專利名稱：一種無需借助pcr的基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及一種無需借助PCR的基因檢測方法。
背景技術(shù)：
公共健康問題一直都是在世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的。例如，乙肝病毒和丙肝病毒是 慢性肝炎發(fā)病的主要原因，并直接導(dǎo)致肝癌。人類免疫缺陷病毒造成艾滋病感染，梅毒螺旋 體引起性傳播疾病——梅毒，現(xiàn)代科技對于這些疾病還不能很好控制與治療。事實上，不管 是癌癥還是傳染性疾病都是人類健康的主要威脅之一，這主要是由于缺乏有效的早期診斷 方法，相應(yīng)的預(yù)防疫苗和對治療切實有效的藥物。與后兩者相比，疾病的早期診斷在控制疾 病發(fā)展和傳播上不失為一個最重要的手段。從預(yù)防的角度來講，實驗室診斷包括傳統(tǒng)的抗 原-抗體反應(yīng)以及復(fù)雜的分子生物學(xué)診斷方法，這些都是診斷疾病有效的重要的方法。與 抗原_抗體檢測相比，以生物大分子為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷主要是在疾病早期檢測致病 病原微生物的遺傳物質(zhì)——核苷酸，這可以把疾病的窗口期由幾個月縮短到幾天。窗口期 縮短對控制疾病的傳播非常重要。當(dāng)前檢測傳染性疾病生物樣品中生物標(biāo)志物(包括核酸 和蛋白質(zhì))的主要手段有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物與探針雜 交并凝膠顯影等，其中像酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)這類屬于以抗原-抗體反應(yīng)為原理的 檢測手段，機(jī)體感染病原微生物后產(chǎn)生抗體需要數(shù)月甚至更長的時間，這個時間幾乎相當(dāng) 于疾病窗口期的時間。另外就是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)衍生出來的各種檢測方法，這些方法檢 測生物樣本中的目標(biāo)基因雖然也具有很多優(yōu)點，而且是目前臨床抗原-抗體檢測方法的主 要輔助或者再確認(rèn)“金標(biāo)準(zhǔn)”手段，但這些方法存在著PCR技術(shù)本身帶來的“假陽性”，易被 污染，技術(shù)要求高，繁瑣費(fèi)時等缺點。雖然這些方法可以在分子水平進(jìn)行檢測，但是傳染病 的快速傳播使建立費(fèi)用低廉、結(jié)果可靠、靈敏度高、特異性高、操作簡便、可同時進(jìn)行多種疾 病診斷的高通量DNA檢測技術(shù)成為越來越需要迫切解決的問題。納米粒子(nano-particle)也叫超微顆粒，一般是指尺寸在1 IOOnm間的粒子， 是處在原子簇和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，它是一種優(yōu)良的生物分子標(biāo)記物，使用納米材 料制成的納米探針用于基因檢驗的方法逐漸引起了分子診斷學(xué)等各個領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，越 來越顯示出光明的發(fā)展前景。近年來，質(zhì)譜(MS)技術(shù)得到迅速發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于化工、石油、醫(yī)藥、生物等 領(lǐng)域，成為科研和生產(chǎn)中十分重要的工具。特別是20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激 光解析離子化(MALDI-TOF-MS，TOF MS)和電噴霧電離(ESI)兩種軟電離方式的出現(xiàn)，因 其具有檢測范圍廣、靈敏度高、操作簡便、自動化程度高、快速等特點，已廣泛用于生物學(xué)、 臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域的研究。