專利名稱：D29分枝桿菌噬菌體來源的pk34多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擬9分枝桿菌噬菌體(Mycobacterium phage D29)來源的HCM
多肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
感染性疾病一直是威脅人類健康的主要因素之一，上個世紀(jì)30年代抗生素被發(fā)現(xiàn)并廣泛地應(yīng)用于臨床治療，拯救了無數(shù)患者的生命。然而傳統(tǒng)抗生素的大量使用導(dǎo)致了越來越多的病原微生物出現(xiàn)變異而產(chǎn)生耐受，近年變異發(fā)生頻率越來越高。面對該嚴(yán)峻現(xiàn)實，一方面，我們必須大力加強(qiáng)手頭可用抗生素的效率，另一方面，亟待研發(fā)新型抗生素來應(yīng)對世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的病原微生物耐藥性。噬菌體是一種專性寄生于細(xì)菌體內(nèi)的非細(xì)胞原生物病毒，具有種屬特異性，即一種噬菌體只能感染一個細(xì)菌種屬，在特定的條件下能裂解宿主菌。前蘇聯(lián)等國家曾經(jīng)將噬菌體廣泛運(yùn)用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染，如皮膚鏈球菌化膿性感染和大腸埃希氏菌感染性腹瀉等。后來，隨著抗生素的發(fā)明與廣泛應(yīng)用，許多國家停止了對噬菌體的研究。近年來，隨著耐藥菌感染比例的不斷增長，噬菌體治療又重新進(jìn)入科研人員的視線。在噬菌體與宿主菌共同進(jìn)化的過程中，噬菌體產(chǎn)生了一些獨(dú)特的蛋白/多肽，它們能夠直接或者間接的作用于宿主菌的一些蛋白，進(jìn)而終止一些重要的代謝進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，噬菌體自身得以繁衍。如T7噬菌體的基因2(gp2)產(chǎn)物能夠與大腸桿菌的的RNA聚合酶結(jié)合，T4噬菌體的 AsiA蛋白能夠抑制大腸桿菌RNA聚合酶σ 70轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而抑制宿主菌DNA的轉(zhuǎn)錄。λ 噬菌體的P蛋白和Ρ2噬菌體的B蛋白都能夠與大腸桿菌的DnaB解旋酶作用，進(jìn)而影響宿主菌DNA的復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)為藥物研發(fā)提供了重要的借鑒和參考。隨著核酸測序方法的不斷發(fā)展，越來越多的噬菌體的全基因組序列得以測定。從這些基因組信息中發(fā)掘一些對宿主菌易感的分子用于藥物開發(fā)，已成為生物制藥領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)。由于耐藥結(jié)核分枝桿菌株特別是耐多藥結(jié)核分枝桿菌(至少同時耐異煙胼和利福平)的廣泛存在，HIV感染人群的不斷增加以及免疫抑制劑的使用等因素導(dǎo)致的機(jī)體免疫低下，使得結(jié)核病(Tuberculosis，TB)的全球傳播變得更加復(fù)雜。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 2009年公布的數(shù)據(jù)顯示，全世界每年新增900萬的結(jié)核病例，發(fā)病率卻只以每年少于 1 %的比例遞減，每年約有200萬人死于結(jié)核病。從病原菌(結(jié)核分枝桿菌)的噬菌體中發(fā)掘潛在的治療結(jié)核病的藥用分子是一種新的思路和嘗試。發(fā)明人將本發(fā)明的擬9分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽作為一種新的治療結(jié)核桿菌感染的藥物在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中的檢索系統(tǒng)(PUBMED)上進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相關(guān)的研究論文或臨床報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬9分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽，作為制備抗結(jié)核桿菌藥物制劑的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1、D29分枝桿菌噬菌體H(34多肽PK34多肽是擬9分枝桿菌噬菌體p63基因(GenBank Accession Number NC_001900)編碼的一種直鏈多肽(GenBank Accession Number :AAC18505)，其前體含有 78 個氨基酸殘基，成熟肽由34個氨基酸殘基組成，分子量3957. 55道爾頓，等電點(diǎn)10. 25，全序列一級結(jié)構(gòu)為Pro Arg Val lie Glu Thr Lys Val His Gly Arg Glu Val Thr Gly Leu Ala Arg Asn Val Ser Glu Glu Asn Val Asp Arg Leu Ala Lys Arg Trp lie Lys02、擬9分枝桿菌噬菌體H(34多肽的制備方法(現(xiàn)有技術(shù))根據(jù)擬9分枝桿菌噬菌體基因組D29p63序列(GenBank Accession Number NC_001900)推斷其成熟肽H(34的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC 反相C18柱脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法 (Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。3、D29分枝桿菌噬菌體H(34多肽的應(yīng)用D29分枝桿菌噬菌體H(34多肽在體內(nèi)和體外實驗中都具有顯著的抑制分枝桿菌生長的活性，能夠作為制備抗結(jié)核桿菌藥物制劑的應(yīng)用。本發(fā)明的抗結(jié)核H(34多肽具有結(jié)構(gòu)簡單，人工合成方便，抗菌迅速的有益特點(diǎn)， 能夠應(yīng)用于制備分枝桿菌感染疾病的治療藥物。


