一種煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物細(xì)菌性病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草青枯菌噬菌體資源 的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是由革蘭陰性細(xì)菌青枯雷爾氏菌（簡稱青 枯菌)引起，是危害煙草的主要病害之一。青枯菌分布廣泛，種性復(fù)雜，宿主眾多，遺傳多樣 性富豐，它能侵染50多個(gè)科中的200多種植物包括烤煙、馬鈴薯、西紅柿、辣椒和香蕉等重 要的農(nóng)作物。在煙葉生產(chǎn)中，盡管選擇種植抗性煙草品種，采用化學(xué)藥劑防治，改善土壤結(jié) 構(gòu)以及合理輪作等綜合措施加以防治，能夠在一定程度上能減少煙草青枯病危害引起的損 失，但仍無法有效控制煙草青枯病的發(fā)生，因此人們期望發(fā)展更安全和有效的方法和策略 來防控青枯病。隨著人們對環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品安全要求的提高，隨著抗生素的廣泛使用以 及耐藥性或抗藥性的出現(xiàn)，采用生物防控的方法引起了人們的關(guān)注，噬菌體療法作為傳統(tǒng) 藥物療法的替代方法來防控細(xì)菌性病害被寄予厚望。噬菌體能在敏感宿主菌內(nèi)快速增殖并 使之裂解，這一特性賦予噬菌體作為病害細(xì)菌的天然"殺手"的能力，也在生物防控利用中 具有應(yīng)用潛力。因此建立快速有效的篩選青枯菌噬菌體資源的方法對于研究利用噬菌體防 控?zé)煵萸嗫莶〉男虏呗院褪侄斡兄匾饬x。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，該方法應(yīng)用于從 植煙土壤、青枯病病土土壤和污水中篩選青枯菌噬菌體資源，為研究利用青枯菌噬菌體防 控?zé)煵萸嗫莶√峁┖褪占嗫菥删w資源。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：它采用以下步驟：第一，取土樣及樣品處理，經(jīng)濾膜過濾得 濾液；第二，青枯菌株系培養(yǎng)獲得青枯菌液；第三，將步驟一中的濾液與步驟二中的青枯菌 液進(jìn)行共培養(yǎng)；第四，噬菌體斑的挑選和保存；所用材料為無菌水、青枯菌株系、CPG培養(yǎng) 基、瓊脂粉、低熔點(diǎn)瓊脂，其中CPG培養(yǎng)基包括CPG固體培養(yǎng)基和CPG液體培養(yǎng)基。
[0005] 在第一步驟中，所述的取土樣及樣品處理是指取植煙地塊中發(fā)生煙草青枯病的病 株和健康株之間的新鮮土壤，用〇. 5_的篩子過篩，去除土壤中的石塊、植物根細(xì)和殘?bào)w等 雜物；取過篩后的土壤小顆粒2. 0g，用5. Oml無菌水浸泡過夜，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心 IOmin后，取上清液，用0. 22 μ m的濾膜過濾，取濾液備用。
[0006] 在第二步驟中，所述的青枯菌株系培養(yǎng)是指將青枯菌株系在CPG固體培養(yǎng)基上 28°C培養(yǎng)20-24h，用無菌接種環(huán)把青枯菌菌體收集到裝有IOml無菌水的試管中，充分混 勻，用測定OD 6c?吸光值的方法控制青枯菌的濃度，把青枯菌濃度調(diào)節(jié)到I X 10 4cfu/ml備用。
[0007] 在第三步驟中，所述的將步驟一中的濾液與步驟二中的青枯菌液進(jìn)行共培養(yǎng)是 指，在滅菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液體培養(yǎng)基，加入100 μ 1步驟一制備的過 濾液，然后加入300 μ 1步驟二制備的青枯菌液，在28°C震蕩培養(yǎng)2-3h。取120 μ 1培養(yǎng)液， 均勻涂布于預(yù)先準(zhǔn)備好的CPG固體培養(yǎng)基上；同時(shí)，取20ml培養(yǎng)液，在4°C以8000rpm的轉(zhuǎn) 速離心IOmin后，取上清液，用0.22 μ m的濾膜過濾，取20 μ 1、10 μ 1、2 μ 1、0 μ 1分別與步 驟二制備的100 μ 1青枯菌液混勻，然后倒入事先滅菌好的濃度為〇. 7%[該百分比濃度指的 是0. 7% (m/v)]的3ml低熔點(diǎn)瓊脂液中，混勻后倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的CPG固體培養(yǎng)基上。
