發(fā)明的多核苷酸可涵蓋編碼或非編碼序列，或正義或反義序列或iRNA 如siRNA。應(yīng)理解的是本文中每一處提及“多核苷酸”或類似術(shù)語將包括全長(zhǎng)序列，及其任 何互補(bǔ)序列、片段、變化形式、衍生物或變體。本文所用“肽核酸”或“PNA”指反義分子或抗_基因試劑，其包含通過肽主鏈連接 的堿基。本文所用術(shù)語“反芻動(dòng)物”指具有瘤胃作為特殊類型消化器官的動(dòng)物。反芻動(dòng)物 包括但不限于牛、綿羊、山羊、水牛、麋鹿、羚羊、北美馴鹿和鹿。本文所用術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”或“嚴(yán)謹(jǐn)性”指核酸、鹽和溫度限定的雜交條件。這些條 件為本領(lǐng)域所熟知，可更改這些條件以鑒定或檢測(cè)相同或相關(guān)的多核苷酸序列。參見例如 Sambrook, J.等(1989)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤(Molecular Cloning, A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY),以及Ausubel, F. Μ.等(1989)新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，約翰韋利森出版社，紐約(CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,New York，NY)。數(shù)種包含低或高嚴(yán)謹(jǐn)性的相等條件 取決于以下因素，如序列的長(zhǎng)度和特性(DNA、RNA、堿基組成)、靶點(diǎn)特性(DNA、RNA、堿基組 成)、環(huán)境(在溶液中或固定于固體基材上)、鹽和其它成分(如甲酰胺、硫酸右旋糖苷和/ 或聚乙二醇)的濃度和反應(yīng)溫度(從低于探針解鏈溫度5°C至低于解鏈溫度約20°C -25°C 的范圍內(nèi))?？筛淖円环N或多種因素以產(chǎn)生不同于或等同于上述條件的低或高嚴(yán)謹(jǐn)性。術(shù)語“對(duì)象”包括人或非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括但不限于鳥類和哺乳動(dòng)物，如反 芻動(dòng)物，具體是小鼠、兔、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛和馬。
本文所用術(shù)語“基本純化”或“分離”指從細(xì)胞、重組或合成環(huán)境中移出的核酸或氨 基酸序列，并且至少至少60%，優(yōu)選75%并最優(yōu)選至少90%或至少99%不含它們?cè)诩?xì)胞、 重組或合成環(huán)境中相關(guān)聯(lián)的其它組分。本文所定義“轉(zhuǎn)化”指外源DNA進(jìn)入并改變接受細(xì)胞的過程?？墒褂帽绢I(lǐng)域所熟知 多種方法在天然或人工條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可依賴將外源核酸序列插入原核或真核宿主 細(xì)胞的任何已知方法。基于需轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞類型選擇方法，可包括但不限于病毒感染、電 穿孔、熱休克、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。此類“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中插入的DNA 能夠作為自主復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w的一部分進(jìn)行復(fù)制。它們還包括在限定時(shí)間期間 瞬時(shí)表達(dá)插入的DNA或RNA的細(xì)胞。如本文所用多肽“變體”指一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的氨基酸序列。改變變體多核 苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。變體可導(dǎo)致“保守性”改變，其中取代的氨基酸具有相似結(jié)構(gòu)或 化學(xué)特性，如用異亮氨酸取代亮氨酸。更少見的，變體可導(dǎo)致“非保守性”變化，如用色氨酸 替換甘氨酸。類似的小變異還可包括氨基酸缺失或插入或兩者均有。使用本領(lǐng)域熟知計(jì)算 機(jī)程序如LASERGENE軟件(DNASTAR)可發(fā)現(xiàn)如何確定可對(duì)哪一氨基酸取代、插入或缺失而 不破壞生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指南。本發(fā)明還涵蓋保留多肽的至少一種生物學(xué)活性(如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞通透或細(xì)胞裂 解)或免疫學(xué)活性的變體。優(yōu)選的變體是具有基本相同或功能等同序列的變體，例如與公 開序列至少80%和更優(yōu)選至少90%序列相同的變體。最優(yōu)選的變體是與本文公開序列 至少95%，至少97%，至少98%，至少99%，至少99. 5%，至少99. 8%或至少99. 9%序列 相同的變體。如下所述通過對(duì)需比較的兩條序列比對(duì)、確定比對(duì)部分的相同殘基數(shù)目、除 以本發(fā)明(查詢)序列總殘基數(shù)并乘以100，從而確定相同性百分?jǐn)?shù)。有用的比對(duì)程序是 AlignX (載體 NTI)。發(fā)明詳述甲烷在反芻動(dòng)物前腸中由產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生，它是瘤胃系統(tǒng)中碳的終末還原產(chǎn) 物。已對(duì)甲烷產(chǎn)生通路的多個(gè)步驟進(jìn)行了闡述，主要來自于對(duì)非瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究， 但是尚不了解對(duì)于使產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中生長(zhǎng)和持續(xù)存在的適應(yīng)性。反芻甲烷短桿菌 (Methanobrevibacter ruminantium)是新西蘭反芻動(dòng)物體內(nèi)主要的產(chǎn)甲燒菌。如本文所 述，已經(jīng)對(duì)反芻甲烷短桿菌的基因組進(jìn)行測(cè)序，顯示大小約3. 0Mb，GC含量為33. 68%。一 個(gè)出乎意料的發(fā)現(xiàn)是反芻甲烷短桿菌基因組包括原噬菌體序列(稱為(pmru )，該序列具有 編碼噬菌體整合、DNA復(fù)制和包裝、衣殼蛋白質(zhì)、裂解和溶原性轉(zhuǎn)換功能的獨(dú)特功能模塊。在進(jìn)行高通量測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)基因組的30_40kb區(qū)域在測(cè)序克隆中過度出現(xiàn)，因此 發(fā)現(xiàn)反芻甲烷短桿菌噬菌體。這表明基因組的一部分以高于通常水平的拷貝數(shù)出現(xiàn)，這可 能歸因于駐留噬菌體的復(fù)制。對(duì)過度出現(xiàn)的區(qū)域進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)開放閱讀框的詳細(xì)生物信 息學(xué)分析表明它含有噬菌體樣基因。已證明噬菌體序列(溶原性轉(zhuǎn)換)遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)的低GC 區(qū)含有預(yù)測(cè)的DNA硫修飾系統(tǒng)(dnd)，它可能為宿主或外源DNA的提供其它修飾。本文詳述 了反芻甲烷短桿菌原噬菌體序列。在本發(fā)明的不同方面，可以使用原噬菌體多核苷酸和多 肽作為在瘤胃中抑制產(chǎn)甲烷菌和/或甲烷生成的手段，并進(jìn)一步闡明反芻甲烷短桿菌在甲 烷形成中的作用。因此，本發(fā)明包括噬菌體多肽，包括含有至少SEQ ID NO :1_69中至少一種或其片
11段、變體和衍生物的那些多肽。本發(fā)明還包括這些多肽在靶向和抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn) 甲烷菌細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括該多肽在抑制此類細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制中的應(yīng)用?？杀磉_(dá) 本發(fā)明的多肽并用于不同的實(shí)驗(yàn)以測(cè)定其生物學(xué)活性。該多肽可用于大規(guī)模合成和分離實(shí) 驗(yàn)方案，例如，用于商業(yè)生產(chǎn)?？墒褂么祟惗嚯漠a(chǎn)生抗體，以分離相應(yīng)的氨基酸序列和對(duì)氨 基酸序列水平進(jìn)行定量測(cè)定。本發(fā)明的多肽還可用作組合物，例如藥物組合物和食品補(bǔ)充 劑，如反芻動(dòng)物飼料組分。本發(fā)明的多肽還具有健康益處。在健康相關(guān)方面，產(chǎn)甲烷菌抑制 劑可用于恢復(fù)通常以甲烷形式從個(gè)體流失的能量。在特定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發(fā)明 的多肽和組合物(如藥物組合物和食品補(bǔ)充劑)聯(lián)用。本發(fā)明多肽包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含至少一個(gè)選自SEQID NO 1-69或其片段、變體或衍生物的氨基酸序列的多肽；(b)包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69和其片段、變體的氨基酸序列的功能性結(jié)構(gòu)域的多肽；以及(c)包含的選自SEQ ID NO :1-69或其變體或衍生物的至少一個(gè)氨基酸序列的至少一定數(shù)目的毗連殘基的多肽。在 一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO :1-69中至少一個(gè)氨基酸序列的分離的多肽。 所有這些序列統(tǒng)稱本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還包括編碼至少一種噬菌體多肽，包括SEQ ID NO 1_69及其片段、變體和 衍生物的多核苷酸。本發(fā)明還包括這些多核苷酸在制備靶向和抑制微生物細(xì)胞尤其是產(chǎn)甲 烷菌細(xì)胞的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括多核苷酸在抑制此類細(xì)胞生長(zhǎng)或 復(fù)制中的應(yīng)用。本發(fā)明的分離的多核苷酸還可用于對(duì)或多或少的相關(guān)噬菌體進(jìn)行基因組作 圖、物理作圖和基因克隆。通過本領(lǐng)域熟知技術(shù)如狹縫印跡技術(shù)或微陣列技術(shù)，可使用根據(jù) 本發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)的探針在細(xì)胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何生物體中檢測(cè)基 因的存在和表達(dá)模式。使用本發(fā)明多核苷酸設(shè)計(jì)的引物可用于測(cè)序和PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的 多核苷酸還可用作組合物，例如藥物組合物和食品補(bǔ)充劑，如，反芻動(dòng)物飼料組分。本發(fā)明 的多核苷酸還具有健康益處。對(duì)于此類益處，多核苷酸可作為表達(dá)載體或含表達(dá)載體的宿 主細(xì)胞提供。在特定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發(fā)明的多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞和組合物 (如藥物組合物和食品補(bǔ)充劑)聯(lián)用。本發(fā)明多核苷酸包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列的序列；(b)至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列的互補(bǔ)序列、反向序列以及反向互補(bǔ)序列； (c)至少一個(gè)選自SEQ ID NO :1-69或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列中所含的開 放閱讀框；(d)至少一個(gè)選自SEQ ID NO :1_69或其片段或變體的氨基酸序列的編碼序列的 功能性結(jié)構(gòu)域；以及(e)含有至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 1-69或其變體的氨基酸序列的編 碼序列的至少一定數(shù)目的毗連殘基的序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1-69的氨基酸序列的編碼序列的分離多核苷酸。本發(fā)明多核苷酸包含選自下組的至少一個(gè)序列(a)包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 74-142或其片段或變體的核酸序列的序列；(b)至少一個(gè)選自SEQ ID NO :74_142或其 片段或變體的核酸序列的編碼序列的互補(bǔ)序列、反向序列以及反向互補(bǔ)序列；(c)選自SEQ ID NO :74-142或其片段或變體的核酸序列中所含的開放閱讀框；(d)至少一個(gè)選自SEQ ID NO :74-142或其片段或變體的核酸序列的編碼序列的功能性結(jié)構(gòu)域；以及(e)含有至少一 個(gè)選自SEQ ID NO :74-142或其變體的核酸序列的至少一定數(shù)目的毗連殘基的序列。還提供獲自任何公開序列的寡核苷酸探針和引物及其變體。所有這些多核苷酸和寡核苷酸在本 文中統(tǒng)稱為本發(fā)明的多核苷酸。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，可產(chǎn)生大量本 發(fā)明多肽的編碼核苷酸序列，其中某些序列與任何已知和天然產(chǎn)生的基因的核苷酸序列同 源性很小。因此，本發(fā)明考慮到各個(gè)和每個(gè)可能的核苷酸序列變異，這些變異可通過根據(jù)可 能密碼子選擇密碼子組合而產(chǎn)生。根據(jù)應(yīng)用于天然產(chǎn)生的氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌三聯(lián)遺傳 密碼產(chǎn)生這些組合，所有此類變異都被視作已具體公開。編碼噬菌體多肽或其片段或變體的核苷酸序列優(yōu)選在適當(dāng)選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能 夠與天然產(chǎn)生序列的核苷酸序列雜交。然而，具有優(yōu)勢(shì)的是產(chǎn)生編碼多肽或其片段或衍生 物的、具有明顯不同密碼子使用的核苷酸序列。根據(jù)宿主使用特定密碼子的頻率，可選擇密 碼子以提高特定原核或真核宿主中的多肽表達(dá)速率。例如，按照已知方法，可根據(jù)大腸桿菌 表達(dá)優(yōu)化密碼子。改變多肽及其衍生物的編碼核苷酸序列而不改變編碼的氨基酸序列的其 它原因包括產(chǎn)生具有更有利特性，如比天然產(chǎn)生序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物具有更長(zhǎng)半衰期的RNA 轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明還包括完全通過合成化學(xué)產(chǎn)生編碼多肽或其片段或變體的DNA序列或其 片段。在合成序列產(chǎn)生后，利用本領(lǐng)域熟知試劑，可將其插入到任何可用的表達(dá)載體和細(xì)胞 系統(tǒng)中。而且，可使用合成化學(xué)在編碼多肽或其任何變體或片段的序列中引入突變。本發(fā)明 還包括在如 Wahl，G. M 和 S. L. Berger (1987 ；Methods Enzymo 1. 152 399-407)以及 Kimmel， A.R. (1987 ；Methods Enzymo 1. 152 :507_511)所教導(dǎo)的各種嚴(yán)謹(jǐn)條件下，能與要求權(quán)利的 核苷酸序列雜交的多核苷酸序列，尤其是SEQ ID N0:74-149中顯示的那些及其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域熟知并常用的DNA測(cè)序方法可用于實(shí)踐本發(fā)明的任何實(shí)施方式。這類方法 可使用如DNA聚合酶I的克列諾片段，SEQUENASE (美國(guó)生物化學(xué)集團(tuán)(U. S. Biochemical Corp.)，俄亥俄州克里富蘭)(U. S. BiochemicalCorp, Cleveland, OH)，Taq 聚合酶(珀金 埃爾默MPerkin Elmer)，熱穩(wěn)定T7聚合酶(安法馬西亞生物技術(shù)公司，新澤西州皮斯 卡塔韋)(AmershamPharmacia Biotech Piscataway, NJ)，或者聚合酶和校對(duì)核酸外切酶 的組合，如生命技術(shù)公司(Life Technologies)(馬里蘭州蓋瑟斯堡)銷售的EL0NGASE 擴(kuò)增系統(tǒng)中找到的那些。優(yōu)選地，該方法通過機(jī)器自動(dòng)化進(jìn)行，如漢密爾頓微型實(shí)驗(yàn)室 2200 (Hamilton Micro Lab 2200)(內(nèi)華達(dá)州雷諾漢密爾頓)(Hamilton，Reno，NV)，派而特 熱循環(huán)儀(Peltier Thermal Cycler) (PTC200 ;MJ 研究公司，麻省沃特敦)(MJ Research, Watertown, ΜΑ) ；ABI催化儀(ABI Catalyst)以及373和377DNA測(cè)序儀(珀金埃爾默) (Perkin Elmer)或基因組測(cè)序儀20 (羅氏診斷公司)(Roche Diagnostics)?？墒褂貌糠趾塑账嵝蛄胁⒗帽绢I(lǐng)域所知檢測(cè)上游序列如啟動(dòng)子和調(diào)控元件以 及下游元件如終止子和非編碼RNA結(jié)構(gòu)的方法，對(duì)多肽的編碼核酸序列進(jìn)行擴(kuò)展。例如， 可使用的一種方法“位點(diǎn)限制性”PCR使用通用引物以獲取與已知基因座相鄰的未知序列 (Sarkar, G. (1993)PCR MethodsApplic. 2 :318_322)。具體說，在接頭序列引物和已知區(qū)域 特異性引物存在的條件下對(duì)基因組DNA進(jìn)行首次擴(kuò)增。然后對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行第二輪PCR，其 中使用相同的接頭引物和在第一引物內(nèi)的另一特異性引物。用合適的RNA聚合酶對(duì)每一輪 PCR產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行測(cè)序。另一個(gè)有用的方法是反向PCR，也稱為IPCR(參見例如，Ochman H，Gerber AS,
