一種rna片段及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備RNA片段的方法，該方法包括：（1）獲得化學(xué)合成的雙鏈DNA；（2）將所述化學(xué)合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒，并分別對(duì)多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴(kuò)增質(zhì)粒的克隆作為模板質(zhì)粒；（3）對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物，并從酶切產(chǎn)物中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄模板片段；（4）對(duì)所述轉(zhuǎn)錄模板片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了如上所述的方法制備得到的RNA片段及其用途。本發(fā)明大幅度地提高了制備的RNA片段在序列和長(zhǎng)度上的完全正確性和均一度。
【專利說明】一種RNA片段及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體地，涉及分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種 制備RNA片段的方法、該方法制備得到的RNA片段以及該RNA片段的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 最近十幾年小的非編碼 RNA(small non-coding RNAs)，尤其是微 RNA(microRNA， 即miRNA)的研究非?；馃?，技術(shù)人員非?？春靡晕NA作為靶點(diǎn)來研發(fā)診斷試劑盒和研發(fā) 小核酸藥物的前景（Jackson and Levin, 2012;van Rooij et al·，2012)。由于微RNA通常 只有18-30個(gè)堿基（Bartel, 2004)，而且一個(gè)家族的不同微RNA成員可能只有1-2個(gè)堿基的 差異（WWW. mirbase.com)，因此用雜交方法來檢測(cè)微RNA時(shí)，對(duì)探針的純度要求高。如果探 針有堿基突變的話，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為假陰性或假陽(yáng)性（Barad et al.，2004)。
[0003] 現(xiàn)有的生產(chǎn)微RNA探針的方法有兩種：一種是通過化學(xué)合成與微RNA互補(bǔ)的 RNA鏈，然后通過末端轉(zhuǎn)移酶把一個(gè)帶DIG或其它標(biāo)記物的核苷酸加在RNA鏈的末端， 從而使探針被標(biāo)記好，以便于后續(xù)的檢測(cè)，這類探針在早期發(fā)表的微RNA文獻(xiàn)中大量使 用（Chen，2004)。第二種方法是在化學(xué)合成與微RNA互補(bǔ)的DNA探針時(shí)，把RNA核苷酸 類似物鎖核酸（locked nucleic Acid, LNA)參入探針中，得到鎖核酸修飾的DNA探針 (LNA-modified DNA probes,如Exiqon公司生產(chǎn)的產(chǎn)品)，然后再通過末端標(biāo)記使探針的一 端或兩端都帶上DIG或其它的標(biāo)記物。現(xiàn)在，這種LNA修飾的DNA探針被大量應(yīng)用于檢測(cè) 微RNA的研究中。
[0004] 上述兩種方法的缺點(diǎn)有三：第一，RNA或DNA的化學(xué)合成都是從核酸的3'向5'端 逐漸加上單個(gè)的堿基，因?yàn)槊看魏铣梢粋€(gè)堿基時(shí)效率都達(dá)不到l〇〇%(Reese，2005)，所以無(wú) 論是化學(xué)合成的RNA還是DNA，都有一定的錯(cuò)誤率，且錯(cuò)誤率隨合成的核苷酸長(zhǎng)度的增加而 增加。雖然合成后的純化(常用HPLC或PAGE純化）能幫助富集預(yù)期目的大小的核苷酸，但 無(wú)法減少擁有同樣大小的序列突變的雜質(zhì)核苷酸。第二，其標(biāo)記探針的方法都是在探針的 一端或兩端加上帶標(biāo)記的一個(gè)堿基，這使得探針的序列比要檢測(cè)的微RNA序列多1或2個(gè) 堿基，這會(huì)影響探針的特異性。第三，因?yàn)樘结樧疃嘀粩y帶兩個(gè)標(biāo)記物，所以檢測(cè)的靈敏度 有限，無(wú)法檢測(cè)那些低豐度表達(dá)的微RNA。
[0005] 已經(jīng)公開了用T7RNA聚合酶（T7RNA polymerase)以體外轉(zhuǎn)錄的方式制備短RNA的 方法（Milligan et al.，1987)，具體地，該方法使用了如下3種模板：（1)化學(xué)合成的完全 雙鏈DNA，其編碼鏈由T7啟動(dòng)子和RNA片段的DNA模板連接而成；（2)酶切線性化的質(zhì)粒雙 鏈DNA，其編碼鏈由線性載體片段、T7啟動(dòng)子和目的RNA片段的編碼DNA連接而成；（3)化 學(xué)合成的由雙鏈區(qū)和單鏈區(qū)連接而成的DNA，雙鏈區(qū)為完全雙鏈的T7啟動(dòng)子，單鏈區(qū)為RNA 探針的DNA模板。用該方法制備短RNA探針，會(huì)存在下列問題：（1)化學(xué)合成的模板會(huì)引入 和擴(kuò)增DNA合成時(shí)的突變，從而降低了探針的純度和特異性；（2)以酶切線性化的質(zhì)粒雙鏈 DNA為模板的方法，雖然保證了模板的完全正確性，但由于該方法使用的是一型限制性內(nèi)切 酶，所以線性化的模板在編碼RNA的序列后面銜接著酶切位點(diǎn)的殘余序列，使得轉(zhuǎn)錄出來 的RNA比目的RNA片段多幾個(gè)堿基，也降低了探針的特異性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的RNA探針的特異性較低和靈敏度較差的缺陷，提供一 種特異性較高且靈敏度較好的RNA片段及其制備方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種制備RNA片段的方法，該方法包 括：（1)獲得化學(xué)合成的雙鏈DNA，所述化學(xué)合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對(duì)而成； 在從所述編碼鏈的5'至3'方向上，第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的RNA片段的編碼 DNA和第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)依次連接；（2)將所述化學(xué)合成的雙鏈DNA片段克隆至載體 