專利名稱：防治刺參腐皮綜合癥的噬菌體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對兩種噬菌體及其應(yīng)用，尤其能特異性裂解哈維氏弧菌 (Vibrioharveyi)的噬菌體及其應(yīng)用。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是在海洋及鹽湖環(huán)境中分布極為廣泛的一種致病性嗜鹽細(xì)菌。存在于近海岸的海水、海底沉積物以及魚類、貝類之中。哈維氏弧菌是魚蝦貝等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的主要致病菌之一，已經(jīng)被證實是刺參弧菌病的主要致病菌。近年來由哈維氏弧菌造成的水產(chǎn)動物病害也頻頻出現(xiàn)。目前，控制水產(chǎn)動物弧菌病的主要手段是抗菌藥物治療(鏈霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素)。面對日益嚴(yán)重的耐藥毒株的出現(xiàn)，利用抗生素來防止細(xì)菌污染已經(jīng)不是最佳防控方法。耐藥毒株會在環(huán)境中進(jìn)化并產(chǎn)生，抗生素的開發(fā)遠(yuǎn)不及耐藥毒株出現(xiàn)的速度。因此，由細(xì)菌污染食品引起的中毒檢測表明，導(dǎo)致疾病產(chǎn)生的源頭來自于抗生素濫用所產(chǎn)生的耐藥細(xì)菌。噬菌體是病毒的一種，其特別之處是專以細(xì)菌為宿主。噬菌體是一種普遍存在的生物體，而且經(jīng)常都伴隨著細(xì)菌。通常在一些充滿細(xì)菌群落的地方，如泥土、動物的內(nèi)臟里，都可以找到噬菌體的蹤影。目前世上蘊(yùn)含最豐富噬菌體的地方就是海水。在海平面，平均每毫升的海水即含有IO9個病毒粒子(virions)，并使海水中70 %的細(xì)菌受到噬菌體的感染。裂解性噬菌體感染細(xì)菌后，可在宿主菌內(nèi)快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。 哈維氏弧菌噬菌體可以特異性感染并裂解哈維氏弧菌，因而具有殺菌作用。在感染模型中， 噬菌體能夠特異殺死哈維氏弧菌；而在水產(chǎn)生產(chǎn)中，噬菌體能夠作為抗菌劑來控制細(xì)菌污染，具有潛在的開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對目前人們在防止哈維氏弧菌(Vibrioharveyi) 引起的刺參腐皮綜合癥時，使用抗生素容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，提供一種新的能夠特異性裂解哈維氏弧菌的噬菌體及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的通過特異性弧菌培養(yǎng)基以及回接感染試驗篩選致病性弧菌，對具有致病性的弧菌進(jìn)行生理生化以及分子生物學(xué)鑒定。鑒定該菌株為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)，利用分離得到的病原菌進(jìn)行噬菌體的分離，對分離得到的兩株不同大小噬菌斑的噬菌體進(jìn)行透射電鏡掃描，抑菌試驗。通過試驗可以得出分離得到的兩株噬菌體對哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)具有強(qiáng)烈的裂解作用。本發(fā)明的效果和益處是(1)專一性裂解目標(biāo)病原微生物，不會破壞水環(huán)境中的正常菌群。傳統(tǒng)的抗生素治療在殺滅致病菌的同時，也破壞了水體中正常的浮游微生物，引起微生態(tài)失衡，并導(dǎo)致機(jī)會性感染；
(2)噬菌體是宿主依賴性的，只在細(xì)菌感染部位發(fā)生作用，隨著宿主菌的清除而消亡，不會殘留在動物體內(nèi)；(3)噬菌體能夠自我復(fù)制增殖，可保持長期持續(xù)作用，且其感染發(fā)生在水溶液狀態(tài)中；(4)安全無毒副作用，噬菌體由蛋白質(zhì)和核酸組成，降解后的終產(chǎn)物是氨基酸和核酸片段，對人和動物安全。


圖1是分離得到兩種哈維氏弧菌噬菌體示意圖。圖2是兩種哈維氏弧菌噬菌體的體外抑菌示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的實施例。實施例1、哈維氏弧菌噬菌體分離制備本發(fā)明樣品采自刺參養(yǎng)殖廠的養(yǎng)殖污水，經(jīng)雙層濾紙過濾，8000rpm，離心20min， 再用0. 22 μ m濾膜過濾上清。取50ml濾液，加入2ml噬菌體宿主菌過夜培養(yǎng)物，再加入CaCl2 母液(已過0. 22 μ m濾膜除菌)至終濃度ImM混勻后，加入hbell2216E培養(yǎng)基，室溫作用 lh，再放置于37°C培養(yǎng)Mh。取上述培養(yǎng)物以IOOOOrpm離心lOmin，取上清，再用0. 22 μ m 濾膜過濾，濾液形成噬菌體原液。取噬菌體原液0. 1ml，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取102、104、 IO6UO8稀釋液各0. Iml與對數(shù)生長期的哈維氏弧菌(Vibrio harveyi) Iml混合，室溫作用 15min后，加入IOml 0. 7%的2216固體培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入2216E培養(yǎng)基平板上層， 搖勻平置5min，待其凝固，置于溫箱培養(yǎng)1 后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板。