一種新的轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明名為“一種新的轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法”，涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明通過設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)基因米曲霉特異序列的帶標(biāo)記的引物和探針，結(jié)合應(yīng)用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因米曲霉的準(zhǔn)確、高效快速檢測(cè)。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)的準(zhǔn)確性、縮短檢測(cè)時(shí)間具有重要的作用。本檢測(cè)試劑盒使用方便快捷，原理和操作簡單，可應(yīng)用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米曲霉。
【專利說明】一種新的轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種利用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條技術(shù)相結(jié)合的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米曲霉的試劑盒，適用于轉(zhuǎn)基因米曲霉的快速檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]米曲霉(Aspergillus oryzae),屬于半知菌亞門，絲孢綱,絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，是真菌中的一個(gè)常見種。分布廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等，是一種非常重要的工業(yè)用菌種。
[0003]目前酶制劑產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因微生物檢測(cè)的技術(shù)還是主要依靠傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度低，通常需要幾天時(shí)間。近些年來，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)成了快速檢測(cè)的常用手段。但是擴(kuò)增產(chǎn)物需要凝膠電泳，紫外凝膠成像，步驟多，耗時(shí)長，而且存在EB染色劑污染的問題。
[0004]本研究通過巧妙地設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)基因米曲霉的帶標(biāo)記的特異性引物和探針，應(yīng)用 PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因米曲霉的高效快速檢測(cè)。該方法特異性強(qiáng)， 靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因米曲霉的準(zhǔn)確快速檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米曲霉的兩套特異性引物和探針。[0006]本發(fā)明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的核酸試紙條檢測(cè)試劑盒。[0007]本發(fā)明用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米曲霉的兩套PCR引物及探針序列為:[0008]上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’[0009]下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’[0010]探針 1:PyrG-P-fitc:5`’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’[0011]上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3’[0012]下游引物 2:Np1-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’[0013]探針 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’[0014]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)試劑盒，包括以下成分:[0015](I)轉(zhuǎn)基因米曲霉DNA模板和陰性對(duì)照野生型米曲霉模板[0016](2)轉(zhuǎn)基因米曲霉帶標(biāo)記的上、下游引物和探針[0017]上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?[0018]下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’[0019]探針 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?[0020]上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3?[0021]下游引物 2:Np1-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’[0022]探針2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3J
[0023](3) IOXTaq PCR Buffer, DDH2O, 2.5mM dNTP，5U / μ I Taq 酶
[0024]分別用上述方法對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用試紙條檢測(cè)，兩套引物探針的檢測(cè)結(jié)果顯示控制線正常，檢測(cè)線呈現(xiàn)陽性，則說明該樣品含有轉(zhuǎn)基因米曲霉，若至少有一套引物、探針檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性，則說明該樣品中不含有轉(zhuǎn)基因米曲霉。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于:無需瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像，從而避免了溴化乙錠的污染，而且檢測(cè)結(jié)果直觀、可視，從PCR擴(kuò)增到觀察結(jié)果只需IOOmin左右，大大優(yōu)于凝膠電泳成像。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1、圖2轉(zhuǎn)基因米曲霉試劑盒特異性測(cè)試結(jié)果，其中圖1為PyrG特異性檢測(cè)、圖2為Npl特異性檢測(cè)，I為陰性對(duì)照，2、3、4、5、6、7為野生型米曲霉，8為轉(zhuǎn)基因米曲霉，從圖1、圖2可以看出，只有轉(zhuǎn)基因米曲霉出現(xiàn)特異條帶，使用本試劑盒能準(zhǔn)確地檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因米曲霉。
【具體實(shí)施方式】
[0027]第一套PyrG特異引物、探針設(shè)計(jì):
[0028]`
【權(quán)利要求】
1.兩套用于轉(zhuǎn)基因米曲霉檢測(cè)的特異性引物和探針，其特征在于，序列為:
上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’
下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’
探針 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’
上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3’
下游引物 2:Npl-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’
探針 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’。
2.一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米曲霉的試劑盒其特征在于，包括如下成分: (1)陽性對(duì)照轉(zhuǎn)基因米曲霉DNA模板和陰性對(duì)照野生型米曲霉DNA模板 (2)轉(zhuǎn)基因米曲霉PyrG、Npl上下游特異引物和探針
上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?
下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’
探針 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?
上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3’
下游引物 2:Npl-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’
探針 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’
(3)IOXExTaq PCR Buffer, ddH20，2.5mM dNTP,5U/y IExTaq 酶 (4)生物素(biotin)、熒光素(fitc)抗原標(biāo)記的薄膜層析試紙條。
3.—種轉(zhuǎn)基因米曲霉的快速檢測(cè)方法，包括如下步驟: (1)PCR反應(yīng)體系:
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103497992SQ201310263785
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】張?jiān)＞? 趙衛(wèi)東, 劉國紅, 賀艷, 鄭文杰 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心