中以得到多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒，并分別對(duì)多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序；挑選能夠完 全正確編碼目的RNA片段的擴(kuò)增質(zhì)粒的克隆作為模板質(zhì)粒；（3)使用第一內(nèi)切酶和第二內(nèi) 切酶對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物，并從酶切產(chǎn)物中分離能夠完全正確編碼目的RNA 片段的轉(zhuǎn)錄模板片段；其中，第二內(nèi)切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開， 以使轉(zhuǎn)錄模板片段的模板鏈的5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈； (4)對(duì)所述轉(zhuǎn)錄模板片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到含有目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0008] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種RNA片段，該RNA片段是根據(jù)如上所述的方法制備 得到的。
[0009] 再一方面，本發(fā)明還提供了 RNA片段在制備核酸藥物、檢測(cè)試劑盒或診斷試劑盒 中的用途。
[0010] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明大幅度地提高了制備RNA片段在序列和長(zhǎng)度上的完全 正確性和均一度，由此提高了 RNA探針的特異性和靈敏度。
[0011] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0013] 圖1舉例性地顯示了本發(fā)明的制備RNA片段的策略。
[0014] 圖2顯示了轉(zhuǎn)錄模板片段T1 (泳道1)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1 (泳道2)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1-DB1 (泳道4)、轉(zhuǎn)錄模板片段T2 (泳道6)和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R2 (泳道7)的電泳結(jié)果，泳道3、5和8分 別為分子量標(biāo)記。
[0015] 圖3顯示了來源于同一個(gè)小鼠胚胎的發(fā)育13. 5天的冠狀切片標(biāo)本（A，B)和發(fā)育 11.5天的矢狀切片標(biāo)本（C，D)。同時(shí)用本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針（B，D)或購(gòu)自Exiqon 公司的靶向miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào)38474-05)(A，C)雜交 顯色3個(gè)小時(shí)后，本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針檢測(cè)到的信號(hào)（B，D)明顯強(qiáng)于購(gòu)自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05) (A，C)。
[0016] 圖4顯示了來源于同一個(gè)小鼠胚胎的發(fā)育13. 5天的冠狀切片標(biāo)本（A，B)和發(fā)育 11.5天的矢狀切片標(biāo)本（C，D)。同時(shí)用本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針（A，C)或購(gòu)自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05) (B，D)雜 交后，本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到的信號(hào)非常強(qiáng)（A，C);相反， 購(gòu)自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（B，D)在顯色72個(gè)小時(shí)檢測(cè)到的信號(hào)還是很弱。 這說明本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針比購(gòu)自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)更加靈敏。
[0017] 圖5顯示了在胚胎發(fā)育11. 5天的小鼠胚胎矢狀切片的背根神經(jīng)節(jié)中，本發(fā)明生產(chǎn) 的miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到miR-96特異地高表達(dá)(A);相反，購(gòu)自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)在顯色 72 個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到的信號(hào)還是很微弱，與背景差別不大（B)。
[0018] 圖6顯示了在胚胎發(fā)育13. 5天的小鼠胚胎冠狀切片的背根神經(jīng)節(jié)中，本發(fā)明生 產(chǎn)的miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到miR-96的信號(hào)非常強(qiáng)、而且非常特異（A); 相反，購(gòu)自Exiqon公司的祀向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)在顯色72個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到miR-96的信號(hào)還是非常弱，與背景難以區(qū)分（B)。