13Hartl DL. Genetics. 1988 年 11 月；120 (3) :621_3)。當(dāng)僅知道靶 DNA 的一個(gè)內(nèi)部序列時(shí)， 可使用反向PCR。反向PCR方法包括使用限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA進(jìn)行一系列消化和 自連。此種切割在未知序列的任一末端產(chǎn)生已知序列。按照該方法，通過限制性核酸內(nèi)切 酶消化將靶DNA輕微切割成數(shù)千堿基的較小片段。然后在低濃度下誘導(dǎo)自連，引起磷酸主 鏈重新形成并產(chǎn)生環(huán)狀DNA連接產(chǎn)物。然后用已知核酸內(nèi)切酶限制性消化靶DNA。由此在 已知內(nèi)部序列內(nèi)產(chǎn)生切割，產(chǎn)生具有已知末端序列的線性產(chǎn)物。然后可利用該產(chǎn)物和與已 知內(nèi)部序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR。市售毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可用于分析測(cè)序或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列的大小或?qū)ζ溥M(jìn) 行確認(rèn)。具體說，毛細(xì)管測(cè)序可使用可流動(dòng)聚合物進(jìn)行電泳分離，激光激發(fā)的四種不同熒光 染料(每種對(duì)應(yīng)一種核苷酸)，用電荷耦合器件照相機(jī)探測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)。使用合適的軟件(如 基因組分型和序列導(dǎo)航者,珀金埃爾默公司)(GENOTYPER and Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer)可將輸出/光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從上樣到計(jì)算機(jī)分析和電子數(shù)據(jù)顯示均可在計(jì)算 機(jī)控制下進(jìn)行。毛細(xì)管電泳尤其優(yōu)選用于對(duì)特定樣品中少量存在的小片段DNA進(jìn)行測(cè)序。近年來，焦磷酸測(cè)序成為一種有用的測(cè)序方法。參見例如Ronaghi，M.等1996. 通過探測(cè)焦磷酸釋放進(jìn)行實(shí)時(shí)DNA測(cè)序(Real-time DNAsequencing using detection of pyrophosphate release). Anal. Biochem. 242 84~89 ；Ronaghi, Μ.等 1998. ■于實(shí) 時(shí)焦憐酸的測(cè)序方法(A sequencingmethod based on real-time pyrophosphate). Science 281 :363_365 ；Ronaghi,M.等 1999.通過焦磷酸測(cè)序分析DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)(Analyses of secondarystructures in DNA by pyrosequencing). Anal. Biochem. 267 65-71 ； Ronaghi2001. Genome Res. 11 卷，1 期，3-11 ；Nyren,焦磷酸測(cè)序歷史(The historyof pyrosequencing). Methods Mol Biol. 2007 ；373 1-14。焦磷酸測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確、靈活、平 行處理并容易自動(dòng)化.而且，該技術(shù)擯棄了對(duì)標(biāo)記引物、標(biāo)記核苷酸和凝膠電泳的需要。根 據(jù)該方法，聚合酶催化將核苷酸摻入核酸鏈。摻入的結(jié)果是焦磷酸分子釋放并由硫酸化酶 轉(zhuǎn)化為ATP。螢光素酶反應(yīng)產(chǎn)生光，其間螢光素分子被氧化。在加入每種核苷酸后，進(jìn)行洗 滌步驟以允許反復(fù)添加。核苷酸降解酶持續(xù)降解核苷酸從而允許加入后續(xù)核苷酸。已經(jīng)成 功將焦磷酸測(cè)序作為平臺(tái)用于大規(guī)模測(cè)序，包括基因組和巨大基因組分析(參見例如，來 自454羅氏生命科學(xué)(Life Sciences/Roche)的基因組測(cè)序儀FLX )。研發(fā)SOLiD 系統(tǒng)用于測(cè)序(參見例如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，SOLiD 系統(tǒng)應(yīng)用說 明書，加州福斯特城)(Applied Biosystems. Application Fact Sheetfor the SOLiD System. Foster City，CA)。該方法基于將染料標(biāo)記的寡核苷酸依次連接于磁珠連接的克隆 擴(kuò)增DNA片段。在該方法中，通過測(cè)量連續(xù)連接產(chǎn)生DNA序列。連接反應(yīng)基于探針識(shí)別而 非依次加入，因此不易于累計(jì)錯(cuò)誤?；瘜W(xué)性質(zhì)大大減少了錯(cuò)誤插入或缺失的可能性。連接 步驟和用磷酸酶處理未連接探針能防止移相。此外，經(jīng)歷7個(gè)循環(huán)的連接后，原始引物從模 板上脫離，新引物雜交以開始對(duì)n-1位置的查詢。使用這種“重置”相允許降低系統(tǒng)性噪聲 并允許更長(zhǎng)的閱讀長(zhǎng)度。此外，使用兩堿基編碼以區(qū)分測(cè)量誤差與真正的多態(tài)性。單一位 點(diǎn)的改變被鑒定為隨機(jī)誤差，并在數(shù)據(jù)分析中可被軟件去除。作為分析平臺(tái)，SOLiD 系統(tǒng)可 應(yīng)用于大規(guī)模測(cè)序，數(shù)字基因表達(dá)，ChIP和甲基化研究，并在探測(cè)基因組變異上尤其有用。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，編碼多肽的多核苷酸或其片段可用于重組DNA分子 以在合適宿主細(xì)胞中指導(dǎo)多肽或其片段或變體的表達(dá)。由于遺傳編碼的固有簡(jiǎn)并性，可產(chǎn)
14生編碼基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，這些序列可用于克隆和表達(dá)噬 菌體多肽?？墒褂帽绢I(lǐng)域通常所知方法對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列進(jìn)行工程改造以根據(jù)多種原 因改變氨基酸編碼序列，包括但不限于為了改變克隆、加工和/或基因產(chǎn)物表達(dá)而進(jìn)行的 變化?？墒褂猛ㄟ^隨機(jī)片段化進(jìn)行的DNA改組以及對(duì)基因片段和合成寡核苷酸的PCR組裝 對(duì)核苷酸序列進(jìn)行工程改造。例如，可使用定位誘變插入新的限制性位點(diǎn)，改變糖基化形 式，改變密碼子偏好，引入突變等等。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可將天然、修飾或重組的編碼多肽的核酸序列連接 至異源序列以編碼融合蛋白。例如，編碼可被市售抗體識(shí)別的嵌合序列可能是有用的。也 可工程改造融合蛋白使其在本發(fā)明的多肽和異源蛋白序列間含有切割位點(diǎn)，以便于切割并 純化該多肽，與異源部分分離。在另一實(shí)施方式中，可使用本領(lǐng)域熟知化學(xué)方法合成完整或部分形式的多肽編碼 序列(參見 Caruthers，Μ. H.等(1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223，Horn, Τ.等 (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232)?；蛘?，可使用合成氨基酸序列或其片段的化 學(xué)方法產(chǎn)生多肽本身。例如，可使用多種固相合成技術(shù)(Roberge，J. Y.等(1995) Science 269 -.202-204 ；Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :2149_2154)進(jìn)行多肽合成，使用 例如ABI 431A肽合成儀(珀金埃爾默公司)進(jìn)行自動(dòng)合成?？捎没瘜W(xué)方法合成多肽的各 種片段，并用化學(xué)方法組合產(chǎn)生全長(zhǎng)分子?？捎弥苽湫透咝б合嗌V分離新合成的多肽(如，Creight0n，T. (1983)蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)和分子原則，WH富瑞曼公司，紐約(Proteins Structures andMolecular Principles,WH Freeman and Co. ,New York，NY))。通過氨基酸分析和測(cè)序可確認(rèn)合成多肽的組成(如，埃 得曼降解步驟(Edman degradationprocedure ；Creighton)，同上)。此外，多肽或其任何部 分的氨基酸序列可在直接合成中更改和/或通過化學(xué)方法與來自其它蛋白質(zhì)或其部分的 序列組合以產(chǎn)生變體分子。為了表達(dá)生物學(xué)活性多肽，可將編碼多肽或功能等同物的核苷酸序列插入合適的 表達(dá)載體，即包含插入序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需元件的載體。可用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的 方法構(gòu)建包含多肽編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。Sambrook, J.等(2001)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤 (Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress, Plainview,NY), 以及Ausubel，F(xiàn). M.等(2007)新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，約翰韋利森出版社，紐約(Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley&Sons，New York, NY)述?？墒褂枚喾N表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)包含并表達(dá)本發(fā)明多肽的編碼序列。它們包括但 不限于微生物體如重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 的酵母；病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；病毒表達(dá)載體(如，花椰菜花 葉病毒CaMV ；煙草花葉病毒TMV)或細(xì)菌表達(dá)載體(如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。對(duì)于細(xì)菌，有用的質(zhì)粒包括英駿公司(Invitrogen)的pET、pRSET、 pTrcHis2和pBAD質(zhì)粒；諾瓦基公司(Novagen)的pET和ρ⑶F質(zhì)粒以及西格瑪奧德里奇公 司(Sigma-Aldrich)的Director 質(zhì)粒。對(duì)于產(chǎn)甲烷菌，有用的質(zhì)粒包括但不限于ρΜΕ2001、PMV15和pMPl。具體說，可將大腸桿菌(Escherichiacoli)與表達(dá)載體pET—起使用。所 用表達(dá)載體或宿主細(xì)胞并不限制本發(fā)明?！翱刂圃焙汀罢{(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)-增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5'和3'非翻譯 區(qū)一它們與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件的強(qiáng)度和特異性可能不 同。根據(jù)所使用載體系統(tǒng)和宿主，可使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)克隆進(jìn)細(xì)菌系統(tǒng)時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如BLUESCRIPT噬菌粒 (司查塔基公司，加州拉霍亞)(Stratagene, LaJolla, CA)或ρSPORTl質(zhì)粒(生命技術(shù)公 司)(Life Technologies)的雜交IacZ啟動(dòng)子等?？稍诶ハx細(xì)胞中使用桿狀病毒多角體蛋 白啟動(dòng)子。可將來源于植物細(xì)胞基因組(如，熱休克、RUBISC0和存儲(chǔ)蛋白質(zhì)基因)的啟動(dòng) 子或增強(qiáng)子或來自于植物病毒的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(如病毒啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列)克隆到載體 中。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)多肽的指定應(yīng)用對(duì)許多表達(dá)載體進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)需要大 量多肽時(shí)，可使用指導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白的載體。此類載體包括但不限于多 功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體如BLUESCRIPT(司查塔基公司)，其中可將多肽編碼序列連 接入載體，與β _半乳糖苷酶的氨基末端Met和后續(xù)7個(gè)殘基在相同讀框內(nèi)，從而產(chǎn)生雜合 蛋白；pIN 載體(Van Heeke, G.和 S. Μ· Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264 :5503_5509)等。也可采用pGEX載體(普洛麥格公司，威斯康星州麥迪遜)(Promega，Madison, WI)表達(dá)多肽與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這類融合蛋白可溶，并 容易通過以下方法由裂解細(xì)胞純化吸附于谷胱甘肽瓊脂糖珠上，然后在游離谷胱甘 肽的存在下洗脫?？稍O(shè)計(jì)此類系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以使其包含肝素、凝血酶或Xa因子 蛋白酶切割位點(diǎn)，從而使感興趣的克隆多肽可按需從GST部分釋放出來。在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中，可使用包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多種載體，如α因 子、醇氧化酶禾口 PGH0 參見 Ausubel 等(同上)和 Grant 等(1987)Methods Enzymo 1. 153 516-544的綜述。也可使用特異性起始信號(hào)達(dá)到更有效的翻譯本發(fā)明多肽編碼序列的目的。此類信 號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子和相鄰序列。當(dāng)多肽編碼序列、其起始密碼子和上游序列插入到合 適表達(dá)載體的情況下，無需另外的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)僅插入編碼序列或其片段 時(shí)，需提供外源的翻譯控制信號(hào)包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子應(yīng)當(dāng)位于正確的閱 讀框中，以保證完整插入物的翻譯。外源翻譯控制元件和起始密碼子可有多種天然或合成 來源。通過包括適合所用特定細(xì)胞體系的增強(qiáng)子可增強(qiáng)表達(dá)效率，如文獻(xiàn)中所述(Scharf， D.等，(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 125-162) 此外，可根據(jù)宿主細(xì)胞株調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或以所期望的方式加工表達(dá)多肽的 能力對(duì)其進(jìn)行選擇。