目前，德國Qiagen公司開發(fā)的一套有機(jī)分子編碼核酸 的技術(shù)，建立了 64個編碼核酸的標(biāo)記庫，利用質(zhì)譜技術(shù)可同時檢測22種病原體(Tgomas Briese,et al. Diagnostic system for rapid and sensitive differential detectionof pathogens.Emerging inferctious diseases，2005，11 (2)，310-313. Kokoris，Mark， et al. High—thro μ ghput SNP genotyping with the Masscode system. Molec μ LarDiagnosis, 2000，5 (4)，329-340.)。該方法通過可控的光切技術(shù)把小分子標(biāo)記物連接到核 酸上，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行生物識別，最后通過光照把標(biāo)記物釋放出來，采用質(zhì)譜檢測做 出判斷。該方法設(shè)計十分巧妙，但是該方法需要把標(biāo)記物通過化學(xué)方法連接到生物分子上， 而檢測時需要把標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)再釋放出來，這個過程不僅技術(shù)要求高、操作繁瑣而 且費(fèi)時、費(fèi)力。
專利CN101281164A中公開了一種組裝質(zhì)量編碼納米探針的方法，但靶目標(biāo)的檢 測必須經(jīng)PCR將信號放大后，才能達(dá)到所述的檢測靈敏度，而且也沒有涉及到關(guān)于實際應(yīng) 用方面的內(nèi)容，即在實際生物樣品中該方法的耐用性考察。其具體過程是將編碼分子和相 應(yīng)的識別分子修飾到金納米粒子表面，制成膠體金納米探針。通過雜交，與靶基因結(jié)合，再 利用處理后的硅片對納米探針-靶目標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行分離，最后采用質(zhì)譜檢測膠體金納米探 針表面的編碼分子，從而實現(xiàn)對靶DNA的檢測。其中編碼分子為可與金納米粒子結(jié)合的有 機(jī)小分子，可被質(zhì)譜檢測；而識別分子為一段可與靶DNA發(fā)生特異性識別的DNA序列。處理 過的硅片具有捕獲金納米探針_靶DNA復(fù)合物的作用，這是因為硅片表面連接有另外一段 可與靶DNA發(fā)生特異性結(jié)合但不同于識別分子的DNA序列，這種修飾的硅片只有分離和純 化作用，不具有濃縮靶目標(biāo)的作用。該方法通過納米探針實現(xiàn)信號的編碼和放大，且無需把 編碼分子從納米探針上釋放出來，即可直接對其進(jìn)行檢測。質(zhì)譜檢測編碼分子，自動化程度 高、靈敏度最高可達(dá)10_14M。但是該專利最大的缺陷是尚需通過PCR擴(kuò)增靶DNA，靶基因的 濃度提高后才能對其進(jìn)行檢測，整個操作過程繁瑣，費(fèi)時，靈敏度也達(dá)不到臨床檢測需要的 水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，為滿足生物樣本檢測尤其是疾病早期診斷 的臨床現(xiàn)實需求，提供一種不再需要PCR技術(shù)對靶目標(biāo)進(jìn)行信號擴(kuò)大的生物磁性納米探針 結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行基因檢測的方法。本發(fā)明原理如下本發(fā)明采用的生物磁性納米探針由膠體金納米探針和捕獲探針 組成。納米探針為在金納米顆粒表面通過自組裝，連接包括用來識別靶目標(biāo)的識別分子和 作為信號閱讀和信號放大的編碼分子。捕獲探針是在磁性粒子表面連接有可識別靶目標(biāo)的 另一個生物大分子，捕捉探針在靶目標(biāo)存在的環(huán)境中起到分離、純化和濃縮的作用。當(dāng)生物 磁性納米探針與靶目標(biāo)相遇，可形成由納米探針、靶目標(biāo)、捕獲探針3部分組成的夾心式復(fù) 合物。利用捕捉探針分離純化該夾心結(jié)構(gòu)，洗滌除去其他干擾物質(zhì)，去雜交釋放出納米探 針，通過質(zhì)譜測定納米探針表面的編碼分子，從而判斷被測樣品中靶目標(biāo)的存在與否情況。