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020] 本發(fā)明提供了一種制備RNA片段的方法，該方法包括：（1)獲得化學(xué)合成的雙鏈 DNA，所述化學(xué)合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對(duì)而成；在從所述編碼鏈的5'至3'方 向上，第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的RNA片段的編碼DNA和第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn) 依次連接；（2)將所述化學(xué)合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒， 并分別對(duì)多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴(kuò)增 質(zhì)粒的克隆作為模板質(zhì)粒；（3)使用第一內(nèi)切酶和第二內(nèi)切酶對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到 酶切產(chǎn)物，并從酶切產(chǎn)物中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄模板片段；其中，第 二內(nèi)切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開，以使轉(zhuǎn)錄模板片段的模板鏈的 5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈；（4)對(duì)所述轉(zhuǎn)錄模板片段進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)錄，得到含有目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0021] 其中，需要制備的RNA片段即為目的RNA片段；目的RNA的長(zhǎng)度沒有特別的要 求，可以為常規(guī)的作為探針和/或核酸藥物的RNA片段的長(zhǎng)度，例如為5-200bp，優(yōu)選為 8-100bp，更優(yōu)選為10-50bp，特別優(yōu)選為15-30bp。目的RNA的堿基序列也沒有特別的要求， 可以為常規(guī)的作為探針和/或核酸藥物的RNA片段的堿基序列，如數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase(http:// www. mirbase. org/)> miR2Disease (http://www. mir2disease. org/)中所記載的各 miRNA 的堿基序列或它們的反向互補(bǔ)序列。
[0022] 其中，化學(xué)合成雙鏈DNA的操作可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式進(jìn)行，例如使用固相 DNA合成法分別合成模板鏈的單鏈DNA和編碼鏈的單鏈DNA。
[0023] 其中，編碼鏈，又稱正義鏈，是指與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（RNA)序列相同(僅僅將T替換為U)的 那條DNA單鏈。
[0024] 其中，模板鏈，又稱反義鏈，是指與編碼鏈互補(bǔ)的那條DNA單鏈。
[0025] 其中，"互補(bǔ)"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸類似物的堿基按照Watson-Crick 配對(duì)原則（A-T、A-U、C-G)的配對(duì)。"完全互補(bǔ)"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸類似物的 喊基100%的互補(bǔ)。"完全正確"是指測(cè)定的喊基序列與目的喊基序列具有100%的一致性。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，第一內(nèi)切酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的I型核酸 內(nèi)切酶或II型核酸內(nèi)切酶（EC3. 1. 22. 1)，例如NEB公司出售的各種限制性核酸內(nèi)切酶 (https://www. neb. com/products/restriction-endonucleases)，包括但不限于 Aatll，A baSI, Acc65I, AccI, Acil, Acll, Acul, Afel, Aflll, Afllll, Agel, Ahdl, Alel, Alul, Alwl, A1 wNI, Apal, ApaLI, ApeKI, Apol, AscI, AscI, Asel, AsiSI, Aval, Avail, AvrII, BaeGI, Bael, B amHI, BanI, Banll, Bbsl, BbvCI, Bbvl, BccI, BceAI, Bcgl, BciVI, Bell, BcoDI, Bfal, BfuAI, BfuCI, Bgll, Bglll, BlpI, BmgBI, Bmrl, Bmtl, Bpml, BpulOI, BpuEI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, Bs al, BsaJI, BsaffI, BsaXI, BseRI, BseYI, Bsgl, BsiEI, BsiHKAI, BsiffI, BslI, BsmAI, BsmBI, B smFI, BsmI, BsoBI, Bspl286I, BspCNI, BspDI, BspEI, BspHI, BspMI, BspQI, BsrBI, BsrDI, Bs rFI, BsrGI, BsrI, BssHII, BssKI, BssSI, BstAPI, BstBI, BstEII, BstNI, BstUI, BstXI, BstY I, BstZ17I, Bsu36I, Btgl, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, Cac8I, Clal, CspCI, CviAII, CviK 1-1, CviQI, Ddel, Dpnl, DpnII, Dral, Dralll, DrdI, Eael, EagI, Earl, Ecil, Eco53kI, EcoNI, Eco0109I, EcoP15I, EcoRI, EcoRV, Fatl, Faul, Fnu4HI, FokI, Fsel, FspEI, FspI, Haell, Hael II, Hgal, Hhal, Hindi, Hindlll, Hinfl, HinPlI, Hpal, Hpall, HphI, Hpyl66II, Hpyl88I, Hpy 188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4III, HpyCH4IV, HpyCH4V, I-CeuI, I-Scel, KasI, Kpnl, LpnPI, Mbol, MboII, Mfel, MluCI, Mlul, Mlyl, Mmel, Mnll, MscI, Msel, MslI, MspAlI, MspI, MspJI, Mw ol, Nael, Narl, Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Neil, Ncol, Ndel, NgoMIV, Nhel, Nla