圖Ι-a至圖1-1 電鏡顯示不同濃度的擬9分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽對分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv的抑制作用圖 2-a 至圖 2-g :PK34 多肽對致炎因子(IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-10、IL-6、 IL-12 和 IL-4)的影響，M :M. tuberculosis H37Rv ；T :TDM(5y g/ml) ；Pl :PK34 (5 μ g/ml)； P2 ；PK34(10 μ g/ml) ；P3 :PK34(20 μ g/ml) ；Ρ4 :ΡΚ34(40 μ g/ml)。圖3-a 至圖 3-f 使用不同濃度的 HCM (20mg/kg/d、10mg/kg/d 和 5mg/kg/d)和利福平(20mg/kg/d)治療感染結(jié)核分枝桿菌的BALB/c小鼠30天后的肺部病理切片。a、20mg/ kg/d 的 PK34 ；bU0mg/kg/d 的 PK34 ；c、5mg/kg/d 的 PK34 ；d、20mg/kg/d 的利福平；e、0. 9% 的生理鹽水；f、正常的肺；
具體實施例方式實施例一制備分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽I.D29分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽的制備方法根據(jù)編碼擬9分枝桿菌噬菌體基因組P63的基因序列推斷其氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC 反相C18柱層析脫鹽、純化。II、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油間硝基芐醇二甲亞砜(1 1 1, V V V，體積比) 為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為luA，發(fā)射電壓為25Kv。
III、純化的冊34用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。PK34多肽是擬9分枝桿菌噬菌體基因組p63基因(GenBank Accession Number NC_001900)編碼的一種直鏈多肽(GenBank Accession Number :AAC18505)，其前體含有 78 個氨基酸殘基，成熟肽由34個氨基酸殘基組成，分子量3957. 55道爾頓，等電點(diǎn)10. 25，全序列一級結(jié)構(gòu)為Pro Arg Val lie Glu Thr Lys Val His Gly Arg Glu Val Thr Gly Leu Ala Arg Asn Val Ser Glu Glu Asn Val Asp Arg Leu Ala Lys Arg Trp lie Lys0實施例二 抗結(jié)核多肽H(34的藥理實驗I、利用掃描電子顯微鏡觀察H(34多肽對結(jié)核桿菌的作用結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27四4)培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，用滅菌的生理鹽水洗滌2次并重懸。向菌液中加入不同濃度的HCM (20、40、60、80、100、200、300、 400 μ g/ml和500μ g/ml)，置于37°C培養(yǎng)箱中處理30min。然后IOOOrpm離心lOmin，沉淀迅速加入2. 5%戊二醛溶液，用移液器輕輕吹打懸浮菌體沉淀，4°C固定池。然后用四氧化鋨固定液4°C固定池，乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，真空噴金鍍膜，掃描電鏡觀察、拍照。本實驗陽性對照組用利福平處理，陰性對照組加入相同體積的滅菌超純水，對照組處理方式與樣品組完全相同。結(jié)果顯示，濃度為20、40、60、80和100 μ g/ml的H(34多肽能夠?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌 M. tuberculosis的質(zhì)膜破裂，內(nèi)容物外泄，細(xì)胞隆起，濃度為200 μ g/ml的H(34多肽效果更加明顯，300-500 μ g/ml的H(34多肽能夠?qū)е录?xì)胞完全破裂成碎片。