本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到一種基因檢測方法，包含如下步驟利用修飾有識別分子和編碼分子的納米粒 子為納米探針及修飾有捕獲分子的磁性微球為捕獲探針與靶基因形成夾心式復(fù)合物，分 離出該夾心式復(fù)合物，釋放出納米探針，通過質(zhì)譜直接檢測納米探針表面編碼分子的分子 離子峰，其中納米探針中編碼分子與識別分子的比例為300 2000 1，優(yōu)選1300 2000 1。所述的形成夾心式復(fù)合物的雜交反應(yīng)體系的鹽濃度為0.2 1.0M，優(yōu)選0.5 0.7M。所述的鹽一般為氯化鈉。實驗結(jié)果顯示DNA分子之間的雜交效率隨著體系中鹽濃度的提高而提高，體系的穩(wěn)定性也提高，但是太高的鹽濃度(濃度超過1M)卻抑制雜交，并產(chǎn) 生非特異性雜交。研究發(fā)現(xiàn)鹽濃度在0. 2 1. 0M，特別是在0. 5 0. 7M不僅可以確保較高 的雜交效率，而又不出現(xiàn)非特異性雜交的問題。所述的質(zhì)譜為基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜或電噴霧質(zhì)譜，優(yōu)選基質(zhì)輔 助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜。所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜所 用的基 質(zhì)為α -氰基-4-羥基肉桂酸，3，5- 二乙氧基-4-羥基肉桂酸，芥子酸，2，5_ 二羥基苯甲酸 或DNA自主裝的金納米顆粒中的任一種，優(yōu)選DNA自主裝的金納米顆粒，特別優(yōu)選以10 20個胸腺嘧啶或者腺嘌呤組成的DNA自組裝的膠體金納米顆粒。所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜采用AnchOrChipR400/384點樣 靶，利用337nm波長的氮激光光源進(jìn)行被測物的解析和離子化。所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜采用正離子反射模式，在10% 70 %的激光強(qiáng)度下進(jìn)行檢測，激光強(qiáng)度優(yōu)選20 % 50 %，進(jìn)一步優(yōu)選20 % 35 %。所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜采用的加速電壓為20 35KV，優(yōu) 選 25KV。所述的納米探針中的納米材料為金納米粒子，其粒徑為10 lOOnm。所述的編碼分子是分子中含有巰基或者二硫鍵的有機(jī)化合物，優(yōu)選硫醇、硫醚或 二硫化物。所述的磁性微球可以是無機(jī)微球、生物高分子微球或聚合物高分子微球，優(yōu)選聚 苯乙烯磁性微球。所述的磁性微球表面修飾有氨基或鏈霉親和素。所述的夾心式復(fù)合物可通過磁力架分離。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是一種不需經(jīng)過PCR擴(kuò)增的基因檢測方法，主要是通過提高膠體金納米探 針表面編碼分子和識別分子的比例，進(jìn)行靶目標(biāo)信號擴(kuò)大，結(jié)合修飾過的磁性微球的濃縮 作用，以及與高靈敏度的現(xiàn)代化分析儀器相結(jié)合，從而實現(xiàn)不再需要PCR擴(kuò)增靶目標(biāo)的高 特異性、高靈敏度的基因檢測。專利申請CN101281164A提出了利用雙分子修飾的納米探針與磁性捕獲探針檢測 基因或生物大分子的一個大方向，并未對其中影響靈敏度的具體條件進(jìn)行研究，因此靈敏 度并不是很高，在用于基因檢測時必須先借助PCR對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。發(fā)明人在前者的基 礎(chǔ)上通過大量實驗對影響靈敏度的因素進(jìn)行了研究，確定了其具體條件，使檢測靈敏度有 了顯著的提高，即由原來的10_14M提高到10_17M。