III, NlalV, NmeAIII, Notl, Nrul, Nsil, NspI, Nt. Alwl, Nt. BbvCI, Nt. BsmAI, Nt. BspQI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, PacI, PaeR7I, Pcil, PflFI, PflMI, Phol, PI-PspI, PI-SceI, Plel, PluTI ,Pmel, Pmll, PpuMI, PshAI, Psil, PspGI, PspOMI, PspXI, PstI, Pvul, PvuII, Rsal, RsrII, Sac I, SacII, Sail, SapI, Sau3AI, Sau96I, Sbfl, Seal, ScrFI, SexAI, SfaNI, Sfcl, Sfil, Sfol, Sg rAI, Smal, Smll, SnaBI, Spel, Sphl, SspI, StuI, StyD4I, Styl, Styi-HF?，Swal, Taq α I，Tfi 1, Tlil, Tsel, Tsp45I, Tsp509I, TspMI, TspRI, Tthllll, Xbal, Xcml, Xhol, Xmal, XmnI, Zral ； 優(yōu)選為SnaBI或BtsCI。
[0027] 其中，第二內(nèi)切酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的I型核酸內(nèi)切酶或II型核酸內(nèi)切酶， 且能在目的RNA片段的編碼DNA的3'末端切開，以使轉(zhuǎn)錄模板片段的模板鏈的5'末端能 與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈；例如上面所列出的酶，優(yōu)選為BtsCI。
[0028] 優(yōu)選地，目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端的1-7個(gè)堿基是第二內(nèi)切酶的 酶切位點(diǎn)的片段(也就是目的RNA片段的編碼DNA與第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)存在重疊 (overlap))，并且，第二內(nèi)切酶的切割點(diǎn)恰好為DNA模板鏈的5'末端的第1個(gè)核苷酸的5' 一側(cè)。例如BtsCI的酶切位點(diǎn)在編碼鏈上的序列為5' -NNCATCC-3'，而BtsCI的酶切位點(diǎn) 在模板鏈上的序列為3'-NNGTAGG-5'（即5'-GGATGNN-3'），此時(shí)，目的RNA片段的DNA模板 鏈的5'末端的第1和第2個(gè)堿基是BtsCI的酶切位點(diǎn)中的NN，BtsCI的切割點(diǎn)恰好為目的 RNA片段的DNA模板鏈的5'末端的第1個(gè)核苷酸的5' 一側(cè)（即5' -GGATG-3'和5' -NN-3' 之間）。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其中，可以通過第一內(nèi)切酶和/或第二內(nèi)切酶的具 體選擇，以避免在啟動(dòng)子和目的RNA片段的編碼DNA中出現(xiàn)第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)或第二 內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。例如，當(dāng)目的RNA片段的編碼DNA中出現(xiàn)EcoRI的酶切位點(diǎn)時(shí)，要避免 使用EcoRI作為第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)或第二內(nèi)切酶位點(diǎn)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，啟動(dòng)子是指能夠被RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合并 且在5' -3'方向上促使RNA合成的特異性DNA序列?？梢愿鶕?jù)不同的RNA聚合酶選 擇該RNA聚合酶對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子。優(yōu)選使用高保真（即突變幾率小）的RNA聚合酶，例如 T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。優(yōu)選情況下，所述啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子 (TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID N0:5)、SP6啟動(dòng)子（GATTTAGGTGACACTATAG，SEQ ID N0:6) 或 T3 啟動(dòng)子（AATTAACCCTCACTAAAGG，SEQ ID N0:7)。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，目的RNA片段可以為各種需要合成的RNA片段，例 如RNA探針、RNA藥物等，優(yōu)選情況下，目的RNA片段為靶向miRNA的RNA探針。其中，RNA 探針是指用于RNA雜交的RNA片段。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接作為含有目的RNA片 段的物料使用，優(yōu)選情況下，該方法還包括，從轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中純化RNA片段。
[0033] 其中，純化RNA片段的操作可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行，例如進(jìn)行核酸凝膠 電泳和切膠回收，或者高壓液相色譜純化。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，優(yōu)選情況下，所述編碼鏈的序列為SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:3。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄所用的核糖核苷三磷酸中的至少一 部分為帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸。
[0036] 其中，"標(biāo)記"是指能夠通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他手段 檢測(cè)到的基團(tuán)或化合物。例如，常用的標(biāo)記包括但不限于 32P、熒光染料、生物素、地高辛或 半抗原。標(biāo)記可以在轉(zhuǎn)錄所得的RNA中的任意位置摻入，例如在5'末端、3'末端或中間。
