哈維氏弧菌巨噬菌體vp4b及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是巨噬菌體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種罕見(jiàn)的巨噬菌體VP4B，本發(fā)明利用雙層平板分離純化、基因組提取和核酸序列測(cè)定等技術(shù)對(duì)從環(huán)境中得到巨噬菌體VP4B，對(duì)其進(jìn)行了基因組核酸序列的測(cè)定和分析，得到了236，053bp核苷酸序列。巨噬菌體VP4B對(duì)致病性哈維氏弧菌有明顯抑制其生長(zhǎng)的作用，可用于海產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌病害的生物防治。
【專利說(shuō)明】哈維氏弧菌巨噬菌體VP4B及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是巨噬菌體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]細(xì)菌性感染是感染疾病中最常見(jiàn)的類型，過(guò)去幾十年里抗生素被認(rèn)為是治療細(xì)菌感染的最好方法。但是隨著近年來(lái)抗生素濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題日益加劇，人們把選擇其他抗菌劑的目光轉(zhuǎn)移到噬菌體上。相較傳統(tǒng)的抗生素，噬菌體的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)宿主菌有高度專一性，能夠持續(xù)自我繁殖，對(duì)抗藥菌株具有再侵染能力，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，無(wú)刺激。
[0003]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，噬菌體的地位越來(lái)越重要。對(duì)噬菌體的基因進(jìn)行研究，不僅為噬菌體的多樣性和進(jìn)化途徑提供了資源，也為噬菌體的生物學(xué)特性和其與宿主之間的相互作用提供了證據(jù)，同時(shí)也為噬菌體治療的安全性和可控性提供了保障。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種巨噬菌體VP4B及其應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人利用雙層平板分離純化、基因組提取和核酸序列測(cè)定等技術(shù)對(duì)從環(huán)境中得到噬菌體VP4B，對(duì)其進(jìn)行基因組核酸序列的測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)其基因組序列全長(zhǎng)246，964bp，GC含量為43.29%，含有210個(gè)預(yù)測(cè)的0RF。發(fā)明人于2013年5月9日將該噬菌體保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:湖北武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)CCT CC NO:M2013192，其分類命名為哈維氏弧菌噬菌體VP4B (Vibrioharveyi Phage VP4B)。
[0006]本發(fā)明的巨噬菌體VP4B可用于噬菌體功能基因組學(xué)、新型病毒載體構(gòu)建、進(jìn)行弧菌病害的預(yù)防和快速診斷，以及噬菌體吸附、侵染、裂解弧菌機(jī)制的研究。
[0007]根據(jù)后面的實(shí)施例，本發(fā)明中的巨噬菌體VP4B是裂解性噬菌體，能夠侵染哈維氏弧菌，在弧菌體內(nèi)復(fù)制增殖之后，能夠裂解哈維氏弧菌的細(xì)胞壁，致使弧菌裂解死亡?？梢杂行У目刂乒S氏弧菌的數(shù)量及增殖速度，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中哈維氏弧菌病害的防治。在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的巨噬菌體VP4B能夠明顯的抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)速度和濃度。
[0008]本發(fā)明可以根據(jù)巨噬菌體的抑菌曲線來(lái)對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌，特別是哈維氏弧菌，進(jìn)行病害防治以及病害防治酶材料的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的巨噬菌體的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌。
[0010]本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生巨噬菌體的方法，所述方法包括在細(xì)菌中培養(yǎng)本發(fā)明的巨噬菌體的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌，例如德國(guó)微生物菌種保藏中心以保藏號(hào):DSM-6904保藏的細(xì)菌。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0011]圖1為哈維氏巨噬菌體VP4B抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)OD曲線圖?！揪唧w實(shí)施方式】:
[0012]1.噬菌體的收集和濃縮
[0013](I) 向 200mL液體2216E培養(yǎng)基(lg酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高鐵，lL陳海水)的三角瓶中添加0.1mL哈維氏弧菌(購(gòu)自DSMZ，保藏號(hào):DSM_6904)溶液，并向所述三角瓶中添加0.1mL本發(fā)明的哈維氏巨噬菌體VP4B(保藏號(hào):CCTCC NO:M2013192)溶液，置于37°C培養(yǎng)箱，搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)。向培養(yǎng)后的液體中加入酶抑制劑苯甲基磺酰氟PMSF使其終濃度為ImM，以15000 Xg進(jìn)行20min的離心。