本發(fā)明不需要PCR擴(kuò)增即可直接檢測生物 大分子，從而避免PCR技術(shù)本身固有的可能出現(xiàn)“假陽性”，易于污染，技術(shù)操作要求高，繁 瑣費(fèi)時以及PCR過程需用酶具有的昂貴、易失活、不易保存等缺陷。本發(fā)明探針組裝過程 簡單、技術(shù)要求不高、可大批量制備、探針穩(wěn)定性好易于保存；且雜交過程簡單快速，易于操 作，質(zhì)譜儀器分析自動化程度高等，這些優(yōu)點有利于該方法的臨床化，為臨床疾病早期診斷 提供了一個新思路。理論上，利用有機(jī)分子作為質(zhì)量條碼的基因分析可以進(jìn)行非常復(fù)雜的多重檢測， 但目前的技術(shù)只能做到一重或兩重靶目標(biāo)的檢測。多重檢測對于許多分析方法都是一個十 分具有挑戰(zhàn)性的問題，這是因為可能存在探針與非靶目標(biāo)之間的非特異性結(jié)合、探針設(shè)計需要兼顧多方面考慮因素、測定時需要把待測物從探針-靶目標(biāo)復(fù)合物中分離出來等許多 十分棘手且不可規(guī)避的問題。這些都要求分析方法不但要有高靈敏度，同時還要有高特異 性。然而一般情況下，分析測定方法的靈敏度與特異性是一對矛盾，往往需要根據(jù)方法的實 際需要，或者犧牲特異性而追求高靈敏度，或者犧牲靈敏度而追求高特異性。發(fā)明人經(jīng)過大 量試驗，在金納米探針自組裝過程中極大地提高了編碼分子和識別分子的比例，使本發(fā)明 的檢測靈敏度顯著提高；在此基礎(chǔ)上，在雜交時使用相對較高的鹽離子濃度的反應(yīng)體系，既 提高了雜交效率又不發(fā)生非特異性雜交，并且質(zhì)譜測定過程中以DNA(10 20個胸腺嘧啶 或者腺嘌呤)自組裝的膠體金粒子作為基質(zhì)，幾乎不存在其他方法存在的“本底”，使質(zhì)譜 圖更“干凈”，確保該基因檢測方法具備高靈敏度的同時，還兼具了很高的特異性，為實現(xiàn)生 物樣品的多重檢測提供了有力的手段。
本方法對靶目標(biāo)的檢測是通過質(zhì)譜檢測膠體金納米探針上組裝的編碼分子的分 子離子峰實現(xiàn)的。理論上編碼分子與識別分子的比例越大，靶目標(biāo)的信號放大效果越好，靈 敏度越高。但由于編碼分子是脂溶性物質(zhì)，其溶解介質(zhì)為乙醇，組裝過程中太多的乙醇會破 壞膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)，使其聚集沉淀。專利申請CN101281164A僅是參考文獻(xiàn)隨機(jī)選擇了一 個比例，未研究編碼分子與識別分子的比例與檢測靈敏度及探針穩(wěn)定性的關(guān)系。本發(fā)明在 專利申請CN101281164A的基礎(chǔ)上通過大量平行實驗優(yōu)化了金納米粒子表面的編碼分子和 識別分子的比例，在該比例范圍內(nèi)既提高了靈敏度，又保證了納米探針的穩(wěn)定性。在此比例 范圍以外，要么靈敏度過低，要么探針組裝失敗。本發(fā)明使用磁性微球(magnetic microparticle,MMP)作為固相支持物，同時起到 分離純化與富集濃縮的作用，也是本方法靈敏度大大提高的主要貢獻(xiàn)者之一。磁珠的種類 很多，根據(jù)磁珠制備的材料不同，可分為無機(jī)微球、生物高分子微球、聚合物高分子微球等。 磁珠表面可以連接有多種活性基團(tuán)。本發(fā)明中使用的磁性粒子是表面具有氨基或者鏈霉親 和素的微球。綜上所述，本方法具有高靈敏度、高特異性，操作簡單快速等優(yōu)點，可用于生物樣 品中靶目標(biāo)的直接檢測以及多重靶目標(biāo)的測定，也可進(jìn)行基因中寡核苷酸多態(tài)性(SNP)的 不同分型及其他方面的基因檢測。另外，借助雙標(biāo)記的膠體金納米探針，針對質(zhì)譜無法區(qū)分 的相同質(zhì)量數(shù)而不同堿基排列順序的核苷酸檢測尤為有效。