[0008] 在第四步驟中，所述的噬菌體斑的挑選和保存是指，將步驟三制備好的共培養(yǎng)培 養(yǎng)皿，用保鮮膜或封口膜封好，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h ;以步驟三中制備的0 μ 1加 步驟二制備的100 μ 1青枯菌液混勻的處理為對照，觀察細(xì)菌斑，挑選單細(xì)菌斑，用滅過菌 的10 μ 1的槍頭垂直接觸目標(biāo)噬菌斑,然后放入400 μ 1的無菌水中，室溫或4°C冰箱中保 存1-2周；用滅過菌的10 μ 1的槍頭垂直接觸目標(biāo)噬菌斑，然后放入甘油終濃度為20%的 400 μ 1無菌甘油水溶液中，-80°C冰箱中保存。
[0009] CPG固體培養(yǎng)基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：10g ;葡萄糖：5g ;蒸 餾水：1000ml ;酸度調(diào)節(jié)到約pH7. 0,加入瓊脂粉，使之終濃度為1. 5%(該百分比濃度為m/ V)的，在121°C下滅菌30min;冷卻至55°C左右，分裝到培養(yǎng)皿中備用；CPG液體培養(yǎng)基采用 以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：l〇g ;葡萄糖：5g ;蒸饋水：1000ml ;酸度調(diào)節(jié)到約 pH7. 0,在121°C下滅菌30min ;冷卻至55°C左右，分裝到培養(yǎng)皿中備用。一般保存1-3年。 [0010] 本發(fā)明的方法，需要的設(shè)備和資源簡單，能快速有效的從土壤樣品中分離到煙草 青枯菌噬菌體，便于大量的篩選青枯菌噬菌體資源，構(gòu)建青枯菌噬菌體庫，彌補(bǔ)現(xiàn)有青枯菌 噬菌體保存資源缺乏，克服現(xiàn)有技術(shù)中因培養(yǎng)、篩選噬菌體資源較慢，從而影響規(guī)模化、產(chǎn) 業(yè)化將菌體資源用于生物防控領(lǐng)域的不足。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明的植煙土壤樣品取樣點(diǎn)示意圖(照片）； 圖2為本發(fā)明的培養(yǎng)基上形成的噬菌斑示意圖（照片）。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但實(shí)例不是對本發(fā)明的限定。
[0013] 1 材料。
[0014] 無菌水、青枯菌株系、CPG培養(yǎng)基、瓊脂粉、低熔點(diǎn)瓊脂、直徑9cm的培養(yǎng)皿、控溫培 養(yǎng)箱、保鮮膜、吸水紙、接種壞、移液器、分光光度計(jì)、手術(shù)刀、酒精燈、打火機(jī)、超凈工作臺(tái)、 高壓滅菌鍋等。青枯菌株系來源和宿主信息參見表1。
[0015] 2本發(fā)明的實(shí)施步驟如下： 第一，取土樣及樣品處理。植煙土壤從貴州省煙草科學(xué)研究院的福泉基地采獲，取發(fā) 生煙草青枯病的植煙土壤(病株于健康株之間）2. Og (見圖1)，用IOml浸泡，離心取上清 液，用0. 22 μ m的濾膜過濾法獲得濾液，備用。0. 22 μ m的濾膜過濾購自波爾公司（PALL corporation)。
[0016] 表1青枯菌的來源與宿主信息
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：它采用以下步驟：第一，取土 樣及樣品處理，經(jīng)濾膜過濾得濾液；第二，青枯菌株系培養(yǎng)獲得青枯菌液；第三，將步驟一 中的濾液與步驟二中的青枯菌液進(jìn)行共培養(yǎng)；第四，噬菌體斑的挑選和保存；所用材料為 無菌水、青枯菌株系、CPG培養(yǎng)基、瓊脂粉、低熔點(diǎn)瓊脂，其中CPG培養(yǎng)基包括CPG固體培養(yǎng) 基和CPG液體培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：在第一步 驟中，所述的取土樣及樣品處理是指取植煙地塊中發(fā)生煙草青枯病的病株和健康株之間的 新鮮土壤，用〇. 5_的篩子過篩，去除土壤中的石塊、植物根細(xì)和殘?bào)w等雜物；取過篩后的 土壤小顆粒2. Og,用5. Oml無菌水浸泡過夜，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心IOmin后，取上清液， 用0. 