此類序列的修飾包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化 和?；Ｒ部墒褂们懈疃嚯摹扒绑w”形式的翻譯后加工以利于正確的插入、折疊和/或 功能?？蓮拿绹?guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(馬里蘭州貝塞斯達(dá))(American Type Culture Collection(ATCC ；Bethesda, MD)獲取具有特定細(xì)胞機(jī)器或翻譯后活性的特征性機(jī)制的 不同宿主細(xì)胞，選擇以保證正確的序列修飾和加工。具體宿主細(xì)胞包括但不限于產(chǎn)甲 烷菌細(xì)胞，如產(chǎn)甲烷短桿菌細(xì)胞，具體說，反芻甲烷短桿菌或史氏甲烷短桿菌細(xì)胞。感興 趣的宿主細(xì)胞還包括例如，紅酵母(Rhodotorula)、短梗霉菌(Aureobasidium)、釀酒酵母(Saccharomyces)、擲孢酵母(Sporobolomyces)、假單胞菌(Pseudomonas)、歐文氏菌 (Erwinia)和黃桿菌(Flavobacterium)；或其它此類有機(jī)體如埃希菌(Escherichia)、乳酸 桿菌(Lactobacillus)、芽胞桿菌(Bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)等。特定的宿主細(xì) 胞包括尤其適于本發(fā)明使用的大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、蘇云金芽 包桿菌(Bacillus thuringiensis)、才古草芽 包桿菌(Bacillus subtilis)、變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)等。數(shù)種技術(shù)可將核酸引入體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中。它們包括化學(xué)方法(Feigner等， Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 84 74137417 (1987) ；Bothwell 等，真核基因克隆和分析方法 (Methods for Cloning and Analysis ofEukaryotic Genes)，編，約翰和巴特勒出版公司， 麻省波士頓(Jones andBartlett Publishers Inc.，Boston, Mass. ) (1990) ；Ausubel 等， 分子生物學(xué)簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)方案(Short Protocols in Molecular Biology)，約翰韋利森公司， 紐約(JohnWiley and Sons, New York, NY) (1992)；以及 Farhood，Annal· NY Acad. Sci.， 716 :2334 (1994))，使用原生質(zhì)體(Bothwell，同上)或電脈沖(Vatteroni 等，Mutn. Res.， 291:163169(1993) ；Sabelnikov, Prog.Biophys. Mol. Biol. ,62 119 152(1994) ；Bothwell 等，同上；以及Ausubel等，同上)，使用減毒病毒(Davis等，J.Virol. 1996，70 (6)，3781 3787 ；Brinster 等 J.Gen. Virol. 2002,83(Pt 2)，369 381 ；Moss, Dev. Biol. Stan. ,82 55 63(1994)；以及Bothwell等，同上)，以及物理方法(Fynan等，同上Johnston等，Meth. Cell Biol. ,43 (PtA) 353 365(1994) ；Bothwell 等，同上；以及 Ausubel 等，同上)?？赏ㄟ^以下方法將核酸成功遞送至動(dòng)物組織使用陽離子脂質(zhì)體(Watanabe等， Mol. Reprod. Dev. ,38 268 274(1994))，直接將裸露的DNA或RNA注射入動(dòng)物肌肉組織 (Robinson 等，Vacc.，11 957 960(1993) ；Hoffman 等，Vacc. 12 1529 1533(1994) ；Xiang 等，Virol.，199 :132 140(1994) ；Webster 等，Vacc.，12 1495 1498(1994) ；Davis 等， Vacc. , 12 1503 1509(1994) ；Davis 等，Hum. Molec. Gen.，2 1847 1851(1993) ；Dalemans 等，AnnNY Acad. Sci. 1995，772，255 256. Conry 等，Cancer Res. 1995，55 (7)，1397-1400) 和胚胎(Naito 等，Mol. R印rod. Dev.，39 153 161(1994)；和 Burdon 等，Mol. R印rod. Dev.， 33:436 442 (1992))，肌肉內(nèi)注射自我復(fù)制的 RNA 疫苗(Davis 等，J Virol 1996,70(6), 3781 3787 ;Balasuriya 等，Vaccine 2002，20 (1112)，1609 1617)或者用“基因槍，，技術(shù)皮 內(nèi)注射DNACJohnston等，同上)。用蛋白質(zhì)特異性多克隆或單克隆抗體檢測(cè)和測(cè)定本發(fā)明多肽表達(dá)的各種實(shí)驗(yàn)方 案為本領(lǐng)域所知。例子包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫(RIA)和熒光激活的細(xì) 胞分選(FACS)?？墒褂门c多肽上兩個(gè)非干擾表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體進(jìn)行雙位點(diǎn)單克 隆免疫實(shí)驗(yàn)，也可使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。這些和其它實(shí)驗(yàn)參見Hampton，R.等(1990 ；血清學(xué) 方法,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Serological Methods, a laboratory Manual)，APS出版社，明尼蘇達(dá)州 圣保羅)以及 Maddox，D. E.等(1983 J. Exp. Med. 158 1211-1216)等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員了解多種標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，可用于多種核酸和氨基酸實(shí)驗(yàn)。 產(chǎn)生標(biāo)記的雜交或PCR探針用于探測(cè)多核苷酸相關(guān)序列的方法包括寡核苷酸標(biāo)記、缺口平 移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。或者，可將多肽或其任何片段或變體的編碼 序列克隆入載體用于產(chǎn)生mRNA探針。此類載體為本領(lǐng)域所知并可購(gòu)得，可在加入合適RNA 聚合酶如T7、T3或SP6以及標(biāo)記的核苷酸后用于體外合成RNA探針?？衫冒卜R西亞生物技術(shù)公司、普洛麥格公司和美國(guó)生物化學(xué)公司(AmershamPharmacia Biotech,Promega and US Biochechemical)生產(chǎn)的多種市售試劑盒進(jìn)行這些步驟。易于探測(cè)的合適報(bào)告分子 或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或發(fā)色劑以及底物、輔因子、抑制劑、 磁性顆粒等?？稍谶m于表達(dá)和從培養(yǎng)物中回收多肽的條件下，復(fù)制表達(dá)載體或用表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)物可包含體外或體內(nèi)表達(dá)組件。體外表達(dá)組件包括兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂 解物、大腸桿菌裂解物和麥芽提取物的體外表達(dá)組件，例如，英駿公司(Irwitrogen)的 Expressway 或 RiPs 系統(tǒng)，英特龍生物技術(shù)公司(iNtRON Biotechnology)的 Genelator 系統(tǒng)，諾瓦基公司(Novagen)的EcoPro 或STP3 系統(tǒng)，普洛麥格公司(Promega)的TNT 快速偶聯(lián)系統(tǒng)和凱杰公司(QIAGEN)的EasyXpress系統(tǒng)。產(chǎn)自培養(yǎng)物的多肽可以是分泌的 或細(xì)胞內(nèi)包含的多肽，這取決于序列和/或所用載體。在某些特定方面，可設(shè)計(jì)編碼噬菌體 多肽的表達(dá)載體使其包含指導(dǎo)多肽通過原核或真核細(xì)胞膜分泌的信號(hào)序列。其它構(gòu)建物可包含利于多肽純化的氨基酸結(jié)構(gòu)域。此類結(jié)構(gòu)域包括但不限于可 在固化金屬上進(jìn)行純化的金屬螯合肽如組氨酸-色氨酸(如6X-HIS(SEQ ID NO 150))模 塊，可在固定免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域，以及在FLAG 擴(kuò)展/親和純化系 統(tǒng)(因繆耐斯集團(tuán)，華盛頓州西雅圖)(Immunex Corp.，Seattle, WA)中所用結(jié)構(gòu)域?？捎?的表位標(biāo)簽包括3XFLAG 、HA、VSV-G, V5、HSV、GST、GFP、MBP、GAL4 和 β -半乳糖苷酶。 有用的質(zhì)粒包括含有生物素標(biāo)簽的質(zhì)粒(如，普洛麥格公司的PinPoint 質(zhì)粒)，含有鈣調(diào) 蛋白結(jié)合蛋白的質(zhì)粒(如司查塔基公司的PCAL質(zhì)粒)，含有鏈霉親和素結(jié)合肽的質(zhì)粒(如 司查塔基公司的InterPlay 質(zhì)粒)，含有c-myc或FLAG 標(biāo)簽的質(zhì)粒(如西格瑪奧德里 奇公司的免疫沉淀質(zhì)粒)或含有組氨酸標(biāo)簽的質(zhì)粒(如凱杰公司的QIAExpress質(zhì)粒)。為了利于純化，表達(dá)載體可包含可切割的接頭序列，如Xa因子或腸激酶(英駿公 司，加州圣地亞哥)的特異性接頭序列。例如，載體在純化結(jié)構(gòu)域和多肽間可包含一個(gè)或多 個(gè)接頭。一種此類表達(dá)載體能夠用于表達(dá)包含本發(fā)明多肽的融合蛋白，并提供編碼硫氧還 蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)前6個(gè)組氨酸的核酸。組氨酸殘基利于在IMAC(固定金屬離子親和 色譜柱，如Porath，J等(1992) Prot. Exp. Purif. 3 :263_281所述)上純化，而腸激酶切割位 點(diǎn)則提供一種從融合蛋白中純化多肽的方法。Kroll, D. J. ^ (1993 ；DNA Cell Biol. 12 441-453)提供了關(guān)于包含融合蛋白的載體的討論?？墒褂帽绢I(lǐng)域通常所知方法產(chǎn)生本發(fā)明抗體，用于純化或診斷技術(shù)。具體說，根據(jù) 通常所知的實(shí)驗(yàn)方案，可使用多肽或多核苷酸產(chǎn)生抗體。此類抗體可包括但不限于多克 隆、單克隆、嵌合和單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。本發(fā)明尤其優(yōu)選使用 中和抗體(即抑制功能的那些抗體)。為了產(chǎn)生抗體，可將具有免疫原性的多肽、多核苷酸或其任何片段注射入不同的 宿主，包括山羊、兔、大鼠、人等，以進(jìn)行免疫。根據(jù)宿主種類，可使用不同的佐劑以提高免疫 應(yīng)答。此類佐劑包括但不限于福氏佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁和表面活性物質(zhì)如溶血卵磷 脂、普流羅尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍(lán)素和二硝基酚。用于人的佐劑中，尤 其優(yōu)選BCG (卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。用于誘導(dǎo)抗體的多肽或片段優(yōu)選具有包含至少5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10個(gè)氨基酸的 氨基酸序列。優(yōu)選的是，它們與天然蛋白質(zhì)氨基酸序列的一部分相同，以及它們可包含小的
18天然產(chǎn)生分子的完整氨基酸序列。可將氨基酸短臂與另一蛋白質(zhì)如鑰孔血藍(lán)素以及抗嵌合 分子的抗體的短臂融合。使用通過連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)制備單克隆抗體。這些技術(shù)包 括但不限于雜交瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.等(1975) Nature 256 :495_497 ；Kozbor, D.等(1985)J. Immunol. Methods 81:31_42 ；Cote, R. J 等 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80 2026-2030 ；Cole, S. P.等(1984)Mol. Cell Biol. 62 109-120)。如文獻(xiàn)報(bào)道，也可通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞在體內(nèi)生產(chǎn)抗體，或通過篩選免疫球蛋白 文庫(kù)或高特異性結(jié)合試劑板塊產(chǎn)生抗體(Orlandi, R.等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86 3833-3837 ；Winter, G.等(1991)Nature 349:293-299)。此外，也可使用某些技術(shù)產(chǎn)生“嵌合抗體”，如將抗體基因組合以獲得具有合適 抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Morrison, S. L.等(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81 6851-6855 ；Neuberger, M. S.等(1984)Nature 312 :604_608 ；Takeda, S.等(1985)Nature 314 452-454)?；蛘撸赏ㄟ^本領(lǐng)域所知方法改進(jìn)用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)，以產(chǎn)生特異性 單鏈抗體。具有相關(guān)特異性但獨(dú)特型組成不同的抗體可通過隨機(jī)組合免疫球蛋白文庫(kù)的鏈 改組產(chǎn)生(BurtonD. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88 11120-3)。本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員理解術(shù)語“雙抗體”和“三抗體”。存在包含重鏈可變 結(jié)構(gòu)域(VH)通過短肽接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的分子，該短肽接頭太短以至相同 鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間無法配對(duì)。這促使與一條或多條其它鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并促進(jìn)形 成具有兩個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的二聚體或三聚體分子。所得的抗體分子可以是單 特異性或多特異性的(如，雙抗體的情況下具有雙重特異性)。使用本發(fā)明涉及領(lǐng)域的標(biāo) 準(zhǔn)方法，如Todorovska等(在癌癥靶向中雙抗體、三抗體和四抗體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用(Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancertargeting). J. Immunol. Methods. 2001年2月1日；248(1-2) :47_66)所述，從兩種或多種抗體產(chǎn)生此類 抗體分子。也可產(chǎn)生包含特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，此類片段包括但不限于可通過 胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab' )2片段，以及通過還原F(ab' )2片段的二硫橋產(chǎn)生 的Fab片段。或者，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以快速簡(jiǎn)便的鑒定具有所需特異性的單克隆Fab 片段(Huse, W. D.等(1989) Science254 1275-1281)?？墒褂貌煌庖邔?shí)驗(yàn)來篩選鑒定具有結(jié)合特異性的抗體。本領(lǐng)域熟知使用具有確 定特異性的多克隆或單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或免疫放射實(shí)驗(yàn)的多種實(shí)驗(yàn)方法。此類免疫 實(shí)驗(yàn)通常包括測(cè)定多肽或多核苷酸和其特異性抗體間形成的復(fù)合物。優(yōu)選使用與兩個(gè)非 干擾表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體的雙位點(diǎn)單克隆免疫實(shí)驗(yàn)，但也可使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn) (Maddox，同上)。本文所述噬菌體多肽具有靶向、通透和/或抑制細(xì)胞的能力，還可作為載體分子 用于將其它抑制劑分子遞送入微生物細(xì)胞。將化合物偶聯(lián)至氨基酸的化學(xué)方法已經(jīng)得以 很好的發(fā)展，可將多種不同的分子類型與多肽連接。最常見的偶聯(lián)方法依賴于游離氨基 (α-氨基或Lys)、巰基(Cys)或羧酸基團(tuán)(Asp、Glu或α _羧基)的存在?？墒褂门悸?lián)方 法通過羧基_或氨基_末端殘基將多肽連接至細(xì)胞抑制劑。在一些情況下，序列包含多個(gè)可 與所選化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的殘基?？墒褂迷摲椒ㄉa(chǎn)包含多于一種細(xì)胞抑制劑的多聚物。