圖1.單個靶DNA檢測的靈敏度實驗結(jié)果a.為靶DNA濃度分別為0，10_17，10_15，10_13，IiT11M的樣品的TOF MS檢測結(jié)果質(zhì)譜 圖，m/z 869 ；b.為靶DNA濃度分別為0，IO"17,10_15，10_13，IiT11M的樣品的TOF MS檢測靈敏度的 柱狀圖，圖中信號強(qiáng)度為考慮了測定過程中稀釋或者濃縮倍數(shù)以及點樣量的結(jié)果。圖2.多重靶基因檢測選擇性實驗結(jié)果圖(一)a.空白實驗，即加入30 μ L超純水；b.體系中加入含HIV-1，HCV, HBV和TP四種靶DNA的樣品液，其總濃度為10_1QM， 在 m/z 693，781，869 和 957 顯示 4 個峰;c.體系中加入只含HGV(完全不匹配DNA)的樣品液30 μ L，質(zhì)譜測定無峰，表示無雜交產(chǎn)物生成。圖3.多重靶基因檢測選擇性實驗結(jié)果圖(二)a至d依次為加入30 μ L分別含HIV-1，HBV, HCV和TP四種靶DNA的樣品液的質(zhì) 譜圖，分別在m/z 693，781，869和957各顯示相應(yīng)的峰；e為加入含HIV-I和TP兩種靶DNA 的樣品液的質(zhì)譜圖，在m/z 693和957顯示相應(yīng)的峰；f為加入含HCV和HBV的兩種靶DNA 的樣品液的質(zhì)譜圖，在m/z 781和869顯示相應(yīng)的峰；g為加入含HIV-I，HBV和TP的3種 靶DNA的樣品液的質(zhì)譜圖，在m/z 693，781和957顯示相應(yīng)的峰；h為加入含HIV-I，HCV和 TP的3種靶DNA的樣品液的質(zhì)譜圖，在m/z 693，869，和957顯示相應(yīng)的峰。 圖4.多重靶基因檢測靈敏度實驗結(jié)果圖a中從左至右依次為5種樣品液(其中靶DNA總濃度分別為0，10_17，10_15，10_13， I(T11M)的質(zhì)譜圖；b 各樣品液(其中靶 DNA 總濃度分別為 0，IO"17, IO"15,10,，I(T11M)的 MALDI TOFMS 檢測靈敏度柱狀圖，每個濃度水平柱狀圖從左至右依次對應(yīng)HIV、HBV、HCV、TP基因。每個 濃度水平分別平行實驗3次。圖中信號強(qiáng)度為考慮了測定過程中稀釋或者濃縮倍數(shù)以及點 樣量的結(jié)果。圖5.實際生物樣品的測定過程示意圖。圖6.實際生物樣品靶目標(biāo)檢測靈敏度實驗a生物樣品中靶DNA濃度從左至右依次為0，4. 2fM，42fM，420fM和4. 2pM的測定質(zhì) 譜圖；b為對應(yīng)的靈敏度實驗的柱狀圖。圖7.寡核苷酸多態(tài)性(SNP)分析a.加入靶目標(biāo)DNAl的反應(yīng)體系，EP管顏色及質(zhì)譜結(jié)果；DNAl與捕獲探針及納米 探針完全匹配，經(jīng)過雜交_去雜交過程后，反應(yīng)體系呈紅色，MS測定存在m/z 869 ([M+Na] +) 和 837([M+Na-S]+)。b.加入DNA2的反應(yīng)體系，EP管顏色及質(zhì)譜結(jié)果；DNA2存在SNP，與捕獲探針及納 米探針不匹配，反應(yīng)體系呈無色，MS測定無峰。c.加入DNA3的反應(yīng)體系，EP管顏色及質(zhì)譜結(jié)果；DNA3存在SNP，與捕獲探針及納 米探針不匹配，反應(yīng)體系呈無色，MS測定無峰。圖8.對質(zhì)量數(shù)相同但堿基排列順序不同核苷酸的區(qū)分a含有DNAl和DNA4兩個靶基因的樣品的顏色反應(yīng)及質(zhì)譜檢測結(jié)果圖；b不含任何靶基因的樣品的顏色反應(yīng)及質(zhì)譜檢測結(jié)果圖；c只含有DNAl的樣品的顏色反應(yīng)及質(zhì)譜檢測結(jié)果圖；d只含有DNA4的樣品的顏色反應(yīng)及質(zhì)譜檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明所有DNA其合成和純化由上海英濰捷基公司完成，氯金酸(99. 9% )購自上 海久岳化學(xué)有限公司，SMPB購自美國Pierce生物技術(shù)有限公司，氨基化磁性微球購自上海 英濰捷基公司，超純水(18. 2ΜΩ · cm)經(jīng)過SartoriusArium 611體系純化，整個實驗均采 用布魯克公司的質(zhì)譜(Bruker MLtraflex III T0F/T0F Mass Spectrometer)進(jìn)行測定。實施例1生物磁性納米探針應(yīng)用于HCV-DNA的MS測定