實施例2、噬菌體的純化培養(yǎng)和濃縮在形成噬菌斑的雙層平板上挑取形態(tài)大小一致的單個噬菌斑，用接種針穿刺目的噬菌斑，將穿刺后接種針伸入3-5ml 2216E培養(yǎng)基中，重復(fù)3_5次后，加入噬菌體宿主菌液 lml，混勻，室溫作用 15min，37°C培養(yǎng) 20-24h，14000Xg. mirTWC，離心 lOmin，取上清，無菌過濾(0. 22 μ m)上清液。再次雙層平板檢測純化噬菌體。將宿主菌單菌落接入到50mL液體2216E培養(yǎng)基的錐形瓶中振蕩培養(yǎng)IOh ；取過夜培養(yǎng)的宿主菌液20mL，接到200mL 液體2216E中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長初期，約為4h ；加入噬菌體液，使感染復(fù)數(shù)約為 KMOI = 1)，室溫靜置15min，以使噬菌體吸附于宿主菌表面繼續(xù)振蕩培養(yǎng)他，轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm ；將上述混合液于4°C 8000rpm離心20min，以除去細(xì)菌碎片，然后量取上清液， 在其中加入DNase I和RNaseA至終濃度為1 μ g/mL,室溫溫育30min ；按500ml培養(yǎng)物加入 29. 2g固體NaCl，攪拌使其溶解，然后冰浴1小時，加NaCl后可促使噬菌體顆粒和細(xì)菌碎片分離，也是噬菌體顆粒有效沉淀所必需的；4°C，8300rpm離心IOmin以去除細(xì)胞碎片，收集上清。測定所收集上清液的總體積，然后按照500mL上清加50g的比例加入固體PEG8000， 于室溫用玻璃棒慢慢攪拌溶解，然后冰浴24h以使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀；4°C，8300rpm離心 IOmin回收沉淀的噬菌體顆粒，棄上清，將離心管倒置5分鐘，使殘余液體流干，用移液器除去殘余液體；用2mL的SM保存液重懸噬菌體沉淀，放于4°C保存。實施例3、噬菌體效價測定法
將指定之寄主細(xì)菌以2216E液體培養(yǎng)基于下培養(yǎng)，150轉(zhuǎn)/分鐘，16- 小時。 以PBS為稀釋液，將噬菌體原液做10倍序列稀釋，一般稀釋至IO9倍即可。取噬菌體稀釋液200 μ 1與寄主菌液500 μ 1均勻混合，靜置10分鐘使其感染。將上述混合液加入5ml冷卻至45°C的0.7%瓊脂2216E培養(yǎng)基中，均勻混合后立即平鋪于已凝固的1.5%瓊脂培養(yǎng)基上。將平板置于適合的溫度下，一般培養(yǎng)8 M小時，待溶菌斑產(chǎn)生后觀察并計算其數(shù)目。 噬菌體效價(pfu/ml)=噬菌斑X稀釋倍數(shù)X取樣量折算數(shù)，例如噬菌體原液稀釋倍數(shù)為106，取樣量測定量為0. 2ml (則取樣量折算數(shù)為20)，三個平板的溶菌斑數(shù)目分別為275、 252、263，則噬菌體原液的效價為:2X 106X20 = 4X IO7(pfu/ml)。實施例4、噬菌體治療及效果評估將幼齡海參、體重約5 8g左右的大連刺參40只隨機(jī)分成4組，每組10只，均體腔注射哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)，接種劑量為IXlO9CFU/只。第1組，體腔注射前汕體腔注射為IX 109pfU/mL的哈維氏弧菌噬菌體懸液(感染復(fù)數(shù)為1)。第2組，在體腔注射的同時注射哈維氏弧菌噬菌體懸液(感染復(fù)數(shù)為1)。第3組，在體腔注射接種池后注射哈維氏弧菌噬菌體懸液(感染復(fù)數(shù)為1)。第4組為對照組，只體腔注射哈維氏弧菌。
權(quán)利要求
1. 一種噬菌體防治刺參腐皮綜合癥的應(yīng)用，其特征在于，通過特異性弧菌培養(yǎng)基以及回接感染試驗篩選致病性弧菌，對具有致病性的弧菌進(jìn)行生理生化以及分子生物學(xué)鑒定； 鑒定該菌株為哈維氏弧菌，利用分離得到的病原菌進(jìn)行噬菌體的分離，對分離得到的兩株不同大小噬菌斑的噬菌體進(jìn)行透射電鏡掃描，抑菌試驗；通過試驗可以得出分離得到的兩株噬菌體對哈維氏弧菌具有強(qiáng)烈的裂解作用。
全文摘要
一種噬菌體防治刺參腐皮綜合癥的應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。其特征是通過特異性弧菌培養(yǎng)基以及回接感染試驗篩選致病性弧菌，對具有致病性的弧菌進(jìn)行生理生化以及分子生物學(xué)鑒定；鑒定該菌株為哈維氏弧菌，利用分離得到的病原菌進(jìn)行噬菌體的分離，對分離得到的兩株不同大小噬菌斑的噬菌體進(jìn)行透射電鏡掃描，抑菌試驗。通過試驗可以得出分離得到的兩株噬菌體對哈維氏弧菌具有強(qiáng)烈的裂解作用。本發(fā)明可以專一性裂解目標(biāo)病原微生物，不會破壞水環(huán)境中的正常菌群。噬菌體能夠自我復(fù)制增殖，可保持長期持續(xù)作用，且其感染發(fā)生在水溶液狀態(tài)中，噬菌體不會殘留在動物體內(nèi)；安全無毒副作用，降解后的終產(chǎn)物是氨基酸和核酸片段，對人和動物安全。
文檔編號A01N63/02GK102172248SQ20111005024
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者徐永平, 李曉宇, 譚德猛, 金禮吉, 馬永生 申請人:大連理工大學(xué)