19或者，可縮短或選擇多肽，使反應(yīng)性殘基位于序列的氨基或羧基末端。例如，在多肽合成中可使用N-a-Fmoc-Ne -l-(4，4-二甲基_2，6 二氧代環(huán)亞 己-1-基-3-甲基丁基)-L-賴氨酸，將報(bào)告分子如熒光素特異性摻入到賴氨酸殘基(Ono 等，1997)。合成后用胼處理去除4，4- 二甲基-2，6- 二氧代環(huán)亞己-1-基，偶聯(lián)5-和6-羧 基熒光素琥珀酰亞胺酯。因此，通過在多肽序列中包含賴氨酸殘基，然后與合適的衍生化細(xì) 胞抑制劑反應(yīng)，能夠完成抑制劑分子與噬菌體多肽的偶聯(lián)。還可使用EDC (鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)或碳二亞胺偶 聯(lián)方法。碳二亞胺可激活天門冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈羧基基團(tuán)，以及羧基末端基團(tuán)，使其成 為伯胺偶聯(lián)的反應(yīng)性位點(diǎn)。將活化的多肽與細(xì)胞抑制劑混合以產(chǎn)生最終的偶聯(lián)物。如果細(xì) 胞抑制劑首先被活化，那么EDC法將通過N末端α胺并且可能通過Lys側(cè)鏈中的胺(如果 存在的話)偶聯(lián)細(xì)胞抑制劑。間-馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)是異雙功能試劑，可通 過半胱氨酸將多肽連接于細(xì)胞抑制劑。半胱氨酸殘基的硫醇基團(tuán)參與偶聯(lián)。如果所選序列 不包含Cys，通常將Cys殘基放置于N-或C-末端以便在高度控制條件下連接多肽與細(xì)胞抑 制劑。出于合成的目的，將半胱氨酸置于多肽的N末端是有幫助的。MBS尤其適合用于本發(fā) 明。戊二醛可用作通過其氨基將兩個(gè)化合物連接的雙功能偶聯(lián)試劑。戊二醛在多肽和 細(xì)胞抑制劑之間提供了高度靈活的間隔物，以利于呈現(xiàn)。戊二醛是反應(yīng)性非常高的化合物， 與Cys、Tyr和His進(jìn)行有限程度的反應(yīng)。當(dāng)多肽在其氨基末端僅包含一個(gè)游離氨基時(shí)，戊 二醛偶聯(lián)方法尤其有用。當(dāng)多肽包含不止一個(gè)游離氨基時(shí)，可形成大型多聚復(fù)合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽可融合于(如通過框內(nèi)克隆)或連接于(如通過化 學(xué)偶聯(lián))細(xì)胞抑制劑，如抗微生物試劑。其中包括抗微生物肽，例如殺菌/通透性增加 蛋白、陽離子抗微生物蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和犬科抗菌肽(cathelicidins)(如來自 中性粒細(xì)胞，參見例如 Hancock 禾口 Chappie，1999，Antimicrob. Agents Chemother. 43 1317-1323 ；Ganz 禾口 Lehrer，1997，Curr. Opin. Hemato1. 453-58 ；Hancock 等，1995，Adv. Microb. Physiol. 37 135-175)?？刮⑸镫倪€包括防御素(如，來自上皮細(xì)胞或中性 粒細(xì)胞)和血小板殺微生物蛋白(參見例如，Hancock和Chappie，1999，Antimicrob. Agents Chemother. 43 1317-1323)。其它抗微生物肽包括但不限于短桿菌肽S、桿菌肽、 多粘菌素B、鱟素、白細(xì)胞抗菌肽(bactenecin)(如，牛白細(xì)胞抗菌肽)，牛蛙皮膚抗菌肽 (ranalexin)、天蠶素A(cecropin Α)、尹杜抗菌肽(indolicidin)(如牛尹杜抗菌肽)和乳 酸鏈球菌素(如細(xì)菌乳酸鏈球菌素)?？刮⑸镌噭┻€包括離子載體(ionophores)，它利于離子(如鈉)的穿越脂質(zhì)屏 障如細(xì)胞膜進(jìn)行傳播。尤其適合本發(fā)明的兩個(gè)離子載體化合物是RUMENSIN (禮來公司) (Eli Lilly)和拉沙里菌素(Lasalocid)(羅氏公司)(Hoffman LaRoche)。其它離子載體包 括但不限于鹽霉素、阿伏霉素、阿瑞辛(aridcin)和阿克拉寧(actaplanin)。其他抗微生 物劑包括青霉素、莫能菌素TM和阿奇霉素、甲硝唑、鏈霉素、卡那霉素和青霉素，以及β _內(nèi) 酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、新生霉素、利福平和氟喹諾酮(參見例如Horn 等，2003, Applied Environ. Microbiol. 69 74-83 ；Eckburg 等，2003, Infection Immunity 71 591-596 ；Gijzen 等，1991，Applied Environ. Microbiol. 57 1630-1634 ；Bonelo 等，1984，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 21 :341_345 ；Huser 等，1982，Arch. Microbiol. 132 :1_9 ； Hilpert 等，1981，Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. IAbt Orig. C 2 :21_31)。尤其有用的抑制劑是阻斷或干擾甲烷生成的化合物，包括溴代乙磺酸，如，2-溴代 乙磺酸(BES)或其鹽，例如鈉鹽。鉬酸鈉(Mo)是硫酸還原抑制劑，可與溴代乙磺酸一起使 用。其它抗甲烷生成化合物包括但不限于硝酸、甲酸、甲基氟、三氯甲烷、水合氯醛、亞硫 酸鈉、乙烯和不飽和烴、乙炔，脂肪酸如亞油酸，順式油酸，飽和脂肪酸，如山崳酸(behenic) 和硬脂酸，以及陸馬嗪(lumazineM例如，2，4-二羥基蝶啶)。其它化合物包括3-溴丙磺 酸鹽(BPS)、丙炔酸和2- 丁炔酸乙酯?？刮⑸飫┻€包括裂解酶，包括噬菌體溶菌酶、內(nèi)溶素、溶菌酶、溶素、噬菌體溶 素、溶腸壁素、胞壁質(zhì)酶和病毒溶素。有用的酶具有水解細(xì)菌細(xì)胞壁中特定鍵的能力。特定 的裂解酶包括但不限于葡萄糖苷酶，它水解肽聚糖中氨基糖(如N-乙酰基胞壁酸和N-乙 ?；咸前?間的糖苷鍵；酰胺酶，它切割多糖鏈和交聯(lián)肽之間的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨 酸的酰胺連接；以及內(nèi)肽酶，它水解肽間連接(如，半胱氨酸內(nèi)肽酶)，和內(nèi)異肽酶，它攻擊 來自甲烷桿菌科(Methanobacteriacaea)的產(chǎn)甲烷菌的假胞壁質(zhì)。本文詳述的ORF 2058或ORF 2055編碼的多肽可用作瘤胃產(chǎn)甲烷菌特異性裂解 酶。可以從新鮮q>mru裂解的反芻甲烷短桿菌細(xì)胞中制備天然的酶。或者，可將ORF 2058或 ORF 2055克隆入表達(dá)載體并在異源宿主如大腸桿菌中表達(dá)。早前利用PeiP和PeiW完成這 項(xiàng)工作，并且在還原條件下該重組蛋白顯示對(duì)抗甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter)細(xì) 胞的活性(Luo等，2002)?？蓪RF 2058或ORF 2055裂解酶或任何其它裂解酶用于組合 物，例如，作為反芻動(dòng)物的飼料添加劑，或者可將其摻入緩釋膠囊或藥丸裝置用于在瘤胃中 長(zhǎng)時(shí)間遞送?？蓪⒘呀饷概c其它產(chǎn)甲烷菌抑制劑組合或依次使用以避免宿主產(chǎn)甲烷菌適應(yīng) 并對(duì)酶耐受。也可在酶中使用隨機(jī)和/或靶向突變以避免適應(yīng)。裂解/溶原開關(guān)組件(如 ORF 1981和ORF 1983-0RF1986)可以與裂解酶相似的方式使用。此外，PNA也包括作為抗微生物試劑。PNA是肽-核酸雜交物，其中磷酸主鏈被 獲自N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單位的非手性中性主鏈取代(參見例如優(yōu)卡生物科學(xué)系 列(Eurekah Bioscience Collection).人端粒酶的PNA和寡核苷酸抑制劑(PNA and Oligonucleotide Inhibitors of HumanTelomerase) · G. Gavory 禾口 S. Balasubramanian, 蘭登生物科學(xué)公司(LandeSBiOSCience)，2003)。通過亞甲羰基連接將A、G、Τ、C堿基連接 于主鏈的氨基氮上(P. Ε. Nielsen 等，Science 1991. 254 1497-1500 ；M. Egholm 等，Nature 1993. 365 566-568)。PNA以高特異性與互補(bǔ)序列結(jié)合，并且相對(duì)類似的DNA或RNA，PNA 具有更高親合力(M. Egholm等，同上)。與對(duì)應(yīng)的DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈體相比，PNA/ DNA或PNA/RNA雜交物具有更高的熱穩(wěn)定性(M. Egholm等，同上)。由于非天然酰胺主鏈不 被核酶或蛋白酶識(shí)別，因而PNA還具有高的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性(V. Demidov等，Biochem Pharmacol 1994. 48 1310-1313)。通常PNA的長(zhǎng)度至少為5個(gè)堿基，并包含末端賴氨酸。 可將 PNA PEG 化以進(jìn)一步延長(zhǎng)其壽命(Nielsen, P. Ε.等(1993) Anticancer Drug Des. 8 53-63)。在一個(gè)特定方面，本發(fā)明的多肽可與細(xì)胞抑制劑如抗體或其片段融合(如通過框 架內(nèi)克隆)或連接(如通過化學(xué)偶聯(lián))?？贵w或抗體片段可靶向微生物細(xì)胞，或者特別是產(chǎn) 甲烷菌細(xì)胞，或一種或多種細(xì)胞組件。例如，可靶向細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，如胞外受體。包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特異性結(jié)合抗原(與其免疫 反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明的多肽在靶向微生物細(xì)胞，具體說是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞中尤其有用。在特定方 面，可利用該多肽與細(xì)胞壁或膜連接或結(jié)合，通透細(xì)胞和/或抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)或復(fù)制。同 樣，可使用該多肽瞬時(shí)或長(zhǎng)時(shí)間附著于細(xì)胞，或通透細(xì)胞壁或膜和/或在胞內(nèi)環(huán)境中累積。 應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的噬菌體多肽，以及對(duì)應(yīng)的多核苷酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和抗體可 用于靶向多種微生物，例如，反芻甲烷短桿菌和史氏甲烷短桿菌，前者是反芻動(dòng)物中的主要 產(chǎn)甲烷菌，后者是人體的主要產(chǎn)甲烷菌。為了實(shí)施靶向，可將微生物細(xì)胞與噬菌體多肽接 觸，如本文詳述，所述多肽可分離自一種或多種天然資源，或產(chǎn)自表達(dá)載體和/或宿主細(xì) 胞，或來自于合成或半合成化學(xué)方法。為了增強(qiáng)通透性，可將該多肽與一種或多種信號(hào)序列 融合或連接(預(yù)測(cè)共有序列[ML]KKKK[K] {0，1}X{0，9} [IL] [IFL] [IL] [IL] [IS] [LIA]X{0，4} [LIVF] [LIAV] [Li] [ILV] [LAIV] [ILFV] [LIVF] [SAL] [ILV] [GSA] [AS] [VAI] [SA]A(SEQ ID NO 151)，參見 圖 6)。還參見 P6rez-Bercoff，A.，Koch，J.和 Biirglin，Τ· R. (2006) LogoBar 利用柱狀圖觀 察蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)禾口缺口(LogoBar :bar graphvisualization of protein logos with gaps). Bioinformatics 22，112-114。在特定方面，將該多肽以本文詳述的組合物形式遞送給對(duì) 象，例如通過用于反芻動(dòng)物的緩釋裝置遞送。在某些實(shí)施方式中，將該多肽與細(xì)胞抑制劑融合或連接，所述細(xì)胞抑制劑包括例 如，抗-產(chǎn)甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)，抗體或抗體片段，裂解酶，肽核酸，抗微生物肽 或其它抗生素。多肽抑制劑以組合物的形式遞送給對(duì)象以抑制微生物細(xì)胞，具體是產(chǎn)甲烷 菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或復(fù)制。該組合物包含，例如a)分離的噬菌體，噬菌體顆粒，噬菌體基 因組或其變化形式、片段、變體或衍生物；b)分離的噬菌體多肽或其變化形式、片段、變體 或衍生物；c)分離的多核苷酸或其變化形式、片段、變體或衍生物；d)包含該多核苷酸的表 達(dá)載體；或e)包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。根據(jù)公開的方法，本發(fā)明的組合物可專門包裝 為試劑盒的一部分，用于靶向、通透和/或抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞。該試劑 盒包括至少一種本文所列組合物；以及用于靶向或通透產(chǎn)甲烷菌或其它微生物細(xì)胞，或抑 制其細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制的使用說明。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及上述任何方法所用的與藥學(xué)上可接受載體聯(lián)用的 藥物組合物。此類藥物組合物可包含噬菌體多肽和細(xì)胞抑制劑的組合?；蛘?，藥物組合物 可包含本文詳述的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞?？蓡为?dú)給予該組合物或與至少一種其它藥劑，如 穩(wěn)定化合物聯(lián)合給予，可利用任何無菌的生物相容性藥學(xué)載體，包括但不限于鹽水、緩沖 鹽水、右旋糖和水給與該組合物。該組合物可單獨(dú)給予對(duì)象或與其它藥劑、藥物(如抗微生 物藥物)或激素聯(lián)合給予。除了活性成分，這些藥物組合物還可包含合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括利 于將活性化合物加工成藥學(xué)可用制劑的賦形劑和輔助劑。在最新版的雷明頓藥物科學(xué) (Remington' s Pharmaceutical Sciences)(賓夕法尼亞州伊斯頓的麥克出版公司(Maack Publishing Co. ,Easton,PA))可找到制劑和給藥技術(shù)的更多細(xì)節(jié)。本發(fā)明使用的藥物組合 物可通過任何途徑給予，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、 透皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下或直腸方式。領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體，以口服給藥合適劑量，配制用于口服 給藥的藥物組合物。此類載體使藥物組合物可以配制為片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、 凝膠劑、糖漿、漿液、混懸劑等，便于對(duì)象攝取?？赏ㄟ^以下方法獲得口服用途的藥物制劑 將活性化合物與固定賦形劑混合，任選將所得混合物研磨，在加入合適的輔助劑后將該混 合物加工成顆粒，獲得片劑或糖衣劑芯體。合適的賦形劑是糖或蛋白質(zhì)填充物，如糖，包括 乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、稻米、土豆或其它植物的淀粉；纖維素，如 甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素鈉；膠質(zhì)物，包括阿拉伯膠和黃芪膠；以 及蛋白質(zhì)如明膠和膠原。需要的話，可加入崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、 藻酸或其鹽，如藻酸鈉?？煽诜褂玫钠渌幬镏苿┌髂z制成的壓接(push-fit)膠囊，以及明膠和 包衣劑(coating)(如甘油或山梨糖醇)制成的密封軟膠囊。