(I)HCV膠體金納米探針(HCV-AuNPs)的制備①IOD HCV-DNA識別分子(5，GCA GTA CCA CAA GGC AAA AAA AAA A SH 3，，SEQID NO. 1)大約35 μ g,離心5min (5000rpm)，加超純水200 μ L溶解，渦旋30s,混勻；②加入2mL膠體金(自己合成，13nm，透射電子顯微鏡鏡測定)，輕輕振搖 24h (20rpm)，室溫(25 °C )；③加入0. 3M NaCl，IOmM磷酸緩沖液(PB)，pH = 7. 0 (磷酸緩沖液1)，使體系中 NaCl濃度到0. 1M，輕輕振搖老化36h ；④加入五甘醇二硫分子，48 μ L (IOOmM乙醇溶液為溶劑)，繼續(xù)輕輕振搖12h，即得 編碼分子與識別分子的比例約為1600 1的膠體金納米探針。4°C保存。⑤臨用前，離心(12，00(^)2511^11，除去上清液，以0.IM NaCl，IOmM PB, pH7. 0 (磷 酸緩沖液2)分散，如此離心并洗滌3次，最終分散于磷酸緩沖液1中，濃度大約5ηΜ。(2) HCV 捕捉探針(HCV-MMPs)的制備磁性微球(上海英濰捷基公司，300 μ L，30mg/mL)用300 μ L 二甲亞砜(DMSO)洗 滌 3 次，然后分散于 SMPB (4-[p-maleimidophenyl]butyrate, 4-[ρ-苯基馬來酰亞胺]-丁 酸，琥珀酰亞胺)的DMSO溶液(lmg/100 μ L)，渦旋30min，室溫振搖12h，磁力架分離，再用 300 μ L DMSO 洗滌 3 次，用 300 μ L 0. 15Μ NaCl, 0. IM PB，pH7. 0 (磷酸緩沖液 3)洗滌 2 次。IOD 的HCV-DNA捕獲分子(5，SHA AAA AM AAA GCA CCC TAT CAG 3，，SEQ IDNO. 2)， 大約33 μ g，溶于100 μ L超純水，加入到上述DMSO洗滌好并且已經(jīng)氨基活化的磁珠中，室溫 振搖10h，用300 μ L磷酸緩沖液3洗滌3次；然后分散在磷酸緩沖液3中，加入72 μ M(IOD)， 100 μ L 的 Α13 鈍化 DNA (5，SHA AAA AAA AAA 3，，SEQ ID NO. 3)，振搖 10h，用 300 μ L 0. 2Μ NaCiaOmM PB, ρΗ7. 2 (磷酸緩沖液 4)洗滌 2 次，最終分散于 2mL 0. 3M NaCl, IOmM PB, pH7.2(磷酸緩沖液5)中。(3)夾心結(jié)構(gòu)形成30 μ L靶HCV-DNA(5，-GCC TTG TGG TAC TGC CTG ATA GGG TGC 3，，SEQ ID Ν0. 4) 加入到50 μ L HCV-MMPs中，再加入飽和氯化鈉磷酸溶液(用磷酸緩沖液1配制，濃度大約為 6Μ，25°C )，使體系氯化鈉濃度為0. 6M，水浴45°C溫孵30min，IOmin振搖1次，室溫靜置3h， 用0. 65M NaCl，IOmM PB, pH7. 0 (磷酸緩沖液6)洗滌3次，100 μ L/次，最終用50 μ L磷酸 緩沖液6分散。加入50 μ L HCV-AuNPs,再加入飽和氯化鈉磷酸溶液，使體系氯化鈉濃度為 0. 62M，室溫靜置3h，30min振搖1次，用磷酸緩沖液6洗滌7次，200 μ L/次，最終用10 μ L 超純水分散。75°C水浴溫孵5min，去雜交，磁力架分離，質(zhì)譜測定。(4)質(zhì)譜測定以15個單位的腺嘌呤(A15)自組裝的膠體金顆粒作為基質(zhì)，易于測定，質(zhì)譜更“干 凈”。離子源1和離子源2的加速電壓分別為25kV和21. 55kV，線性正離子掃描模式，棱鏡 的加速電壓為9. 5kV，反射元件1和反射元件2的加速電壓分別為26. 3kV和13. 85kV，一般 情況下使用30%的最適激光強(qiáng)度測定。把2 μ L的去雜交產(chǎn)物點靶于MALDI TOF MS測定的 專用靶(Anchor-Chips，400/385)上。主要檢測編碼分子的加鈉分子離子峰([M+Na]+)。質(zhì) 譜檢測HCV-DNA靶DNA時，檢測限可達(dá)到10aM(10_17M)水平，見圖1。實施例2基于生物磁性納米探針對靶DNA (HIV-1，HBV, HCV和TP)混合液的多重測 定本實施例中所涉及的DNA鏈序列見表1 :