[0037] 其中，優(yōu)選情況下，所述帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地高辛修飾的核 糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖胞嘧啶三磷酸、生物 素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、熒光素修飾的核糖胞嘧啶 三磷酸、熒光素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖腺嘌呤三磷酸、氚標(biāo)記的核糖 尿嘧啶三磷酸、 32P標(biāo)記的核糖尿嘧啶三磷酸、32P標(biāo)記的核糖胞嘧啶三磷酸或32P標(biāo)記的核 糖腺嘌呤三磷酸。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，優(yōu)選情況下，所述帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸 為帶有地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸，且?guī)в械馗咝列揎椀暮颂悄蜞奏と姿岷筒粠в?地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸的摩爾比為1.5-4:1，更優(yōu)選為1.8-3:1，更進(jìn)一步優(yōu)選為 1. 9-2. 5:1，最優(yōu)選為 2:1。
[0039] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種RNA片段，其中，該RNA片段是根據(jù)如上所述的方 法制備得到的。
[0040] 再一方面，本發(fā)明還提供了 RNA片段在制備核酸藥物、檢測(cè)試劑盒或診斷試劑盒 中的用途。
[0041] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，各分子生物學(xué)試劑 均為市售品，各分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的操作均可按工具書（Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press;4th edition)及各試劑的使用說明書進(jìn) 行。
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 參考圖1，本實(shí)施例按照以下方式制備轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：
[0044] (1)委托上海鉬宜生物科技有限公司化學(xué)合成以下4條DNA單鏈：
[0045] 單鏈 SS1，MiR-96 探針的正向序列(SnaBI-T7-MiR96~BtsCI)；
[0046] TACGTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAACG CATCC(SEQ ID NO:1);
[0047] 單鏈 SS2, MiR-96 探針的反向互補(bǔ)序列(BtsCI-MiR96-T7~SnaBI)；
[0048] GGATGCGTTTGGCACTAGCACATTTTTGCTCCCTATAGTGAGTCGTATT ACGTA(SEQ ID NO:2)；
[0049] 單鏈 SS3, MiR_2〇OC 探針的正向序列(BtsCI-SP6-MiR200c-BtsCI)；
[0050] GGATGCGGATTTAGGTGACACTATAGTCCATCATTACCCGGCAGTATTA CGCATCC(SEQ ID NO:3)；
[0051] 單鏈 SS4, MiR-200C 探針的反向互補(bǔ)序列(BtsCI-MiR200c-SP6-BtsCI)
[0052] GGATGCGTAATACTGCCGGGTAATGATGGACTATAGTGTCACCTAAATC CGCATCC (SEQ ID NO:4)〇
[0053] 其中，單鏈SSI是編碼鏈，單鏈SS2是模板鏈，單鏈SSI和單鏈SS2經(jīng)過變 性退火處理后即得到化學(xué)合成的雙鏈DNA，命名為雙鏈DS1 ;在DS1的編碼鏈（即單鏈 SS1)的5'至3'方向上，第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（即SnaBI的酶切位點(diǎn)，GGATGCG)、啟 動(dòng)子（即 17 啟動(dòng)子，TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID N0:5)、RNA 片段的編碼 DNA (即， AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID N0:8)和第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（S卩BtsCI的酶切位點(diǎn)， CGCATCC)依次連接。
[0054] 其中，單鏈SS3是編碼鏈，單鏈SS4是模板鏈，單鏈SS3和單鏈SS4經(jīng)過變 性退火處理后即得到化學(xué)合成的雙鏈DNA，命名為雙鏈DS2 ;在DS2的編碼鏈（即單鏈 SS3)的5'至3'方向上，第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（即BtsCI的酶切位點(diǎn)，GGATGCG)、啟 動(dòng)子（即 SP6 啟動(dòng)子，GATTTAGGTGACACTATAG, SEQ ID N0:6)、RNA 片段的編碼 DNA (即， TCCATCATTACCCGGCAGTATTA, SEQ ID N0:9)和第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（S卩BtsCI的酶切位點(diǎn)， CGCATCC)依次連接。
[0055] (2)將雙鏈DS1克隆到載體pUC57的EcoRV酶切位點(diǎn)處，得到多個(gè)單克隆的質(zhì)粒 PUC57-DS1。具體地，將載體pUC57用EcoRV酶切開，然而后用DNA連接酶（T41igase，購(gòu)自 NEB，以下同）把切開的pUC57和DS1進(jìn)行核酸連接，得到連接產(chǎn)物；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞(大腸桿菌DH5 α菌株)，挑選4個(gè)單克隆并擴(kuò)增得到質(zhì)粒pUC57-DSl。
[0056] 同上述方法將雙鏈DS2克隆到pUC57的EcoRV酶切位點(diǎn)處，得到4個(gè)單克隆的質(zhì) 粒PUC57-DS2。