II.PK34對信號通路和炎癥因子的影響將巨噬樣J774A. 1細(xì)胞于M孔板中培養(yǎng)Mh，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞培養(yǎng)液替換成無血清和雙抗的不完全培養(yǎng)基，使用不同濃度的H(34處理細(xì)胞18小時，用PBS洗細(xì)胞三遍，之后加入5ytg/ml的索狀因子TDM(能夠破壞細(xì)胞，誘發(fā)肉芽腫)處理細(xì)胞30分鐘， 再用PBS洗細(xì)胞三遍，Western blot檢測各種促炎因子(IFN-γ、TNF-α、MCP-U IL-10、 IL-6、IL-12 和 IL-4)和 p38 與 ERK1/2 通路中 c-Raf、PTEN、PDKl 和 GSK3 β 等蛋白水平的磷酸化。結(jié)果顯示，在巨噬樣J774A. 1細(xì)胞中，ΡΚ34能夠呈劑量依賴形式的抑制索狀因子 TDM(能夠破壞細(xì)胞，誘發(fā)肉芽腫)誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶通路(MAPKs)中的ρ38 和ERK1/2通路，即通過作用于細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶，ΡΚ34能夠抑制促炎因子(IFN- γ， TNF-α，MCP-I，IL-10，IL-6, IL-12 和 IL-4)的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)。IIIJK34多肽抗結(jié)核桿菌的體內(nèi)實驗結(jié)核分枝桿菌Μ. tuberculosis H37Rv(ATCC 27四4)培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，通過靜脈注射細(xì)菌OXlO6CFU)對老鼠進(jìn)行感染，治療組設(shè)定高、中、低三個劑量，分別為20mg/g/ dU0mg/g/d和5mg/g/d ；陽性藥注射用利福平給藥劑量為20mg/g/d ；將體重20士2g的48 只Balb/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，雌雄各半，常規(guī)喂養(yǎng)2 3d，健康者供實驗用。各藥物處理組于感染后24h開始靜脈注射給藥，感染后每天給藥一次，共7d ；感染模型對照組注射同體積無菌生理鹽水，每日一次，共7d。試驗時除正常對照組用生理鹽水靜脈注射外， 其余各組經(jīng)靜脈接種感染2 X IO6CFU的結(jié)核桿菌。試驗期間每天觀察動物發(fā)病情況，記錄死亡數(shù)，共觀察30d。試驗結(jié)束時處死動物，無菌取肺臟，左側(cè)肺加生理鹽水2ml研磨混勻，并用生理鹽水10倍比稀釋成6個稀釋度(IO-1UO-2UO-^ 10_4、IO-5和10_6)，取不同稀釋度的勻漿液各100 μ 1接種于羅氏培養(yǎng)基，對肺部結(jié)核桿菌的含量進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)Md后開始觀察，并進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。同時取另一側(cè)肺做病理切片。 結(jié)果顯示，ΡΚ34和利福平一樣能夠減少結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量，并且冊34對臨床耐藥株結(jié)核分枝桿菌同樣有效，更重要的是1 能夠抑制肺部炎癥和固化。
權(quán)利要求
1.D29分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽，其特征在于該H(34多肽是擬9分枝桿菌噬菌體p63基因編碼的一種直鏈多肽，其前體含有78個氨基酸殘基，成熟肽由34個氨基酸殘基組成，分子量3957. 55道爾頓，等電點(diǎn)10. 25，全序列一級結(jié)構(gòu)為Pro Arg Val lie Glu Thr Lys Val His Gly Arg Glu Val Thr Gly Leu Ala Arg Asn Val Ser Glu Glu Asn Val Asp Arg Leu Ala Lys Arg Trp lie Lys0
2.權(quán)利要求1所述的擬9分枝桿菌噬菌體來源的H(34多肽，作為制備抗結(jié)核桿菌藥物制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種D29分枝桿菌噬菌體(Mycobacterium phage D29)來源的PK34多肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的PK34多肽是D29分枝桿菌噬菌體基因組p63基因編碼的一種直鏈多肽，其前體含有78個氨基酸殘基，成熟肽含有34個氨基酸殘基，分子量3957.55道爾頓，等電點(diǎn)10.25，全序列一級結(jié)構(gòu)為Pro Arg Val Ile Glu Thr Lys Val His Gly Arg Glu Val Thr Gly Leu Ala Arg Asn Val Ser Glu Glu Asn Val Asp Arg Leu Ala Lys Arg Trp Ile Lys。本發(fā)明的人工合成的PK34多肽能顯著抑制結(jié)核分枝桿菌的生長，能夠作為制備抗結(jié)核桿菌藥物制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、作用迅速的有益特點(diǎn)。
文檔編號C07K14/005GK102241748SQ20111015464
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者劉涵, 楊海龍, 肖瑤, 賴仞 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所