壓接膠囊可包含與填充劑或 粘合劑，如乳糖或淀粉；潤(rùn)滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選穩(wěn)定劑混合的活性組分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于含有或不含穩(wěn)定劑的合適液體，如脂肪 油、液體或液體聚乙二醇中。糖衣劑芯體可與合適的包衣劑，如濃縮糖溶液聯(lián)合使用，其中還可包含阿拉伯膠、 滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶 劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蝾伭霞尤肫瑒┗蛱且聞┌轮?，用于標(biāo)示產(chǎn)品或表征活性化 合物的量，即劑量?？捎盟匀芤海瑑?yōu)選生理相容性緩沖液，如漢克斯溶液、林格溶液或生理緩沖鹽水 配制適合胃腸道外給藥的藥物制劑。水性注射懸液可包含增加懸液粘度的物質(zhì)，如羧甲基 纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖苷。此外，活性化合物的懸液可制備為合適的油性注射懸液。 合適的親脂性溶劑或運(yùn)載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三 酯，或脂質(zhì)體。也可使用非脂質(zhì)聚陽離子氨基酸聚合物進(jìn)行遞送。懸液可任選包含合適的 穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度以制備高濃縮溶液的試劑。對(duì)于局部或鼻腔給藥，在制劑中使 用適合要滲透的特定屏障的滲透劑。本領(lǐng)域通常了解此類滲透劑。本發(fā)明的藥物組合物可以本領(lǐng)域所知方式制造，如，通過常規(guī)的混合、溶解、造粒、 制造糖衣劑、水飛、乳化、包膠、包封或凍干工藝的方法?？梢喳}的形式提供藥物組合物，所 述鹽可用多種酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。在 水性或其它質(zhì)子溶劑中鹽比對(duì)應(yīng)的游離堿形式更易于溶解。在其它情況下，優(yōu)選制劑可以 是包含下列任何或所有成分的凍干粉末l_50mM組氨酸、0. 1% -2%蔗糖和2_7%甘露醇， PH范圍為4. 5-5. 5，在使用前與緩沖液組合。藥物組合物制備后，可將其放置于合適的容器 中，并貼上用于治療所示病癥的標(biāo)簽。對(duì)于本發(fā)明組合物的給藥，此標(biāo)簽可包含給藥量、頻 率和方法。適用于本發(fā)明的藥物組合物包括包含有效量活性組分以達(dá)到預(yù)期目的的組合物。 對(duì)于任何化合物，最初可在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，如微生物細(xì)胞或具體說，在產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞中，或在 動(dòng)物模型中，通常是小鼠、兔、狗或豬或反芻動(dòng)物如綿羊、牛、鹿或山羊中估計(jì)治療有效劑 量。還可使用動(dòng)物模型確定合適的濃度范圍和給藥途徑。此類信息還可用于確定有用的給 藥劑量或途徑。通常給藥劑量可以是0.1-100，000微克，甚至總劑量約為Ig或更多，這取 決于給藥途徑。文獻(xiàn)中提供了有關(guān)具體劑量和遞送方法的指南，本領(lǐng)域?qū)嵤┤藛T可獲得這
23些指南。與遞送多肽相比，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將使用不同制劑遞送多核苷酸。相似地，多 核苷酸或多肽的遞送對(duì)于特定細(xì)胞、病癥、位置等而言是不同的。本領(lǐng)域已知基于噬菌體的療法，并且已公開此類組合物的制備方法。已描述噬 菌體療法可用于靶向葡萄球菌(Staphylococcus)(如金黃色葡萄球菌(S. aureus))、假 單胞菌(Pseudomonas)(如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa))、大腸桿菌(Escherichia)(如 大腸桿菌(E. coli))、克雷伯菌(Klebsiella)(如臭鼻克雷伯菌(K. ozaenae)、鼻硬結(jié) 克雷伯氏菌(K. rhinoscleromatis scleromatis)禾口月市炎克雷伯菌(K. pneumonia))、變 形桿菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)(參見例如Carlton, R. Μ. (1999). Archivum Immunologiae etTherapiae Experimentalis, 47 267-274 ；Liu, J. φ (2004). Nat. Biotechnol. 22,185-191 ；Projan, S. (2004). Nat. Biotechnol.22, 167-168 ；Sulakvelidze, Α. , Alavidze, Ζ.禾口 Morris, J. G. (2001). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45 (3) :649_659 ；ffeber-Dabrowska, Mulczyk, M.禾口 Gorski，A. (2000). Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis，48 :547_551)。唾菌體療法比傳 統(tǒng)抗微生物劑具有先天的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槭删w高度特異，不影響人體中正常微生物；噬菌體不 感染真核細(xì)胞，不具有已知的嚴(yán)重副作用；噬菌體可定位于感染位置；并且噬菌體可以指 數(shù)級(jí)復(fù)制，因此這種治療僅需小劑量，成本通常很低(參見例如Sulakvelidze等，同上)。 關(guān)于當(dāng)前的綜述，參見Fischetti VA, Nelson D，Schuch R.重新使用噬菌體療法部分 力于>@、禾口7 (Reinventing phage therapy -.are the parts greater than the sum ？) NatBiotechnol. 2006 年 12 月；24(12) :1508_11?；陔暮投嚯牡寞煼ㄒ炎髅枋?，例如白介素融合毒素(denileukindifitox)、 奧曲肽、伐普肽、蘭瑞肽、RC-3940系列肽、達(dá)必佳、醋酸亮丙瑞林(Iupron)、瑞林、西曲 瑞克(參見例如，Lu等，2006，AAPS J 8 :E466_472)，亥莫西汀(hemocidins)，司他弗平 (staphopains)(參見例如，Dubin 等，2005，Acta Biochemical Polonica, 52 :633_638)，以 及吲哚西汀(indolicidin)，防御素，羊毛硫抗生素，微西汀B17 (microcidin B17)，富組蛋 白(histatins)禾口嗎力口寧(maganin)(參見例如，Yeaman禾口 Yount，2003，Pharmacol Rev 55 27-55)。在 Degim 等，2007，Curr Pharm Des 13 :99_117 和 Shai 等，2006，Curr ProtPept Sci, 7:479-486中能夠找到肽和多肽療法的一般性指南。最近批準(zhǔn)的基于肽的藥物包括 Hematide (合成的基于肽的紅細(xì)胞生成刺激劑，埃非麥克司公司(Affymax，Inc.))，艾塞 那肽(Exenatide)(合成的腸促胰島素類似物(exendin) _4，愛麥林/禮來公司(Amylin/Eli Lilly), Natrecor (奈西立肽(nesiritide)，奈西立肽，司可奧斯公司(Scios))，普來納西 (Plenaxis)(阿巴瑞克，普瑞西斯制藥公司(Praecis Pharmaceuticals))和 SecreFlo(促 胰液素，瑞普里根公司(R印Iigen))。實(shí)施者根據(jù)需要治療對(duì)象相關(guān)的因素確定準(zhǔn)確劑量。對(duì)劑量和給藥進(jìn)行調(diào)整以提 供足夠水平的活性試劑或維持所需效果。需要考慮的因素包括疾病狀況的嚴(yán)重性、對(duì)象的 總體健康狀況、對(duì)象的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時(shí)間和頻率、聯(lián)合用藥、對(duì)治療的反 應(yīng)敏感性以及耐受/響應(yīng)。根據(jù)特定制劑的半衰期和清除率，長(zhǎng)效藥物組合物可每3-4天， 每周或每?jī)芍芙o予一次。本發(fā)明組合物(如藥物組合物)尤其有用的是緩釋配方或原理。例如，瘤胃內(nèi)裝 置包括但不限于新西蘭埃格瑞飼料公司(Agri-Feeds Ltd.，NewZealand)時(shí)間膠囊 丸范圍，最初由新西蘭愛吉研究公司開發(fā)(AgResearchLtd.，New Zealand)，如WO 95/19763 和NZ 278977所公開的，以及新西蘭奧克蘭的紐法姆公司的分支機(jī)構(gòu)紐法姆健康和科 學(xué)公司的 CAPTEC(Nufarm Health&Sciences, a division of Nufarm Ltd. , Auckland, NewZealand)，如 AU 35908178，PCT/AU81/100082 和 Laby 等，1984，Can. J. Anim. Sci. 64 (增 刊)337-8所公開的，將所有這些參考文獻(xiàn)納入本文作參考。作為特定的例子，該裝置可包 括彈簧和柱塞，迫使組合物穿過同末端的孔。作為另一實(shí)施方式，本發(fā)明涉及作為水補(bǔ)充物的組合物如進(jìn)水組合物，和食物補(bǔ) 充劑如反芻動(dòng)物飼料組分，用于上述任何方法。在特定方面，食物補(bǔ)充劑包含至少一種可食 用的植物材料以及本發(fā)明的肽或多肽?；蛘?，食物補(bǔ)充劑包含至少一種可食用的植物材料 以及本文公開的肽或多肽，或編碼本文公開的肽或多肽的多核苷酸，例如，表達(dá)載體或含有 表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的形式。具體說，組合物還包含與所得序列融合或連接的細(xì)胞抑制劑。 優(yōu)選的植物材料包括干草、草、谷物或粗磨粉中的任一種，例如，豆科干草、禾本科干草、玉 米青貯、禾本青貯、豆科青貯、玉米粒、燕麥、大麥、釀酒谷物、啤酒谷物、大豆粗磨粉和棉籽 粗磨粉。具體說，禾本青貯可用作反芻動(dòng)物的食物組合物?？蓪?duì)植物材料進(jìn)行遺傳改造，使 其包含本發(fā)明的一種或多種組分，如一種或多種多肽或肽、多核苷酸或載體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明多肽或多核苷酸的抗體可在監(jiān)測(cè)微生物水平的實(shí)驗(yàn)種 用于測(cè)定該微生物，尤其是產(chǎn)甲烷菌的存在。同上所述可以相同的方法制備用于診斷目的 的抗體。診斷實(shí)驗(yàn)包括使用抗體和標(biāo)簽檢測(cè)人體體液或細(xì)胞或組織提取物中多肽的方法。 可使用修飾或未修飾的抗體，通過共價(jià)或非共價(jià)方式將報(bào)告分子與其結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記?？墒?用本領(lǐng)域所知的多種不同的報(bào)告分子，上文對(duì)其中幾個(gè)進(jìn)行了描述。本領(lǐng)域已知用于測(cè)量多肽或多核苷酸水平的多種實(shí)驗(yàn)方案(如ELISA、RIA、FACS 和印跡法，如SoutherruNortherruWestern印跡)，為測(cè)定微生物尤其是產(chǎn)甲烷菌的存在或 水平提供了基礎(chǔ)。通過在適合形成復(fù)合物的條件下將來自正常對(duì)象如正常人或反芻動(dòng)物 的體液或細(xì)胞提取物與抗體組合，從而確定正常或標(biāo)準(zhǔn)水平。利用各種方法可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合 物的形成量進(jìn)行定量，但優(yōu)選分光光度法。將對(duì)象、對(duì)照和治療樣品(如來自治療對(duì)象的樣 品)中表達(dá)的多肽或多核苷酸的量與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)值和對(duì)象值之間的偏差確定了 用于測(cè)定微生物存在或水平的參數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，通過使用特定雜交和/或擴(kuò)增技術(shù)，可將多核 苷酸用于診斷目的?？墒褂玫亩嗪塑账岚ü押塑账?、互補(bǔ)RNA和DNA分子和PNA。多核苷 酸可用于檢測(cè)或定量測(cè)定樣品中的基因表達(dá)，其中表達(dá)與微生物的存在或水平相關(guān)?？墒?用診斷實(shí)驗(yàn)區(qū)分微生物水平的不存在、存在和改變，并在治療干預(yù)中監(jiān)測(cè)水平。在一個(gè)方面，可利用與PCR探針的雜交鑒定核酸序列，尤其是基因組序列，其編碼 本發(fā)明的多肽。無論探針產(chǎn)生于高度特異性的區(qū)域，如5’調(diào)節(jié)區(qū)的10個(gè)獨(dú)特核苷酸，或者 較低特異性的區(qū)域，如3'編碼區(qū)，探針的特異性以及雜交或擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)性(最大、高、中等 或低)將決定該探針是否僅僅識(shí)別天然產(chǎn)生的序列、等位基因或相關(guān)序列。探針也可用于 檢測(cè)相關(guān)序列，并應(yīng)該優(yōu)選包含來自任何編碼序列的至少50%核苷酸。本發(fā)明的雜交探針 可以是DNA或RNA，并來源于核苷酸序列SEQ ID NO :74_142或其互補(bǔ)或修飾序列，或來自 于包含天然產(chǎn)生序列的啟動(dòng)子、增強(qiáng)元件和內(nèi)含子的基因組序列。用于產(chǎn)生特異性DNA雜交探針的方法包括將核酸序列克隆入載體以產(chǎn)生mRNA探針。本領(lǐng)域了解此類載體，它們可購(gòu)得，并且通過加入合適的RNA聚合酶和合適的標(biāo)記核苷 酸可將它們用于體外合成RNA探針。可通過多種報(bào)告基團(tuán)對(duì)雜交探針進(jìn)行標(biāo)記，這些報(bào)告 基團(tuán)例如放射性核素如32P或35s，或酶標(biāo)記，如通過親和素/生物素偶聯(lián)系統(tǒng)偶聯(lián)至探針的 堿性磷酸酶等。多核苷酸可用于Southern或northern分析，點(diǎn)印跡或其它基于膜的技術(shù)； 用于PCR技術(shù)；或者用于試紙條、狹縫、ELISA實(shí)驗(yàn)或微陣列，用來自對(duì)象活檢的液體或組織 檢測(cè)微生物的存在和水平。本領(lǐng)域熟知此類定性或定量的方法。在一個(gè)特定方面，核酸序列可用于各種標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，并在適合雜交和/ 或擴(kuò)增的條件下加入來自對(duì)象的液體或組織。孵育合適的時(shí)間后，洗滌樣品，對(duì)信號(hào)進(jìn)行定 量并與標(biāo)準(zhǔn)值比較。如果受試樣品的信號(hào)量與可比較的對(duì)照樣品的信號(hào)量相比發(fā)生了顯著 的改變，那么樣品中出現(xiàn)核苷酸序列水平的改變表明微生物的出現(xiàn)或水平。還可使用此類 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)特定治療方案在動(dòng)物研究、臨床實(shí)驗(yàn)或者監(jiān)測(cè)對(duì)象治療中的效果。為了提供微生物出現(xiàn)或水平的診斷基礎(chǔ)，需確定表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)特征。通過在 適合雜交和/或擴(kuò)增的條件下，將來自正常對(duì)象的體液或細(xì)胞提取物與多核苷酸或其片段 混合，來完成這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。通過比較獲自正常對(duì)象的值與獲自使用已知量基本純化多核苷酸 的實(shí)驗(yàn)中的值，可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行定量?？蓪碜哉悠返臉?biāo)準(zhǔn)值與來自針對(duì)微生物生 長(zhǎng)進(jìn)行治療的對(duì)象的值進(jìn)行比較。利用標(biāo)準(zhǔn)值和對(duì)象值之間的偏差測(cè)定微生物的存在或水 平。一旦鑒定了微生物并開始了治療方案，則在常規(guī)基礎(chǔ)上進(jìn)行重復(fù)的雜交和/或擴(kuò) 增實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)相對(duì)于正常對(duì)象中觀察到的表達(dá)水平，對(duì)象中的表達(dá)水平是否開始降低。來 自連續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可用于顯示從數(shù)天到數(shù)月的治療期間的效果。由核酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸的特定診斷應(yīng)用可包括使用PCR。此類寡聚體可以是 化學(xué)合成、酶學(xué)方法產(chǎn)生或體外產(chǎn)生的。寡聚體優(yōu)選由兩個(gè)核苷酸序列組成，一個(gè)為正義方 向(5' ->3')，另一個(gè)為反義方向(3' ->5')，在為鑒定具體核苷酸序列或條件的 優(yōu)化條件下使用。在用于檢測(cè)和/或定量測(cè)定緊密相關(guān)的DNA或RNA序列的較低嚴(yán)謹(jǐn)性條 件下，使用相同的兩種寡聚物，巢式寡聚物集合或寡聚物簡(jiǎn)并庫(kù)?？捎糜诙繙y(cè)定表達(dá)的方法包括放射性標(biāo)記或生物素化核苷酸，對(duì)照核酸共 擴(kuò)增以及可通過插值獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果插值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Melby，P. C.等(1993) J. Immunol. Methods, 159 :235_244 ；Duplaa，C.等(1993)Anal. Biochem. 229-236)?？赏ㄟ^以 ELISA 形 式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)加快多個(gè)樣品的定量速度，其中感興趣的寡聚物以各種稀釋度出現(xiàn)，通過分光 光度法或比色法進(jìn)行快度定量。在另外的實(shí)施方式中，源自本發(fā)明所述任何多核苷酸的寡核苷酸或更長(zhǎng)的片段可 用作微陣列中的靶點(diǎn)?？墒褂梦㈥嚵型瑫r(shí)監(jiān)測(cè)大量基因的表達(dá)水平(產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物圖像)， 并鑒定遺傳變體、突變和多態(tài)性。可使用該信息確定基因功能，了解疾病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)， 診斷疾病，開發(fā)并監(jiān)測(cè)治療劑活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本領(lǐng)域所知方法制備和使用 微陣列，如 PCT 申請(qǐng) WO 95/11995 (Chee 等)，Lockhart, D. J.等(1996 ;Nat. Biotech. 14 1675-1680)以及 Schena，M.等(1996 ；Proc. Natl. Acad. Sci. 93 10614-10619)所述。在一個(gè)方面，可使用化學(xué)偶聯(lián)步驟和噴墨打印應(yīng)用設(shè)備，如PCT申請(qǐng)WO 95/251116 (Baldeschweiler等)所述在微陣列表面合成寡核苷酸。在另一方面， 可使用類似于斑點(diǎn)或狹縫印跡的“網(wǎng)狀”陣列(HYBRID0T設(shè)備，生命科技公司(Life