[0057] 將4個(gè)單克隆的質(zhì)粒PUC57-DS1分別進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示其中有1個(gè)克隆含 有的插入序列與RNA片段的編碼DNA(g卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQIDN0:8)不完 全一致，因而不能完全正確編碼RNA片段；而剩余的3個(gè)克隆含有的插入序列與RNA片段的 編碼DNA (S卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID勵(lì):8)完全一致，能夠完全正確編碼尺隱 片段。挑選任意1個(gè)能夠完全正確編碼RNA片段的pUC57-DSl質(zhì)粒作為模板質(zhì)粒，命名為 模板質(zhì)粒TP1。
[0058] 將4個(gè)單克隆的pUC57-DS2分別進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示其中有2個(gè)克隆含有的 插入序列與RNA片段的編碼DNA(g卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQIDN0:9)不完全一 致，因而不能完全正確編碼RNA片段；而剩余的2個(gè)克隆含有的插入序列與RNA片段的編碼 DNA (S卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQ ID勵(lì):9)完全一致，能夠完全正確編碼1?隱片段。 挑選任意1個(gè)能夠完全正確編碼RNA片段的pUC57-DS2質(zhì)粒作為模板質(zhì)粒，命名為模板質(zhì) 粒 TP2。
[0059] (3)使用51^81和財(cái)8(：1對(duì)模板質(zhì)粒了？1進(jìn)行酶切，然后通過電泳切膠法分離酶切 產(chǎn)物中的小片段(約50bp)，該分離的小片段即為能夠完全正確編碼RNA片段的轉(zhuǎn)錄模板片 段T1。
[0060] 使用BtsCI對(duì)模板質(zhì)粒TP2進(jìn)行酶切，然后通過電泳切膠法分離酶切產(chǎn)物中的小 片段(約50bp)，該分離的小片段即為能夠完全正確編碼RNA片段的轉(zhuǎn)錄模板片段T2。
[0061] (4)使用體外轉(zhuǎn)錄體系對(duì)轉(zhuǎn)錄模板片段T1進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1。體外 轉(zhuǎn)錄體系采用購(gòu)自Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，其中含有IX轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM的 DTT，40 單位的 RNA 酶抑制劑、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (購(gòu)自Roche Applied Science公司）和40單位的T7RNA聚合酶。體外轉(zhuǎn)錄的 時(shí)間為4h，溫度為37°C，模板用量為5ng/l·! L。
[0062] 使用體外轉(zhuǎn)錄體系對(duì)轉(zhuǎn)錄模板片段T2進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R2。體外轉(zhuǎn) 錄體系采用購(gòu)自Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，其中含有IX轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM的 DTT，40 單位的 RNA 酶抑制劑、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (購(gòu)自Roche Applied Science公司）和40單位的SP6RNA聚合酶。體外轉(zhuǎn)錄 的時(shí)間為4h，溫度為37°C，模板用量為5ng/l·! L。
[0063] 對(duì)比例1
[0064] 采用實(shí)施例1的方法制備RNA產(chǎn)物，不同的是將載體pUC57替換為載體 pcDNA3. 1 (+)，并用Pmel酶將pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒線性化以使pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒中自帶的 ?7啟動(dòng)子后面只連接22bp的模板序列，然后通過電泳切膠法分離線性化的質(zhì)粒，該分離 的片段作為轉(zhuǎn)錄模板片段T1-DB1。然后采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 R1-DB1。
[0065] 對(duì)比例2
[0066] 采用實(shí)施例1的方法制備轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，不同的是將單鏈SS1和單鏈SS2經(jīng)過變性退 火處理后得到的化學(xué)合成的雙鏈DS1作為轉(zhuǎn)錄模板片段T1-DB2。然后采用實(shí)施例1的方法 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1-DB2。
[0067] 測(cè)試實(shí)施例1
[0068] 將轉(zhuǎn)錄模板片段T1、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1-DB1、轉(zhuǎn)錄模板片段T2和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 R2用濃度為15%的PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果見圖2。
[0069] 圖2的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1 (泳道2)中大部分是預(yù)期大小（23bp)和比預(yù)期大小 少一個(gè)堿基的產(chǎn)物，另有一些比預(yù)期大小大的RNA產(chǎn)物。圖2的結(jié)果還顯示，以線性化載體 (轉(zhuǎn)錄模板片段T1-DB1)為模板不能精確轉(zhuǎn)錄短的RNA，未見預(yù)期的22bp的RNA (泳道4)。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R2 (泳道7)中也含有精確大小的RNA探針，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要是預(yù)期大?。?3bp) 的RNA和比預(yù)期大小大一個(gè)堿基（24bp)的RNA。
