一種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門(mén)氏菌為革蘭氏陰性直桿菌，是一種重要的人畜共患病原菌。國(guó)內(nèi)外研究表明， 由沙門(mén)氏菌引起的食源性疾病屢居前位。隨著抗生素的大量和長(zhǎng)期使用，在食品和環(huán)境中， 日趨嚴(yán)重的耐藥型沙門(mén)氏菌已影響人類(lèi)感染沙門(mén)氏菌疾病的治療，能否研究出新型的生物 抑菌劑來(lái)替代化學(xué)抗生素是目前科研人員面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。
[0003] 噬菌體內(nèi)溶素是一類(lèi)能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂解酶。盡管在1957年噬菌體內(nèi)溶 素裂解細(xì)菌的能力就被首次報(bào)道，但直到2001年Nelson等才證實(shí)純化的重組內(nèi)溶素可以 作為抗菌劑有效控制大鼠感染A族鏈球菌。到目前為止，內(nèi)溶素已被用來(lái)防控和檢測(cè)食品 中的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌和梭狀芽孢桿菌。與使用小分子抗生素用 于抗菌治療或預(yù)防相比，專(zhuān)一性的內(nèi)溶素不易導(dǎo)致抗性菌株的快速出現(xiàn)。在細(xì)菌耐藥性日 益嚴(yán)重的現(xiàn)在，尤其在市場(chǎng)對(duì)新型抗菌劑的需求空前提高，內(nèi)溶素不易產(chǎn)生抗性且裂解專(zhuān) 一性的特點(diǎn)，使其作為新型抗菌劑具有一定的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 雖然國(guó)內(nèi)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建內(nèi)溶素生產(chǎn)菌株的工作已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但 是在研究和生產(chǎn)過(guò)程中存在的重要的問(wèn)題是，制備的內(nèi)溶素大多數(shù)都集中在革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌的防治和檢測(cè)，對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌尤其是沙門(mén)氏菌的防控研究仍較少。所以，針對(duì)沙門(mén) 氏菌的耐藥性日趨嚴(yán)重及相關(guān)內(nèi)溶素缺乏的問(wèn)題，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出能夠高效裂解沙門(mén)氏菌的 內(nèi)溶素或內(nèi)溶素基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種來(lái)自沙門(mén)氏菌噬菌體的具有顯著抑菌效果的內(nèi)溶素。
[0006] 本發(fā)明還提供所述的內(nèi)溶素在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素，其氨基酸序列為SEQ ID No :1所示的全部 或部分氨基酸序列。經(jīng)過(guò)序列結(jié)構(gòu)分析，顯示該酶為噬菌體中的能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂 解酶，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該氨基酸序列形成的蛋白具有較好的殺菌活性。
[0009] 編碼所述的內(nèi)溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0010] 含有所述的基因的表達(dá)載體、工程菌或細(xì)胞系。
[0011] 所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET-30a(+)。
[0012] 所述工程菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的內(nèi)溶素通過(guò)市場(chǎng)上已有的適合表達(dá)載體表達(dá)、純 化后，體外對(duì)沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于沙門(mén)氏菌抑菌劑的制備。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為內(nèi)溶素蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)圖；
[0015] 圖2為內(nèi)溶素蛋白在大腸桿囷中_效表達(dá)圖譜；
[0016] 圖3為內(nèi)溶素蛋白裂解沙門(mén)氏菌ATCC14028的吸光值變化圖譜；
[0017] 圖4為內(nèi)溶素蛋白裂解沙門(mén)氏菌ATCC14028的濁度變化圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0019] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等 均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)方法。
[0020] 本發(fā)明試驗(yàn)涉及的菌株：兩株鼠傷寒沙門(mén)氏菌（保藏號(hào)分別為ATCC14028和 ATCC13311)，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（保藏號(hào)為CMCC(B)50001)，腸炎沙門(mén)氏菌（保藏號(hào) 為CMCC50041)，傷寒沙門(mén)氏菌（保藏號(hào)為CMCC50071)和乙型傷寒沙門(mén)氏菌（保藏號(hào)為 CMCC50094)分別購(gòu)于美國(guó)ATCC中心和中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