26Technologies))，利用真空系統(tǒng)、熱、UV、機(jī)械或化學(xué)連接步驟將cDNA片段或寡核苷酸安置 和連接至基材表面。在另一方面，可手工或利用可獲得的設(shè)備、材料或機(jī)器(包括多道移液 器或機(jī)器人儀器；布林克曼公司，韋斯特伯里，紐約州(Brinkmarm，ffestbury, N. Y.))生產(chǎn) 陣列，該陣列可包括例如24、48、96、384、1024、1536或6144或更多個(gè)點(diǎn)或孔(如多孔板)， 或從2-1，000，000的任何倍數(shù)，以便充分利用市售儀器。為了用微陣列進(jìn)行樣品分析，從生物制品中抽提多核苷酸。可從任何體液(血液、 尿液、唾液、痰、胃液等)，培養(yǎng)細(xì)胞，活檢物或其它組織制備物中獲取生物樣品。為了生產(chǎn)探 針，使用抽提自樣品的多核苷酸產(chǎn)生與陣列上核酸互補(bǔ)的核酸序列。如果微陣列由cDNA組 成，則反義RNA是合適的探針。因此，在一個(gè)方面，使用mRNA產(chǎn)生cDNA，進(jìn)而在熒光核苷酸 存在下用cDNA產(chǎn)生片段或反義RNA探針。將這些熒光標(biāo)記的探針與微陣列孵育，以使探針 序列與微陣列的cDNA寡核苷酸雜交。在另一方面，用作探針的核酸序列可包含使用雜交技 術(shù)領(lǐng)域熟知的限制酶、PCR技術(shù)和寡聚物標(biāo)記試劑盒(安法馬西亞生物技術(shù)公司(Amersham Pharmacia Biotech))產(chǎn)生的多核苷酸、片段和互補(bǔ)或反義序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可利用本發(fā)明的多肽或其功能性或免疫原性片段或 寡肽通過任何藥物篩選技術(shù)篩選化合物文庫(kù)。此類篩選所用片段可在溶液中游離，附加于 固體支持物、攜帶于細(xì)胞表面或定位于細(xì)胞內(nèi)部。可檢測(cè)多肽和受試物間的結(jié)合復(fù)合物的 形成。公開的PCT申請(qǐng)WO 84/03564描述了一種藥物篩選技術(shù)，它可用于高通量篩選對(duì) 感興趣多肽具有合適親和力的化合物。在該方法中，在固體基質(zhì)如塑料針或一些其它表面 上合成大量不同的小受試化合物。受試化合物與多肽或其片段反應(yīng)，然后洗滌。然后利用 本領(lǐng)域熟知方法檢測(cè)結(jié)合的多肽。還可將純化的多肽直接包被在板上，用于上述藥物篩選 技術(shù)?；蛘?，可使用非中和抗體捕獲多肽并將其固定到固體支持物上。在另一項(xiàng)技術(shù)中，可使用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選實(shí)驗(yàn)，其中能夠結(jié)合多肽的中和抗體與 受試化合物特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合該多肽。以此方式，可使用該抗體檢測(cè)與該抗體具有相同的一 個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的受試化合物的存在。
實(shí)施例本文所述實(shí)施例用以解釋本發(fā)明的實(shí)施方式。其它實(shí)施方式、方法和分析類型在 分子診斷領(lǐng)域的一般技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)，無需在此贅述。其它本領(lǐng)域范圍內(nèi)的實(shí)施方式 也應(yīng)作為本發(fā)明的一部分。實(shí)施例1 基因組大小估測(cè)反芻甲烷短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)菌株 MIt(DSM1093)生長(zhǎng) 于BY+培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基，Joblin等，1990)，該培養(yǎng)基由[g/l]NaCl (1)、KH2PO4 (0. 5)、 (NH4) 2S04 (0. 25)、CaCL2. 2H20 (0. 13)、MgSO4. 7H20 (0. 2)、K2HPO4 (1)、澄清反芻液(300ml)、 dH20(360ml)、NaHCO3(5)、刃天青(0. 2ml)、L-鹽酸半胱氨酸(0. 5)、酵母提取物(2)以及巴 赫(Balch)微量元素溶液(IOml)(加入微量元素；Balch等，1979)組成，由(g/Ι)三乙酸 腈(1. 5)、MgSO4. 7H20 (3)、MnSO4. H2O (0. 5)、NaCl (1)、FeSO4. 7H20 (0. 1)、CoCl2. 6H20 (0. 1)、 CaCl2 (0. 1)、ZnSO4. 7Η20(0· 1)、CuSO4. 5Η20(0· 01)、AlK(SO4)2. 12Η20(0· 01)、H3BO3 (0. 01)、 Na2MoO4. 2Η20(0. 01) ,NiSO4. 6Η20(0. 03) ,Na2SeO3(0. 02)和 Na2WO4. 2Η20(0. 02)組成。在液氮中冷凍細(xì)胞團(tuán)并用預(yù)冷的無菌臼和杵研磨，抽提基因組DNA。將細(xì)胞勻漿液包埋于瓊脂糖塞 中，后續(xù)操作在栓中進(jìn)行以減少對(duì)基因組DNA的物理剪切。用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化， 用脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)分離DNA片段。實(shí)施例2 =DNA克隆和測(cè)序安進(jìn)科生物科學(xué)公司(美國(guó)麻省)(Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA))使用隨機(jī)鳥槍克隆方案(Fleischmann 等，1995)，馬克 基因公司(美國(guó)馬里蘭州洛克維爾)(Macrogen Corporation(Rockville，MD，USA))使用焦 磷酸測(cè)序?qū)Ψ雌c甲烷短桿菌的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。簡(jiǎn)單的說，通過隨機(jī)物理破壞基因組 DNA和電泳分離片段在大腸桿菌中構(gòu)建反芻甲烷短桿菌的DNA文庫(kù)。從凝膠中回收40Kb范 圍內(nèi)的大片段，并用于產(chǎn)生大的插入f粘粒文庫(kù)?；厥?-4kb范圍的DNA片段并用于產(chǎn)生 小的插入質(zhì)粒文庫(kù)。培養(yǎng)大和小的插入文庫(kù)所得的克隆，回收其f粘?；蛸|(zhì)粒DNA并用高 通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)足夠數(shù)量的克隆進(jìn)行測(cè)序以達(dá)到對(duì)反芻甲烷短桿菌基因組理論 上8倍的覆蓋。在隨機(jī)剪切的基因組DNA片段上進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，并達(dá)到理論上10倍的覆
至
ΓΤΠ ο實(shí)施例3 序列組裝和原噬菌體注釋比對(duì)DNA序列以找到交疊序列，并利用帕拉賽基因組組裝者(ParaceIGenome Assembler)(帕拉賽公司，加利福尼亞州，美國(guó))(Paracel Inc, CA, USA)和Staden軟件 包(Staden等，1998)，與來自標(biāo)準(zhǔn)和反向PCR的序列組合組裝成毗連序列(毗連群)。使 用開放閱讀框(ORF)尋找器GLIMMER (基因定位插值馬爾可夫模型ER) (Gene Locator Interpolated Markov Model ER, Delcher 等，1999)分析毗連群，利用缺口 BLASTP(基礎(chǔ) 本地比對(duì)搜索工具)(Sasic Local Alignment Search Tool (Altschul 等，1997)在國(guó)家生 物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)的非冗余 核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)每一 ORF進(jìn)行分析。通過以隨機(jī)方式人工連接來自8倍草圖 噬菌體序列的毗連群產(chǎn)生“假分子”，并提交給基因組研究所(Thelnstitute for Genomic Research) (TIGR，美國(guó)華盛頓特區(qū))(TIGR, DC, USA)進(jìn)行自動(dòng)注釋。用GLIMMER對(duì)來自10 倍焦磷酸測(cè)序組裝的毗連群再次進(jìn)行分析，并且用GAMOLA (復(fù)雜現(xiàn)場(chǎng)Blast DNA序列全局 注釋(GlobalAnnotation of Multiplexed On-site Blasted DNA sequences) ；Altermann 和Klaenhammer，2003)對(duì)ORF進(jìn)行自動(dòng)注釋。用直系同源蛋白聚類(COG)數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)功能 對(duì) ORF 進(jìn)行分類(閾值 le-02) (http//www. pnas. org/cgi/content/full/102/l 1/3906 ； Tatusov 等，2001)。分別利用全局和局部比對(duì)(http //pfam. wustl. edu)以及標(biāo)準(zhǔn)和片段模式 TIGRFAM HMM 模型(http://www. tigr. org/TIGRFAMs)(閾值 le_02)，使用 PFAM HMM 和 TIGRFAM文庫(kù)通過HMMER(http://hmmer. wustl. edu)對(duì)蛋白基序進(jìn)行確定。用 TRNASCAN-SE 鑒定tRNA (Lowe和Eddy，1997)，用K0D0N軟件包(應(yīng)用數(shù)學(xué)公司，美國(guó)得克薩斯州奧斯汀) (Applied Maths, Austin, TX, USA)和 REPUTER(Kurtz 和 Schleiermacher，1999)鑒定核苷酸 重復(fù)。隨后對(duì)自動(dòng)注釋進(jìn)行人工校驗(yàn)。使用GENEWIZ (Jensen等，1999)構(gòu)建可視化基因組圖 集，用定制的內(nèi)部開發(fā)算法產(chǎn)生潛在的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。利用內(nèi)部開發(fā)的軟件(PathwayVoyager ； Altermann和Klaenhammer，2005)，從預(yù)測(cè)的反芻甲烷短桿菌ORF組和KEGG (京都基因與基 因組百科全書)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，Kanehisa 等，2004)在線數(shù)據(jù)庫(kù)重建通路。實(shí)施例4 測(cè)序結(jié)果和分析通過限制性酶消化基因組DNA和通過PFGE測(cè)定片段大小進(jìn)行反芻甲烷短桿 菌基因組大小的估測(cè)，表明單條染色體大小約2. 5-2. 9Mb。大和小插入克隆的初始測(cè)序 (6倍草圖覆蓋)以及將序列組裝為毗連群表明基因組中40Kb的區(qū)域出現(xiàn)頻率非常高 (over-represented) ( > 20倍)，特別是在小插入物文庫(kù)中?？赡艿脑蚴窃谟糜贒NA抽 提的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過程中，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒(盡管沒有鑒定到染色體外DNA)或溶原性細(xì)菌 噬菌體復(fù)制。因?yàn)檫@種巨大序列偏向，所以僅對(duì)小插入克隆進(jìn)行再次測(cè)序(覆蓋2倍理論 基因組)，從Sanger測(cè)序中產(chǎn)生最終的8倍覆蓋。將8倍草圖階段(phase)序列組裝為通 過105個(gè)支架連接的756個(gè)毗連群。進(jìn)一步進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，以實(shí)現(xiàn)額外約10倍的覆蓋， 將這些序列摻入組裝物使毗連群的數(shù)目降至27。使用反向和長(zhǎng)范圍PCR技術(shù)的后續(xù)缺口連 接過程使毗連群數(shù)目降至14，保留一個(gè)錯(cuò)誤組裝。在高通量測(cè)序階段，觀察到序列傾向于覆蓋與低G+C區(qū)( 12Kb)緊緊相鄰的G+C 含量顯著較高區(qū)域( 50Kb)的方向。通過GAMOLA和GeneWiz對(duì)基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn) 了與巨大低-GC穗(spike)緊鄰的顯著的高-GC區(qū)。對(duì)高G+C區(qū)的詳細(xì)分析揭示了存在與 噬菌體相關(guān)整合酶、噬菌體末端酶大亞基、噬菌體門戶蛋白、噬菌體衣殼蛋白以及預(yù)測(cè)的用 作噬菌體細(xì)胞溶素的肽酶相似的基因產(chǎn)物(圖3)。這些基因產(chǎn)物用作預(yù)測(cè)的反芻甲烷短桿 菌原噬菌體(記做(pmru)的整體結(jié)構(gòu)的錨定位點(diǎn)。基于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，鑒定出可能 的噬菌體整合位點(diǎn)attL和attR(圖1A)。att位點(diǎn)的噬菌體整合似乎破壞了 ORF 1980和 2069編碼的推定膜蛋白，并且該基因可能具有(pmru噬菌體基因組的原始整合位點(diǎn)attB?；诠J(rèn)的噬菌體基因組模塊化結(jié)構(gòu)以及與序列相似性和功能數(shù)據(jù)庫(kù)，確定 cpmru的一般結(jié)構(gòu)(圖 1B)禾Π DNA 序列(圖 4Α)。參見例如，AltermannE，Klein JRjHenrich B.格氏乳桿菌溫和噬菌體(Cp)adh基因組的一級(jí)結(jié)構(gòu)和特征(Primary structure and features of the genome of the Lactobacillusgasseri temperate bacteriophage (phi) adh). Gene. 1999 ^ 8 20 H ；236 (2) 333-46 ；Desiere F, Lucchini S, Canchaya C, Ventura Μ, Brussow H. Antonie Van Leeuwenhoek.乳酸細(xì)菌中的唾菌體禾口原唾菌體 白勺比㈣-IS^Ef (Comparative genomics of phages and prophages in lactic acid bacteria). 2002年8月；82(1_4) :73_91。成功將預(yù)測(cè)的Cpmru噬菌體ORF組分類為編碼噬 菌體整合、DNA復(fù)制和包裝、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白以及裂解盒的模塊，并且對(duì)約40%噬菌體ORF 進(jìn)行了功能表征。與大量直接或非直接重復(fù)側(cè)接并且確定位于DNA復(fù)制模塊內(nèi)部的非編碼 區(qū)中的終止子樣結(jié)構(gòu)(244bp)被表征為推定的DNA復(fù)制起點(diǎn)。經(jīng)預(yù)測(cè)，噬菌體基因組序列 內(nèi)部的數(shù)個(gè)基因位于反義鏈上，它們與低-GC區(qū)同時(shí)出現(xiàn)。有待確定的是這些基因是否使 噬菌體功能失活或表明噬菌體基因組內(nèi)的錯(cuò)誤組裝。發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的噬菌體溶素和attR之間的低-GC區(qū)具有DNA硫修飾系統(tǒng)，dnd (電泳期 間降解)，包括II型限制性m6腺嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和可能是dnd系統(tǒng)特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 子。而且，在噬菌體基因組內(nèi)部或者與噬菌體基因組側(cè)接處鑒定到非編碼RNA結(jié)構(gòu)。在預(yù)測(cè) 的DNA復(fù)制模塊內(nèi)部，鑒定到rbcL。rbcL代表來自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 的5' TRRNA穩(wěn)定元件。該家族被認(rèn)為參與了 rbcL基因的穩(wěn)定，rbcL基因編碼1，5- 二磷 酸核酮糖羧化酶的大亞基。該家族的突變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物降解加速50倍。