[0014](2)取上清加入NaCl，使其終濃度為IM ;加入聚乙二醇PEG6000 (Sigma,25322-68-3)，使其終濃度為10%，在4°C下放置l_3h。[0015](3)以 15000Xg 在 4°C下離心 lh。
[0016](4)去上清，用 2mL 的 SM 緩沖液(Amrecso, J614-500ML)重懸，以 3000Xg 進(jìn)行15min離心，去沉淀。
[0017](5)將離心上清液在氯化銫溶液(1.5g/mL)中，以220000Xg在4°C下離心24h。
[0018](6)用一次性針筒收集噬菌體。
[0019]2.嗤囷體基因組的提取
[0020](I)在上述步驟I中制備的ImL噬菌體顆粒懸浮液中加入DNase/RNase混合物(Takara, 2210CA/R0675)(終濃度為2mL/L)，混合均勻，在37°C的水浴中孵浴45min。
[0021](2)加入 150 μ L TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8.0)和 30 μ LlO %(w/v) SDS溶液，上下顛倒，在70°C的水浴中孵育lOmin。
[0022](3)加入125 μ L乙酸-乙酸鉀緩沖液(ρΗ4.3)，在冰水浴中孵育30min_lh。
[0023](4)以 14，OOOXg 在 4°C下離心 15min。
[0024](5)在離心上清液中，添加等體積苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)，劇烈混合5min,以14，OOOXg在4°C下離心5min。重復(fù)此步驟直到無(wú)白色蛋白雜質(zhì)。
[0025](6)將離心上清液分為兩管，用等體積異丙醇在_20°C下靜止lh。
[0026](7)以 14，OOOXg 在 4°C下離心 20min。
[0027](8)棄去離心上清液，用80%乙醇洗滌沉淀。
[0028](9)置于超凈臺(tái)中風(fēng)干。
[0029]3.對(duì)步驟2提取的噬菌體基因組DNA進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定、拼接和分析:
[0030]由深圳華大基因研發(fā)中心完成測(cè)序。采用Glimmer軟件從組裝結(jié)果中獲得基因序列的ORF，并BLAST進(jìn)行功能分析。序列分析表明，其基因組序列全長(zhǎng)246，964bp，GC含量為43.29%，含有210個(gè)預(yù)測(cè)的ORF。其中34046位至34561位核苷酸序列編碼噬菌體的二氫葉酸還原酶，第35408位至36316位核苷酸序列編碼噬菌體的胸腺甘酸合成酶，其第86182位至第86889位核苷酸序列編碼噬菌體的調(diào)節(jié)蛋白，第112547位至114532位核苷酸序列編碼噬菌體的RNA聚合酶，第201168位至第203135位核苷酸序列編碼噬菌體的DNA連接酶，第207525位至第208049位核苷酸序列編碼噬菌體的核糖核酸酶。
[0031]還與已知的哈維氏弧菌噬菌體(GenBank:AY283928)進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明，VP4B與其能形成很好的比對(duì)，同時(shí)也有基因移位的現(xiàn)象，證明這是一種全新的哈維氏弧菌噬菌體。[0032]4.噬菌體抑制哈維氏弧菌增殖的OD曲線圖
[0033](1) 向兩個(gè)各裝有 500mL液體2216E培養(yǎng)基(lg酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高鐵，IL陳海水)的三角瓶A、B中添加0.1mL哈維氏弧菌(購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ)，保藏號(hào):DSM-6904)溶液，向A瓶中添加0.1mL步驟I中制備的巨噬菌體VP4B溶液，置于37°C培養(yǎng)箱,搖瓶培養(yǎng)。
[0034](2)每隔一小時(shí)取A、B瓶中培養(yǎng)液lmL，以8000 X g在4°C下離心5min，用干凈的2216E培養(yǎng)基洗滌沉淀3次，用干凈的2216E培養(yǎng)基重懸浮。用分光光度計(jì)測(cè)定0D600的吸光度。
[0035](3)每組做三個(gè)平行樣品，求得標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0036]如圖1中所示的結(jié)果表明，本發(fā)明的巨噬菌體VP4B能夠明顯的抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)速度和濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種巨噬菌體，其以保藏號(hào)M2013192保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.權(quán)利要求1的巨噬菌體用于抑制哈維氏弧菌的用途。
3.權(quán)利要求1的巨噬菌體用于的水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌病害的防治的用途。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述弧菌是哈維氏弧菌。
5.包含權(quán)利要求1的巨噬菌體的細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5的細(xì)菌，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌。
7.—種產(chǎn)生巨噬菌體的方法，所述方法包括在細(xì)菌中培養(yǎng)權(quán)利要求1的巨噬菌體的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述哈維氏弧菌是德國(guó)微生物菌種保藏中心以保藏號(hào):DSM-6904保藏的細(xì)菌。`
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103555671SQ201310263942
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】駱祝華, 葉德贊, 于艷萍 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所