[0021] 本發(fā)明涉及的沙門(mén)氏菌噬菌體，該噬菌體STP4-a保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址：中國(guó)武漢、武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2014145,保藏日期為2014年4月24 日，分類(lèi)學(xué)命名：沙門(mén)氏菌噬菌體STP4_a(SalmonellabacteriophageSTP4_a)。
[0022] 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NutrientBroth,NB)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0023]LB液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0024]質(zhì)粒pET30a和大腸桿菌BL21 (DE3)，Novagen公司；
[0025]NiSepharose? 6FastFlow填料，美國(guó)GE公司；
[0026] 異丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，北京索萊寶科技有限公司。
[0027] 實(shí)施例1 :內(nèi)溶素蛋白功能預(yù)測(cè)
[0028] 本發(fā)明人從污水中分離出一株沙門(mén)氏菌的烈性噬菌體STP4_a。經(jīng)全基因組測(cè)序和 分析，鑒定該噬菌體gpl93編碼的蛋白在氨基酸序列上與大腸桿菌噬菌體T4溶菌酶有65% 的相似度。使用InterProScan軟件對(duì)gpl93編碼的蛋白LysSTP4進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析。結(jié) 構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示，LysSTP4的24~150氨基酸區(qū)間為高度保守的功能區(qū)域，屬于 Phage_lysozyme家族（PF00959)。該家族能夠裂解原核細(xì)胞細(xì)胞壁肽聚糖中糖苷鍵，釋放 出子代噬菌體。
[0029] 實(shí)施例2:內(nèi)溶素在大腸桿菌中的高效表達(dá)
[0030] 1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0031] 根據(jù)內(nèi)溶素基因序列（SEQIDNo:2)，設(shè)計(jì)引物，上游引物：CGGGATCCATGAACATTT ITGACATGCTTCG(SEQIDNo:3)，下游引物：CCGCTCGAGTCATATGmTCATATGCITTCCAA(SEQID N〇:4)，在上下游引物端分別設(shè)定限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XhoI。利用PCR進(jìn)行內(nèi)溶素 基因擴(kuò)增，將25iiLPCR回收產(chǎn)物克隆入pET-30a載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和XhoI之 間，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜振 蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明質(zhì)粒中具有SEQIDNo:2所示的核苷酸 序列，將該基因表達(dá)的蛋白命名為L(zhǎng)ysSTP4,該基因編碼SEQIDN〇:l所示的氨基酸殘基序 列。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-LysSTP4。
[0032] 2、重組蛋白的制備
[0033]重組質(zhì)粒命名為pET-30a_LysSTP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選得到可表達(dá)內(nèi) 溶素的工程菌BL21 (LysSTP4)，接種單菌落于10mLLB液體培養(yǎng)基（含50yg/mL卡那霉 素）中，37°C，150r/min，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照1:100的比例將菌液加入到新鮮的900mL LB液體培養(yǎng)基（含50iig/mL卡那霉素）中，37°C培養(yǎng)3h，加入IPTG(至終濃度為lmmol/ L)，在37°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，150r/min振蕩培養(yǎng)4h后，3381g、4°C條件下離心15min 獲得細(xì)胞。每300mL菌液所得的細(xì)胞沉淀懸于30mL緩沖液（20mmol/LpH8.0Tris-Cl，含 300mmol/LNaCl)，充分混勻后，用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎，離心去除不溶性細(xì)胞碎片，上清 液過(guò)0. 45iim無(wú)菌濾膜，獲得粗酶液。米用NiSepharose? 6FastFlow進(jìn)行純化，利用3kD 超濾離心管進(jìn)行脫鹽處理獲得純度較高的重組蛋白。結(jié)果如圖2所示，重組蛋白LysSTP4 得到高效表達(dá)。圖2中泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道1、2分別為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和經(jīng)誘導(dǎo) 的BL21 (LysSTP4)的細(xì)菌總蛋白，泳道3為純化后的融合蛋白，泳道4為超濾濃縮脫鹽后的 融合蛋白。