[0070] 實(shí)施例2
[0071] 將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R2用濃度為15%的PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果與圖2 中的泳道2和泳道7相同。切下23bp位置處的凝膠，并且從切下的凝膠中回收RNA片段， 以達(dá)到純化RNA片段的目的，分別得到靶向miRNA-96的探針1和靶向miRNA-200c的探針 2〇
[0072] 具體的從凝膠中回收RNA片段的操作包括：把膠切成小碎片，用3倍體積的 1 XTBE洗脫搖過夜，離心（600X g，lmin)后，把上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，加相當(dāng)于上清 液〇. 7倍體積的異丙醇沉淀RNA，用lmL的70%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，風(fēng)干RNA沉淀，力口 10 μ 1無(wú)核酸酶的水溶解RNA沉淀，即得到溶解有RNA探針的水溶液。
[0073] 對(duì)比例3
[0074] 采用實(shí)施例2的方法純化RNA片段，不同的是對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1-DB2進(jìn)行純化，得到 探針1-DB2。
[0075] 測(cè)試實(shí)施例2
[0076] 按照文獻(xiàn)（Peng et al. ,2012)中的方法分別制備8μπι厚的11.5日齡和13.5 日齡的小鼠胚胎的切片。并按照上述文獻(xiàn)中的方法分別使用實(shí)施例2中制備得到的靶向 miRNA-96 的探針 1、購(gòu)自 Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào)38474-05)和對(duì)比例3中制備得到的探針1-DB2以相同的條件對(duì)切片進(jìn)行雜交 和顯色，部分結(jié)果分別如圖3-圖6所示。
[0077] 具體地的雜交和顯色的操作如下：
[0078] (1)處理切片：將上述制得的切片按照文獻(xiàn)（Peng et al.，2012)中的方法依次進(jìn) 行二甲苯脫蠟、復(fù)水、4質(zhì)量％的多聚甲醛固定、蛋白酶K消化、4質(zhì)量％的多聚甲醛固定和 2倍濃度的SSC雜交緩沖液洗滌；得到處理好的切片。
[0079] (2)預(yù)雜交：加100 μ 1的雜交緩沖液(購(gòu)自Ambion，貨號(hào)8806G)到上述處理好的 組織片上，蓋上蓋玻片，放置在一個(gè)含50體積％甲酰胺的5倍濃度的SSC雜交緩沖液的保 濕盒中，把保濕盒放置在53°C的溫箱內(nèi)預(yù)雜交1個(gè)小時(shí)。
[0080] (3)雜交：為每張標(biāo)本片準(zhǔn)備ΙΟΟμΙ的雜交緩沖液(購(gòu)自Ambion，貨號(hào)8806G)， 其中加2pmol的本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針，或者加2pmol的購(gòu)自Exiqon公司的革巴向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)，或者加 2pmol 的對(duì)比 例3中制備得到的探針1-DB2,混勻后備用。把組織片上的蓋玻片移去，分別加上如上所述 的含探針的1〇〇μ 1的雜交緩沖液，蓋上一個(gè)新的蓋玻片，放回保濕盒中，放至溫箱中53°C 雜交過夜。
[0081] (4)洗滌：將雜交后的切片用含有50體積％甲酰胺和0. 1體積％Tween-20的2倍 濃度的SSC雜交緩沖液于57°C洗4次，每次200mL，每次15分鐘；用含有50體積％甲酰胺 和0. 1體積％Tween-20的0. 2倍濃度的SSC雜交緩沖液于57°C洗4次，每次200mL，每次15 分鐘；PBS中洗2次，每次200mL，每次10分鐘，得到洗滌后的切片。
[0082] (5)抗體檢測(cè)信號(hào)：在室溫下用500 μ 1的含10體積％胎牛血清（FBS)的PBS封閉 上述洗滌后的切片1小時(shí)；加40〇μ 1的1:2000 (體積）稀釋的辣根過氧化物酶（HRP)交聯(lián) 的 anti-DIG 抗體（Roche)，4°C孵育過夜；緩沖液 I (0. 1Μ Tris，0. 1Μ NaCl，pH7. 5)中洗滌 2 次，每次 200mL，每次 15 分鐘；200mL 的緩沖液 II (0· 1M Tris，0. 1M NaCl，pH9. 5)中洗滌 15分鐘；加400 μ 1 NBT/BCIP (Roche)底物于腦片上，室溫顯色反應(yīng)3小時(shí)后用相機(jī)拍照， 記錄顯色進(jìn)程(見圖3)。
[0083] 用本發(fā)明生產(chǎn)的探針顯色速度快，且特異地深染高表達(dá)miR-96的背根神經(jīng)節(jié)區(qū)， 與文獻(xiàn)報(bào)道一致（Kloosterman et al.，2006)。室溫顯色反應(yīng)12小時(shí)后終止用本發(fā)明生 產(chǎn)的miR-96RNA探針雜交的顯色，并封片。用購(gòu)自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針 (miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào)38474-05)雜交的顯色在72小時(shí)后終止，并封片。 用相機(jī)拍照記錄染色的結(jié)果，顯示本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后檢測(cè) 到的信號(hào)要明顯強(qiáng)于購(gòu)自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào)38474-05)在顯色72個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到的信號(hào)（見圖4)。
[0084] 用10倍光學(xué)顯微鏡拍照顯示：本發(fā)明生產(chǎn)的miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后 檢測(cè)到miR-96特異地高表達(dá)在胚胎發(fā)育11. 5天的小鼠胚胎矢狀切片的背根神經(jīng)節(jié)中（圖 5 中的 A)，相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨 號(hào)38474-05)在顯色72個(gè)小時(shí)后在背根神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到的信號(hào)還是很微弱，與背景差別不 大（圖5中的B)。