表 權(quán)利要求
一種基因檢測方法，包含如下步驟利用修飾有識別分子和編碼分子的納米粒子為納米探針及修飾有捕獲分子的磁性微球為捕獲探針與靶基因形成夾心式復(fù)合物，分離出該夾心式復(fù)合物，釋放出納米探針，通過質(zhì)譜直接檢測納米探針表面編碼分子的分子離子峰，其特征在于納米探針中編碼分子與識別分子的比例為300～2000∶1，優(yōu)選1300～2000∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于所述的形成夾心式復(fù)合物的雜交 反應(yīng)體系的鹽離子濃度為0. 2 1. 0M，優(yōu)選0. 5 0. 7M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于所述的質(zhì)譜為基質(zhì)輔助激光解析 離子化飛行時間質(zhì)譜或電噴霧質(zhì)譜，優(yōu)選基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因檢測方法，其特征在于所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化 飛行時間質(zhì)譜所用的基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸，3，5_ 二乙氧基-4-羥基肉桂酸，芥子 酸，2，5- 二羥基苯甲酸或DNA自主裝的金納米顆粒中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因檢測方法，其特征在于所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化 飛行時間質(zhì)譜所用的基質(zhì)為DNA自主裝的金納米顆粒，優(yōu)選以10 20個胸腺嘧啶或者腺 嘌呤組成的DNA自組裝的膠體金納米顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因檢測方法，其特征在于所述的基質(zhì)輔助激光解析離子化 飛行時間質(zhì)譜采用正離子反射模式，在10% 70%的激光強(qiáng)度下進(jìn)行檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于所述的納米粒子為膠體金納米粒 子，其粒徑為1 lOOnm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于所述的編碼分子是分子中含有巰 基或者二硫鍵的有機(jī)化合物，優(yōu)選硫醇、硫醚或二硫化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于所述的磁性微球可以是無機(jī)微 球、生物高分子微球或聚合物高分子微球，優(yōu)選聚苯乙烯磁性微球。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的基因檢測方法，其特征在于所述的磁性微球表面修飾有 氨基或鏈霉親和素。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，公開了一種無需借助PCR的基因檢測方法。該方法包含如下步驟利用修飾有識別分子和編碼分子的納米探針及修飾有捕獲分子的磁性微球為捕獲探針與靶基因形成夾心式復(fù)合物，通過洗滌用磁力架分離出該夾心式復(fù)合物，去雜交釋放出納米探針，通過基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜直接檢測納米探針表面的編碼分子的加鈉分子離子峰，其中納米探針中編碼分子與識別分子的比例為300～2000∶1。本方法最大的優(yōu)勢在于高靈敏度、高選擇性，可用于生物樣品中目標(biāo)基因的直接檢測。此外，本發(fā)明還具有操作簡便、速度快、自動化程度高等優(yōu)點，為疾病早期診斷或其他基因檢測提供了新的有力手段。
文檔編號G01N27/62GK101967517SQ201010147160
公開日2011年2月9日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者黃樂群 申請人:黃樂群