鑒定出與噬菌體基因組側(cè)接的三組I型內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。I組催化內(nèi)含子是大的自我 剪切核酶。在廣泛的有機(jī)體中，它們催化自身從mRNA、tRNA和rRNA前體上剪切。核心二級(jí) 結(jié)構(gòu)由9個(gè)配對(duì)區(qū)域組成(P1-P9)。它們主要折疊成為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域-P4-P6結(jié)構(gòu)域(由堆疊 的P5、P4、P6和P6a螺旋組成)和P3-P9結(jié)構(gòu)域(由P8、P3、P7和P9螺旋組成)。該家族 的標(biāo)注(mark-up) 二級(jí)結(jié)構(gòu)僅代表該保守核心。I組催化內(nèi)含子通常具有插入環(huán)區(qū)域的長(zhǎng) ORF。這些非編碼 RNA 結(jié)構(gòu)位于 ORF 1980 (SEQ ID NO 74)上游，0RF2065 (SEQ ID NO 141) 和attR的下游以及ORF 2069 (SEQ ID NO 142)上游的非編碼區(qū)。實(shí)施例5A:噬菌體基因在反芻甲烷短桿菌基因組序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)原噬菌體的序列是預(yù)料之外的。此前未有 關(guān)于反芻甲烷短桿菌菌株Ml (DSM 1093)對(duì)裂解或溶原性噬菌體易感性的報(bào)道，盡管有報(bào) 道稱鑒定出其它甲烷短桿菌種的噬菌體(Baresi和Bertani，1984 ；Knox和Harris，1986)。 (pmru原噬菌體序列的G+C含量顯著高于周圍反芻甲烷短桿菌基因組，表明它起源于另一有 機(jī)體。觀察到的同源性水平未表明其起源的明顯宿主，這表明(pmru不同于迄今遇見的其它 任何噬菌體。(pmru DNA序列插入到預(yù)測(cè)的反芻甲烷短桿菌膜蛋白內(nèi)，并側(cè)接于具有與attL和 attR位點(diǎn)相一致的二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA序列。盡管與其它已知蛋白質(zhì)缺少?gòu)?qiáng)烈同源性，但在 cpmru內(nèi)部可鑒定出噬菌體的所有功能性特征模塊。該序列的一個(gè)有趣特征是3’末端存在 低G+C區(qū)，這與參與DNA硫修飾系統(tǒng)(dnd)的蛋白質(zhì)顯示出同源性。這些基因位于(pmru的 attR依附位點(diǎn)上游，因此可能在噬菌體整合過程中被帶進(jìn)反芻甲烷短桿菌基因組中。該區(qū) 域編碼多種dnd相關(guān)的0RF(dndl、2和3)，以及II型甲基酶亞基和推定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。dnd表型促使其DNA在電泳過程中降解。對(duì)各dnd的ORF功能進(jìn)行分析表明宿主 基因組中摻入了硫或含硫物質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)Dnd表型存在于不同來源和不同棲息地的各種細(xì)菌 種類的DNA中。在代表不同屬的多種細(xì)菌基因組和海洋生物的eDNA中，發(fā)現(xiàn)組織相似的 基因簇，這表明這種修飾是一種廣泛的現(xiàn)象。體內(nèi)(35) S標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示Dnd表型和DNA硫 修飾同時(shí)發(fā)生于多種代表性細(xì)菌的基因組中(Zhou X，He X，Liang J, Li A, Xu Τ, Kieser Τ, Helmann JD, Deng Ζ. frM DNA WJM^ (A novel DNA modification bysulphur). Mol Microbiol.2005 年 9 月；57 (5) 1428-38)。II型R\M系統(tǒng)是最簡(jiǎn)單最流行的。甲基轉(zhuǎn)移酶和核酸內(nèi)切酶編碼為兩個(gè)獨(dú)立蛋白 質(zhì)并獨(dú)立作用，而非以復(fù)合物的形式工作。沒有特異性蛋白質(zhì)。兩種蛋白識(shí)別相同的識(shí)別 位點(diǎn)因此活性競(jìng)爭(zhēng)。甲基轉(zhuǎn)移酶以單體形式作用，一次對(duì)雙連體中的一條鏈甲基化。核酸 內(nèi)切酶以同源二聚體形式作用，促進(jìn)兩條鏈的切割。切割在識(shí)別序列附近或內(nèi)部的預(yù)定位 點(diǎn)發(fā)生。在這一點(diǎn)上，目前尚不清楚預(yù)測(cè)的功能如何與dnd系統(tǒng)共同作用。但是，清楚的是 噬菌體能夠用作基因遞送運(yùn)載體。具體說，能夠利用溶原性轉(zhuǎn)化區(qū)作為基因置換的基因座。dnd系統(tǒng)可能被噬菌體轉(zhuǎn)運(yùn)至反芻甲烷短桿菌中。同樣，尚不了解(pmru dnd系統(tǒng) 在保護(hù)或修飾反芻甲烷短桿菌或外來DNA中的作用。(pmru序列的另一個(gè)有趣的特性是反 義鏈上編碼的ORF數(shù)目。這些ORF對(duì)應(yīng)低GC區(qū)并與來自多種有機(jī)體的蛋白質(zhì)具有低BLAST 吻合度。這表明在整合入反芻甲烷短桿菌后，這些基因在^""^基因組中累積。尚不清楚這 些ORF是否代表插入正在累積，并最終導(dǎo)致噬菌體失活和馴化，或<pmru是否完全激活。對(duì)于減少甲烷特別重要的一個(gè)中““^基因是位于裂解盒中的0RF2058。0RF 2058被注釋為肽酶，并與肽酶C39家族蛋白具有蛋白家族(Pfam)匹配性(Protein Family(Pfam) match)(評(píng)分-13. 7，E值0. 00054)。這些蛋白質(zhì)是半胱氨酸肽酶，并且是MEROPS肽酶數(shù) 據(jù)庫(kù)定義的更大CA肽酶家族的一部分(Rawlings等，2006)。C39肽酶家族常常與ABC轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白相關(guān)聯(lián)，在細(xì)菌素輸出和加工中用作成熟蛋白酶。CA肽酶家族還包括病毒半胱氨酸 內(nèi)肽酶，如切割古菌細(xì)胞壁的交聯(lián)肽的C71古菌噬菌體內(nèi)異肽酶。屬于甲烷桿菌科的產(chǎn)甲 烷古菌的細(xì)胞壁包含假胞壁質(zhì)的平行鏈，一種被肽交聯(lián)的N-乙?；?L-塔羅糖胺糖醛酸 (N-acetyl-L-talosaminurinic acid)的聚合物。C71假胞壁質(zhì)內(nèi)異肽酶能夠切割古細(xì)菌 細(xì)胞壁肽交聯(lián)并能裂解細(xì)胞。基于來自馬爾堡甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter marburgensis)噬菌體 ΨΜ2(圖3)的假胞壁質(zhì)內(nèi)異肽酶的位置和同線性，ORF 2058可具有產(chǎn)甲烷菌溶素基因的角 色，其編碼參與子代噬菌體釋放前的細(xì)胞裂解的裂解酶。將ORF 2058與來自馬爾堡甲烷桿 菌(Μ. marburgensis)的PeiP和來自沃氏甲燒桿菌(M.wolfeii)的PeiW(圖5)進(jìn)行比對(duì)， 顯示這些蛋白質(zhì)間的總體同源性低。然而，參與內(nèi)異肽酶催化三聯(lián)體的組氨酸和天冬氨酸 殘基具有保守性，另外ORF 2058的半胱氨酸殘基位置靠近PeiP和PeiW的保守半胱氨酸， 它形成了催化三聯(lián)體的第三個(gè)保守位點(diǎn)(Makarova等，1999，Luo等，2002)。而且，在ORF 2058中也找到了環(huán)繞PeiP和PeiW中催化性His殘基的Gly-His-Tyr基序。這些發(fā)現(xiàn)表明 ORF 2058是(pmru溶菌素基因，功能是在噬菌體裂解循環(huán)中裂解反芻甲烷短桿菌細(xì)胞。ORF 2058以及PeiP和PeiW間的差異可能反應(yīng)了不同的古菌細(xì)胞壁肽交聯(lián)，因此反應(yīng)了不同的 肽酶底物特異性。實(shí)施例5B 噬菌體誘導(dǎo)反芻甲烷短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)菌株 MIt(DSM1093)生長(zhǎng) 于BY+培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基，Joblin等，1990)，該培養(yǎng)基由[g/l]NaCl (1)、KH2PO4 (0. 5)、 (NH4) 2S04 (0. 25)、CaCL2. 2H20 (0. 13)、MgSO4. 7H20 (0. 2)、K2HPO4 (1)、澄清反芻液(300ml)、 dH20 (360ml)、NaHCO3 (5)、刃天青(0. 2ml)、L-鹽酸半胱氨酸(0. 5)、酵母提取物(2)以 及巴赫微量元素溶液(IOml)(加入微量元素；Balch等，1979)組成，由(g/Ι)三乙酸腈 (1. 5)、MgSO4. 7H20(3)、MnSO4. H2O (0. 5)、NaCl (1)、FeSO4. 7Η20(0· 1)、CoCl2. 6Η20(0· 1)、 CaCl2 (0. 1)、ZnSO4. 7Η20(0· 1)、CuSO4. 5Η20(0· 01)、AlK(SO4)2. 12Η20(0· 01)、H3BO3 (0. 01)、 Na2MoO4. 2Η20 (0. 01)、NiSO4. 6Η20 (0. 03)、Na2SeO3 (0· 02)和 Na2WO4. 2Η20 (0. 02)組成。當(dāng)波長(zhǎng)600 (OD600)時(shí)測(cè)量的光密度(OD)介于0. 10-0. 14時(shí)，分別用Iml和2ml滅 菌空氣( 160至320 μ 1氧氣)(圖1C)和2 μ g/ml絲裂霉素C (圖1D)刺激反芻甲烷短 桿菌。兩種刺激均可觀察到典型裂解曲線，空氣刺激的潛伏時(shí)間為 90分鐘。絲裂霉素 C刺激的最初結(jié)果表明非常短的潛伏期。為了校驗(yàn)從宿主基因組中切除噬菌體，設(shè)計(jì)兩條 寡核苷酸，分別面向兩個(gè)噬菌體附著位點(diǎn)(RlF :caaagagagattaaagaagcagacg ;SEQ ID NO: 146 以及 L2Ragtagtgttggaatcagtgaaaagg ;SEQ ID N0:147)。如果噬菌體基因組在切除后 再次環(huán)化，這對(duì)引物則能產(chǎn)生擴(kuò)增子。圖IE描繪了當(dāng)用空氣刺激反芻甲烷短桿菌時(shí)，最初的切除實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)清楚 明確的具有期望大小的擴(kuò)增子，表明成功的切割和再環(huán)化。在未誘導(dǎo)的反芻甲烷短桿菌細(xì) 胞中也發(fā)現(xiàn)相似但微弱的條帶，表明在正常非刺激的生長(zhǎng)中，(pmru具有自發(fā)切割的能力。實(shí)施例5C 裂解酶生物實(shí)驗(yàn)
ORF 2058編碼的多肽可用作瘤胃產(chǎn)甲烷菌特異性裂解酶，并且亞克隆入大腸桿菌 表達(dá)載體用于產(chǎn)生重組蛋白。使用引物Mbbruml Ifor22(1122For，cac cat ggt tag att cag cag aga c ；SEQ ID NO 148)禾口 Mbbrum llrev22 (1122Rev, tea tgc agg aca gac aac ata gta g ；SEQ ID NO : 149)通過PCR在150 μ L反應(yīng)體系中擴(kuò)增ORF 2058，該反應(yīng)體系 含121. 5ng反芻甲燒短桿菌菌株Ml基因組DNA ；0. 2 μ M 1122For和1122Rev引物；15 μ L Accuprime Pfx 緩沖液(含 dNTP，英駿公司(InVitrogen)) ；2. 4μ L Accuprime Pfx(英駿 公司)。PCR條件為95°C 2分鐘初始變性，然后進(jìn)行35個(gè)下述循環(huán)95°C 15秒、55°C 30秒 和68°C 40秒。無需最后的延伸步驟。純化PCR產(chǎn)物，并用Nanodrop (賽默飛世爾科技公 司，美國(guó)佐治亞州)定量。ORF 2058克隆根據(jù)廠商推薦，將PCR-擴(kuò)增ORF 2058克隆入pET 100或pET 151-D Topo載體(英駿公司)中，并轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)TOP 10細(xì)胞(英駿公司)中。用菌 落PCR分析轉(zhuǎn)化子，純化質(zhì)粒DNA并測(cè)序。選擇具有匹配ORF 2058的DNA序列的克隆。ORF 2058表達(dá)利用電穿孔將來自含有經(jīng)校驗(yàn)的ORF 2058插入物的克隆的質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)BL21*或Rosetta 2細(xì)胞中。發(fā)現(xiàn)表達(dá)可溶性O(shè)RF 2058蛋白的最佳生 長(zhǎng)條件是LB培養(yǎng)基，在吸光度600為0. 48-0. 6時(shí)用0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并在30°C繼續(xù) 培養(yǎng)6小時(shí)。然后離心收集細(xì)胞并凍存于-20°C。細(xì)胞裂解融解細(xì)胞團(tuán)塊，并重懸于下列緩沖液中(pH 7.5) :300mMNaCl,2mM DTT、10mM 咪唑、20mM Tris、20%甘油、1 % Triton_X、5mMCaCl2 和 IOmM MgCl20 加入溶菌酶 終濃度為lmg/ml，然后在冰上輕輕攪拌30min。加入DNA酶I和RNA酶I，終濃度均為5 μ g/ ml，然后在冰上輕輕攪拌30分鐘。將細(xì)胞裂解物在12，OOOrpm離心15分鐘，用0. 8 μ m濾 器過濾粗提裂解物。鎳親和層析將來自細(xì)胞裂解步驟的過濾上清液施加于SOmL鎳親和柱，并用含 20mM-250mM咪唑的下列緩沖液(pH 7. 5)梯度洗脫300mMNaCl、2mM DTT、20mM Tris和20% 甘油。用裝有10，OOOkDa分子量截止膜的密理博超濾小室濃縮從層析柱上洗脫的含有所表 達(dá)ORF 2058蛋白的組分。利用下列洗脫緩沖液從鎳柱上洗脫大腸桿菌BL21*細(xì)胞中表達(dá) 的 ρΕΤΙΟΟ 中的 ORF 2058 構(gòu)建物pH 8. 2 (20mM Tris、250mM咪唑、300mMNaCl、IOmM b-巰基 乙醇、10%甘油)，并且在另外加入甘油和二硫蘇糖醇的緩沖液中儲(chǔ)存酶，該緩沖液的終濃 度為40%甘油，ImM 二硫蘇糖醇，pH8. 2。脫鹽使用含下列緩沖液(pH7.0) :20mM MOPSUmM DTT、300mMNaCl 和 20%甘油 的 250mL BioGel P6DG (伯樂公司，美國(guó)加州)(BioRad，CA，USA)柱對(duì) Rosetta 2 細(xì)胞中 pET 151構(gòu)建物表達(dá)的濃縮蛋白進(jìn)行脫鹽。如上所述濃縮來自柱的組分，將最終樣品過濾并用液 氮速凍，然后儲(chǔ)存于-20°C。裂解靜息的反芻甲烷短桿菌細(xì)胞在含BY+培養(yǎng)基的亨蓋特試管(Himgate tube) 中將5ml反芻甲烷短桿菌Ml (DSM 1093)的培養(yǎng)物培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，室溫下5，OOOx離心30 分鐘收集亨蓋特試管中的細(xì)胞。將細(xì)胞移至無氧室中(95%C02-5%H2，科藝實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品公 司，美國(guó)密歇根州)(CoyLaboratory Products, MI, USA)，棄去上清，將來IOml培養(yǎng)物的細(xì) 胞重懸于Iml MOPS緩沖液pH 6. 8 (50mM M0PS,5mM CaCl2, ImM 二硫蘇糖醇)中。用另外的 MOPS緩沖液稀釋細(xì)胞懸液，將其0D(600nm)調(diào)整至 0. 12。將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞懸液(50 μ 1)分配至微孔板中，加入不同濃度的ORF 2058裂解酶(由