22 μ m的濾膜過濾，取濾液備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：在第二步 驟中，所述的青枯菌株系培養(yǎng)是指將青枯菌株系在CPG固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)20-24h，用 無菌接種環(huán)把青枯菌菌體收集到裝有IOml無菌水的試管中，充分混勻，用測定〇D_吸光值 的得方法控制青枯菌的濃度，把青枯菌濃度調(diào)節(jié)到lX10 4cfu/ml備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：在第三步 驟中，所述的將步驟一中的濾液與步驟二中的青枯菌液進(jìn)行共培養(yǎng)是指，在滅菌后的500ml 三角瓶中，加入300mlCPG液體培養(yǎng)基，加入100 μ 1步驟一制備的過濾液，然后加入300 μ 1 步驟二制備的青枯菌液，在28°C震蕩培養(yǎng)2-3h ;取120 μ 1培養(yǎng)液，均勻涂布于預(yù)先準(zhǔn)備好 的CPG固體培養(yǎng)基上；同時(shí)，取20ml培養(yǎng)液，在4°C以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心IOmin后，取上 清液，用〇. 22μπ?的濾膜過濾，取20μ 1、1〇μ 1、2μ 1、〇μ 1分別與步驟二制備的100μ 1青 枯菌液混勻，然后倒入事先滅菌好的濃度為0. 7%的3ml低熔點(diǎn)瓊脂液中，混勻后倒入預(yù)先 準(zhǔn)備好的CPG固體培養(yǎng)基上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：在第四步 驟中，所述的噬菌體斑的挑選和保存是指，將步驟三制備好的共培養(yǎng)培養(yǎng)皿，用保鮮膜或封 口膜封好，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h ;以步驟三中制備的0 μ 1加步驟二制備的100 μ 1 青枯菌液混勻的處理為對照，觀察細(xì)菌斑，挑選單細(xì)菌斑，用滅過菌的10 μ 1的槍頭垂直接 觸目標(biāo)噬菌斑，然后放入400 μ 1的無菌水中，室溫或4°C冰箱中保存1-2周；用滅過菌的 10 μ 1的槍頭垂直接觸目標(biāo)噬菌斑，然后放入甘油終濃度為20%的400 μ 1無菌甘油水溶液 中，-80°C冰箱中保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，其特征在于：CPG固體 培養(yǎng)基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：l〇g ;葡萄糖：5g ;蒸饋水：1000ml ;酸 度調(diào)節(jié)到約PH7. 0,加入瓊脂粉，使之終濃度為1. 5%，在121°C下滅菌30min ;冷卻至55°C 左右，分裝到培養(yǎng)皿中備用；CPG液體培養(yǎng)基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨： l〇g;葡萄糖：5g;蒸餾水：1000ml ;酸度調(diào)節(jié)到約pH7.0,在121°C下滅菌30min ;冷卻至 55 °C左右，分裝到培養(yǎng)皿中備用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草青枯菌噬菌體資源的篩選方法，它采用以下步驟：第一，取土樣及樣品處理，經(jīng)濾膜過濾得濾液；第二，青枯菌株系培養(yǎng)獲得青枯菌液；第三，將步驟一中的濾液與步驟二中的青枯菌液進(jìn)行共培養(yǎng)；第四，噬菌體斑的挑選和保存；所用材料為無菌水、青枯菌株系、CPG培養(yǎng)基、瓊脂粉、低熔點(diǎn)瓊脂，其中CPG培養(yǎng)基包括CPG固體培養(yǎng)基和CPG液體培養(yǎng)基。該方法可以應(yīng)用于從植煙土壤、青枯病病土土壤和污水中篩選青枯菌噬菌體資源，為研究利用青枯菌噬菌體防控?zé)煵萸嗫莶√峁┖褪占嗫菥删w資源。
【IPC分類】C12R1-92, A01P1-00, C12N7-00
【公開號(hào)】CN104560891
【申請?zhí)枴緾N201510008306
【發(fā)明人】蔡劉體, 陸寧, 石俊雄
【申請人】貴州省煙草科學(xué)研究院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月8日