[0085] 同樣，在胚胎發(fā)育13. 5天的小鼠胚胎冠狀切片的背根神經(jīng)節(jié)中，本發(fā)明生產(chǎn)的 miR-96RNA探針在顯色12個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到miR-96的信號(hào)非常強(qiáng)，而且非常特異（圖6中 的 A);相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)在顯色72個(gè)小時(shí)后檢測(cè)到miR-96的信號(hào)還是非常弱，與背景難以區(qū)分（圖6中 的B)。
[0086] 此外，相對(duì)于對(duì)比例3中制備得到的探針1-DB2,實(shí)施例2中制備得到的靶向 miRNA-96的探針1的背景較淺，證明本發(fā)明生產(chǎn)的RNA探針(探針1)的特異性高于探針 1-DB2。
[0087] 由此可以看出：用來源于同一小鼠胚胎的標(biāo)本，同步檢測(cè)Exiqon公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)與本發(fā)明生產(chǎn)的 RNA探 針的靈敏度和特異性，結(jié)果顯示，本發(fā)明生產(chǎn)的RNA探針靈敏度和特異性都遠(yuǎn)高于Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號(hào) 38474-05)，且大大縮 短了顯色反應(yīng)的時(shí)間。
[0088] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0089] 另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0090] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備RNA片段的方法，該方法包括： (1) 獲得化學(xué)合成的雙鏈DNA，所述化學(xué)合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對(duì)而成； 在從所述編碼鏈的5'至3'方向上，第一內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子、目的RNA片段的編碼 DNA和第二內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)依次連接； (2) 將所述化學(xué)合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒，并分 別對(duì)多個(gè)克隆的擴(kuò)增質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴(kuò)增質(zhì)粒 的克隆作為模板質(zhì)粒； (3) 使用第一內(nèi)切酶和第二內(nèi)切酶對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物，并從酶切產(chǎn)物 中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄模板片段； 其中，第二內(nèi)切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開，以使轉(zhuǎn)錄模板片 段的模板鏈的5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈； (4) 對(duì)所述轉(zhuǎn)錄模板片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到含有目的RNA片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第一內(nèi)切酶為SnaBI或BtsCI ;第二內(nèi)切酶為 BtsCI ;所述啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子或T3啟動(dòng)子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，目的RNA片段為靶向miRNA的RNA探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括，從轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中純化RNA片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的方法，其中，所述編碼鏈的序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄所用的核糖核苷三磷酸中的至少 一部分為帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地 高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖胞嘧 啶三磷酸、生物素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、熒光素修飾 的核糖胞嘧啶三磷酸、熒光素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖腺嘌呤三磷酸、 氚標(biāo)記的核糖尿嘧啶三磷酸、 32P標(biāo)記的核糖尿嘧啶三磷酸、32P標(biāo)記的核糖胞嘧啶三磷酸或 32P標(biāo)記的核糖腺嘌呤三磷酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述帶有標(biāo)記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地 高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸，且?guī)в械馗咝列揎椀暮颂悄蜞奏と姿岷筒粠в械馗咝列?飾的核糖尿嘧啶三磷酸的摩爾比為1. 5-4 :1。
9. 一種RNA片段，其特征在于，該RNA片段是根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法 制備得到的。
10. 權(quán)利要求9所述的RNA片段在制備核酸藥物、檢測(cè)試劑盒或診斷試劑盒中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104250645SQ201310263324
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月27日
【發(fā)明者】彭長(zhǎng)庚, 溫婷 申請(qǐng)人:彭長(zhǎng)庚, 溫婷