32PET 100構(gòu)建物制備)，用緩沖液將反應(yīng)總體積補(bǔ)至250ml。在37°C孵育細(xì)胞和蛋白混合物， 并記錄OD讀值。在靜息反芻甲烷短桿菌細(xì)胞中加入酶(每個(gè)實(shí)驗(yàn)加入的酶yg數(shù))的效 果如圖7所示。與未加入酶的對(duì)照細(xì)胞相比，酶的加入以劑量依賴方式降低懸浮細(xì)胞的OD 600nm讀數(shù)。這表明ORF 2058裂解酶能夠在無氧條件下攻擊和裂解反芻甲烷短桿菌靜息細(xì) 胞。裂解生長(zhǎng)的反芻甲烷短桿菌細(xì)胞反芻甲烷短桿菌生長(zhǎng)于RM02培養(yǎng)基中。RM02 培養(yǎng)基由下列組分組成(g/L) =KH2PO4 (1.4), (NH4)2SO4 (0.6)、KCl (1.5)、微量元素溶液 SLlO(Iml)、硒/鎢溶液(Iml)、0· 1% (w/v)刃天青溶液(4滴)。將組分混合并在無氧100% CO2的條件下煮沸，用100% CO2鼓泡并在冰浴中冷卻。冷卻后加入NaHCO3 (4. 2g)和L-鹽 酸半胱氨酸·Η20(0. 5g)，將9. 5ml培養(yǎng)基分配至亨蓋特管中，用100% CO2對(duì)試管進(jìn)行通氣。 將試管高壓滅菌，使用前避光儲(chǔ)存24h。接種前，加入NoSubRFV (每管0. 5ml，包含底物、酵 母提取物、維生素)。接種后用80%C02/20%H2通氣至251b/in2。反芻甲烷短桿菌生長(zhǎng)至 對(duì)數(shù)中期(OD 600nm 0. 1)，這時(shí)加入不同濃度的ORF 2058裂解酶(由pET 151D Topo 克隆制備)。繼續(xù)孵育培養(yǎng)物并記錄OD讀數(shù)。加入酶對(duì)反芻甲烷短桿菌生長(zhǎng)和甲烷形成 (以括號(hào)表示生長(zhǎng)217小時(shí)后相對(duì)未加入對(duì)照的％甲烷產(chǎn)生)的影響如圖8所示。結(jié)果顯 示ORF 2058裂解酶以劑量依賴方式顯著影響反芻甲烷短桿菌生長(zhǎng)，在加入2小時(shí)內(nèi)降低生 長(zhǎng)培養(yǎng)物的OD 600。兩次最高水平的酶加入也減少了甲烷形成，與加入氯仿(ΙΟΟμΙ/ΙΟπιΙ 培養(yǎng)物)的程度相似。實(shí)施例6:概述反芻甲烷短桿菌基因組測(cè)序中的一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)是存在原噬菌體序列。對(duì)于基因組 序列的分析鑒定出異常高GC含量區(qū)，其中包含多種噬菌體相關(guān)的基因。進(jìn)一步的生物信息 學(xué)分析鑒定出預(yù)測(cè)的原噬菌體的整體結(jié)構(gòu)，并稱其為(pmru。將約40%的噬菌體基因指定為 不同的功能組，包括噬菌體整合、DNA復(fù)制和包裝、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和裂解。發(fā)現(xiàn)側(cè)接噬 菌體基因組的DNA序列代表潛在的噬菌體整合位點(diǎn)(attL和attR)。噬菌體似乎將其本身插入到反芻甲烷短桿菌的推定膜蛋白中，該蛋白可能含有 (pmru噬菌體基因組的原始產(chǎn)甲烷菌整合位點(diǎn)，attB.而且，發(fā)現(xiàn)于DNA復(fù)制模塊內(nèi)的終止 子樣結(jié)構(gòu)被認(rèn)為代表了噬菌體DNA復(fù)制起點(diǎn)。噬菌體基因組3'末端的低-GC區(qū)含有似乎 是DNA硫修飾系統(tǒng)的組件，包括可能控制dnd系統(tǒng)表達(dá)的基因。這些基因可能在噬菌體整合 的過程中被帶入反芻甲烷短桿菌的基因組中，并且其在修飾噬菌體、宿主或外源DNA方面 的角色還有待闡明。反芻甲烷短桿菌對(duì)于dnd系統(tǒng)的保留表明它使宿主受益。然而，(pmru dnd系統(tǒng)在反芻甲烷短桿菌或外源DNA修飾中的作用還有待研究。cpmru序列的另一有趣特點(diǎn)是對(duì)應(yīng)低GC區(qū)且與各種有機(jī)體蛋白質(zhì)匹配性較低的反 義鏈編碼基因的數(shù)目。這表明這些基因在其整合入反芻甲烷短桿菌之后在cpmru的基因組 中積累，這些基因可能代表正在進(jìn)行之中的插入建立，也許最終導(dǎo)致噬菌體失活和噬菌體 馴化。與反芻甲烷短桿菌基因組相比(pmru噬菌體序列的高GC含量表明它起源于另一有機(jī) 體。然而，之前的宿主并未明確，因?yàn)榕c其它迄今為止已知的噬菌體相比(pmru蛋白質(zhì)顯示 出某種獨(dú)特性。關(guān)于減少甲烷的尤其讓人感興趣的(pmru基因是位于裂解盒中的那些基因。具體 說，一個(gè)基因編碼與C39肽酶家族類似的蛋白質(zhì)。該肽酶家族包括病毒半胱氨酸內(nèi)肽酶等，如C71古菌噬菌體內(nèi)異肽酶，該酶切割組成甲烷短桿菌細(xì)胞壁的假胞壁質(zhì)中的交聯(lián)肽。根 據(jù)噬菌體基因組內(nèi)的基因位置以及與來自其它非反芻產(chǎn)甲烷菌噬菌體基因組的假胞壁質(zhì) 內(nèi)異肽酶的同線性，該基因可用作編碼參與噬菌體后代釋放前細(xì)胞裂解中的裂解酶的溶素 基因。對(duì)該基因和它編碼的酶尤感興趣，因?yàn)榭赡茉诰哂邢嗨萍?xì)胞壁的反芻甲烷短桿菌和 其它反芻產(chǎn)甲烷菌中有控制機(jī)制。反芻噬菌體及其參與裂解宿主細(xì)胞的酶有可能用來控制瘤胃中產(chǎn)甲烷菌群體和 其它群落成員(細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌)。此外，通過研究噬菌體的生命周期，有可能鑒定出 易于受噬菌體蛋白質(zhì)抑制的關(guān)鍵的宿主酶靶點(diǎn)。本發(fā)明人對(duì)牛、綿羊和鹿中反芻噬菌體的 組成進(jìn)行過調(diào)查研究，顯示噬菌體數(shù)量和類型隨時(shí)間的變化。還鑒定出受噬菌體影響的新 西蘭產(chǎn)甲烷菌分離物。利用純產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)物評(píng)價(jià)噬菌體裂解酶，開發(fā)基于培養(yǎng)物和PCR 的技術(shù)以篩選新噬菌體。純化自瘤胃樣品的噬菌體可進(jìn)行隨機(jī)DNA測(cè)序分析，從而發(fā)現(xiàn)噬 菌體酶。噬菌體或其酶在用于降低甲烷排放的緩解技術(shù)中具有多種優(yōu)勢(shì)。噬菌體是瘤胃 微生物群落中的天然成員，因此，不會(huì)被視為抗生素治療(并可更容易地克服任何管理限 制)。噬菌體通常對(duì)窄范圍的宿主具有特異性，因此可以選擇性靶向產(chǎn)甲烷菌?，F(xiàn)在認(rèn)為噬 菌體治療是對(duì)抗生素耐受型有機(jī)體的一種治療，一般認(rèn)為是安全的。一旦產(chǎn)生，噬菌體通常 相對(duì)穩(wěn)定。將對(duì)噬菌體易感的產(chǎn)甲烷菌菌株引入瘤胃可能具有長(zhǎng)期益處，尤其是在早期進(jìn) 行接種的情況下(如羊羔或和牛犢)。已知某些產(chǎn)甲烷菌包含噬菌體基因組、對(duì)裂解噬菌體 易感、或發(fā)生自溶(提示有裂解酶)，包括史氏甲烷短桿菌(Methanobrevibacter smithii) (菌株P(guān)S)、布氏甲烷桿菌(Methanobacteriumbryantii)和甲烷短桿菌菌株MF-I。用噬菌 體抑制引起農(nóng)業(yè)問題的有機(jī)體的一個(gè)著名實(shí)例是使用噬菌體靶向大腸桿菌0157:H7。選擇反芻甲烷短桿菌進(jìn)行基因組測(cè)序是因?yàn)樗诟鞣N飼養(yǎng)條件下的反芻動(dòng)物瘤 胃中廣泛存在(基于培養(yǎng)和分子檢測(cè)數(shù)據(jù))，容易獲得培養(yǎng)物，易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)以 及可獲得關(guān)于這種有機(jī)體的大量的前期研究數(shù)據(jù)和背景文獻(xiàn)。本發(fā)明提供關(guān)于反芻甲烷短 桿菌基因組的重要數(shù)據(jù)，并且對(duì)瘤胃內(nèi)噬菌體進(jìn)行詳細(xì)構(gòu)圖。(pmru原噬菌體序列為抑制反 芻甲烷短桿菌以及未來的有助于確定基因功能的遺傳學(xué)操縱提供了具體試劑?？衫迷撌?菌體阻斷產(chǎn)甲烷菌中的保守功能/組件以防止或減少瘤胃中的甲烷形成。參考文獻(xiàn)Altermann E，Klaenhammer TR(2005)通路探險(xiǎn)人用京都基因和基因組(KEGG) 百禾斗全書數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路作圖(PathwayVoyager :pathwaymapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database). BMC Genomics 6:60-66。Altermann, E Klaenhammer TR(2003)GAM0LA 序列注釋以及對(duì)原核基因組草圖 和完成序列進(jìn)行分析的新的本地解決方案(GAM0LA :a newlocal solution for sequence annotation and analyzing draft and finishedprokaryotic genomes) · OMICS :A journal of integrative biology 7，161—169。Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ(1997)，缺口 BLAST和PSI-BLAST 新一代的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of protein databasesearch programs). Nucleic Acids Research 25,3389-3402。
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將上述說明書提及的所有公開物和專利全文納入本文作參考。如果參考上述說明書中提及具有已知等同形式的內(nèi)容，那么將這些等同形式也納 入本文，就好像在本文中單獨(dú)列出那樣。雖然已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了描 述，但應(yīng)了解，如權(quán)利要求所述，本發(fā)明不應(yīng)過分地受限于這些具體實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解的 是在不背離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的修改。
權(quán)利要求
一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO2 5的氨基酸序列。
2.一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO 62的氨基酸序列。
3.一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO :63或72的氨基酸序列。
4.一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID N0:64-68的氨基酸序列。
5.一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO :1、6-61或69的氨基酸序列。
6.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID NO :2-5的氨基酸序列具有90%相同性。
7.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID NO :62的氨基酸序列具有90%相同性。
8.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID NO :63或72的氨基酸序列具有90%相同性。
9.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID N0:64-68的氨基酸序列具有90%相同性。
10.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID N0:l、6-61或69的氨基酸序列具有90%相同
11.一種分離的多核苷菌δ，其編碼選自SEQIDNO2-5的氨基酸序列。
12.一種分離的多核苷菌δ，其編碼選自SEQIDNO62的氨基酸序列。
13.一種分離的多核苷菌δ，其編碼選自SEQIDNO:63或72的氨基酸序列。
14.一種分離的多核苷菌δ，其編碼選自SEQIDNO64-68的氨基酸序列。
15.一種分離的多核苷菌δ，其編碼選自SEQIDNO:1、6-61或69的氨基酸序列。
16.一種分離的多核苷菌δ，其包含選自SEQIDNO75-78的核苷酸序列。
17.一種分離的多核苷菌δ，其包含選自SEQIDNO135的核苷酸序列。
18.一種分離的多核苷菌δ，其包含選自SEQIDNO136的核苷酸序列。
19.一種分離的多核苷菌δ，其包含選自SEQIDNO137-141的核苷酸序列。
20.一種分離的多核苷菌δ，其包含選自SEQIDNO=74,79-134或142的核苷酸序列。
21.—種編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽的載體。
22.一種包含權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述多核苷酸的載體。
23.一種包含權(quán)利要求21或22所述載體的宿主細(xì)胞。
24.一種經(jīng)遺傳修飾編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽的宿主細(xì)胞。
25.一種經(jīng)遺傳修飾包含權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述多核苷酸的宿主細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌。
28.如權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是產(chǎn)甲烷菌。
29.如權(quán)利要求28所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
30.一種偶聯(lián)物分子，其包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽。
31.一種偶聯(lián)物分子，其包含權(quán)利要求3或8所述多肽。
32.如權(quán)利要求30或31所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，所述分子還包含抗甲烷生成 化合物、信號(hào)序列、抗體或抗體片段、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
33.一種包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽的融合分子。
34.一種包含權(quán)利要求3或8所述多肽的融合分子。
35.如權(quán)利要求33或34所述的融合分子，其特征在于，所述分子還包含抗甲烷生成化 合物、信號(hào)序列、抗體或抗體片段、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
36.一種與權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽結(jié)合的抗體或抗體片段。
37.如權(quán)利要求36所述的抗體或抗體片段，其特征在于，所述抗體或抗體片段是多克 隆的。
38.如權(quán)利要求36所述的抗體或抗體片段，其特征在于，所述抗體或抗體片段是單克 隆的。
39.一種分離的(pmru噬菌體，其包含權(quán)利要求l-io中任一項(xiàng)所述的至少一種多肽。
40.一種分離的cpmru噬菌體，其包含權(quán)利要求3或8所述的至少一種多肽。
41.一種分離的(pmru噬菌體，其包含權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸。
42.一種分離的cpmru噬菌體，其包含權(quán)利要求13或18所述的至少一種多核苷酸。
43.一種包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述多肽的藥物組合物。
44.一種包含權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述多核苷酸的藥物組合物。
45.一種包含權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)所述噬菌體的藥物組合物。
46.一種抑制產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法，所述方法包括任選地產(chǎn)生或分離權(quán)利要求3或8 所述的多肽；和b)將所述細(xì)胞與所述多肽相接觸。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
49.一種抑制產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法，所述方法包括a)任選地產(chǎn)生或分離權(quán)利要求31 或32所述的偶聯(lián)物分子；和b)將所述細(xì)胞與所述偶聯(lián)物分子相接觸。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
52.一種抑制產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法，所述方法包括a)任選地產(chǎn)生或分離權(quán)利要求34 或35所述的融合分子；和b)將所述細(xì)胞與所述融合分子相接觸。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
55.一種抑制產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的方法，所述方法包括a)任選地產(chǎn)生或分離權(quán)利要求40 或42所述的噬菌體；和b)將所述細(xì)胞與所述噬菌體相接觸。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
全文摘要
本發(fā)明包括含有噬菌體誘導(dǎo)、噬菌體顆粒和噬菌體基因組的噬菌體還包括噬菌體多肽、編碼這些多肽的多核苷酸、包含這些多核苷酸的表達(dá)載體和包含這些載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括使用所公開的噬菌體、多肽、多核苷酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞來檢測(cè)、靶向、通透并抑制微生物細(xì)胞，尤其是產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的組合物和方法。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101932595SQ200880109156
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者C·D·穆恩, C·M·圖提爾, C·桑, D·德, D·李, E·H·阿特曼, G·T·愛特伍德, H·J·派特魯斯, L·R·斯考菲爾德, R·S·羅尼姆斯, S·C·利伊, W·J·凱利, Z·孔 申請(qǐng)人:田園溫室氣體研究有限公司