[0034] 實(shí)施例3:以沙門(mén)氏菌ATCC14028為靶細(xì)菌測(cè)試內(nèi)溶素LysSTP4抑菌效果
[0035] 挑取沙門(mén)氏菌ATCC14028單菌落至300mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，菌液中加 入終濃度為5%的氯仿，15min，細(xì)胞離心用純水清洗兩次，然后-80°C保存，測(cè)定活性之前， 將細(xì)菌沉淀用 50mmol/LpH8. 2 的Tris-HCl，含 0. 1%TritonX-100 復(fù)融。將 100iiL重組 蛋白LysSTP4溶液（100iig/mL)加入到900iiL細(xì)菌復(fù)融液中，37°C培養(yǎng)至裂解效果明顯。 將Tris緩沖液和溶菌酶（lOOyg/mL)作為空白組和陽(yáng)性對(duì)照組分別同細(xì)菌復(fù)融液混合，相 同條件下培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定0D450值，吸光值的下降反映細(xì)菌被裂解。
[0036] 結(jié)果如圖3所示，重組蛋白LysSTP4試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的吸光值在5min內(nèi)迅速 降低，并且，LysSTP4溶液將細(xì)菌的濁度在10min內(nèi)降低約0. 43,溶菌酶溶液降低0. 52左 右。通過(guò)圖4所示，37°C培養(yǎng)15min后，LysSTP4試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的菌液明顯比空白組 澄清。證明通過(guò)克隆表達(dá)獲得的內(nèi)溶素LysSTP4具有體外抗菌活性。
[0037]實(shí)施例4:以不同血清型沙門(mén)氏菌和大腸桿菌為靶細(xì)菌測(cè)定內(nèi)溶素LysSTP4抑菌 效果
[0038] 挑取細(xì)菌單菌落至300mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，菌液中加入終濃度為5% 的氯仿，15min，細(xì)胞離心用純水清洗兩次，然后-80°C保存，測(cè)定活性之前，將細(xì)菌沉淀用 50臟〇1/1卩118.2的1'1^8-11(：1，含0.1%1'1'行〇11父-100復(fù)融。100111重組蛋白1^851?4溶液 (100 iig/mL)和Tris緩沖液分別加入到900 y L細(xì)菌復(fù)融液中，37°C培養(yǎng)30min，測(cè)定0D450 值。LysSTP4酶活力值=A 450nm(LysSTP4實(shí)驗(yàn)組降低值）-A 450nm(Tris緩沖液空白組降 低值）。
[0039] 以鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028為抑菌陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)LysSTP4_a對(duì)多株菌株的抑 菌活性，表1所示，LysSTP4能夠裂解其余5種不同血清型的沙門(mén)氏菌，并對(duì)大腸桿菌也有 高效裂解作用。
[0040] 表1內(nèi)溶素LysSTP4抑菌效果分析
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素，其氨基酸序列為SEQ ID No :1所示的全部或 部分氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的內(nèi)溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示。
3. 含有權(quán)利要求2所述的基因的表達(dá)載體、工程菌或細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于：所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET-30a (+)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
6. -種權(quán)利要求1所述的內(nèi)溶素在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素及其應(yīng)用。一種來(lái)源于沙門(mén)氏菌噬菌體的內(nèi)溶素，其氨基酸序列為SEQIDNo：1所示的全部或部分氨基酸序列。經(jīng)過(guò)序列結(jié)構(gòu)分析，顯示該蛋白酶為噬菌體中的能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂解酶，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該氨基酸序列形成的蛋白具有較好的殺菌活性。本發(fā)明的內(nèi)溶素通過(guò)市場(chǎng)上已有的適合表達(dá)載體表達(dá)、純化后，體外對(duì)沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于沙門(mén)氏菌抑菌劑的制備。CCTCC NO：M 201414520140424
【IPC分類(lèi)】C12R1-19, C12N9-88, C12N15-70, A01P1-00, A01N47-44, C12N1-21, C12N15-60
【公開(kāi)號(hào)】CN104830825
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410510641
【發(fā)明人】王靜雪, 林洪, 李萌, 李夢(mèng)哲
【申請(qǐng)人】中國(guó)海洋大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2014年9月28日