專(zhuān)利名稱(chēng)：使用絲狀噬菌體治療帕金森病的方法
使用絲狀噬菌體治療帕金森病的方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療帕金森病(Parkinson’ s disease)的療法和方法。相關(guān)技術(shù)描述帕金森病(PD)是進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，其主要臨床特征包括運(yùn)動(dòng)異常，諸如靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩和強(qiáng)直(Fahn和Sulzer，2004)。PD的特征在于黑質(zhì)致密部中失去多巴胺能神經(jīng)元和相同區(qū)域的仍然存在的神經(jīng)元中存在稱(chēng)為雷維小體和雷維神經(jīng)突的包含體 (Forno，1996)。盡管普遍公認(rèn)失去中腦多巴胺能神經(jīng)元在很大程度上負(fù)責(zé)主要的運(yùn)動(dòng)癥狀，但是這不是顯示PD患者中病理改變的唯一區(qū)域。雷維病理學(xué)和細(xì)胞失去首先出現(xiàn)在下腦干神經(jīng)核(lower brain stem nuclei)中，逐漸上升至中腦并以高度可預(yù)測(cè)的方式最終到達(dá)皮質(zhì)區(qū)(Braak等，2004)。雷維病理學(xué)向中腦外不同區(qū)域的進(jìn)展可以解釋PD患者中常見(jiàn)次要癥狀，諸如憂(yōu)郁、癡呆和多種自主神經(jīng)和感覺(jué)功能障礙的大量存在。盡管PD的原因仍不清楚，但是存在大量證據(jù)提示α -突觸核蛋白的錯(cuò)折疊和異常聚集是該疾病發(fā)病機(jī)理的重要組成。遺傳連鎖分析已經(jīng)鑒定了三種處于帕金森病遺傳形式的錯(cuò)義突變(Kruger等1998 ；Polymeropoulos等1997 ；Zarranz等2004)，且所有突變變體已經(jīng)顯示出加速低聚化作用或纖維化顫動(dòng)(Conway等2000 ；Greenbaum等200 。野生型 α-突觸核蛋白的累積足以導(dǎo)致該疾病。α-突觸核蛋白纖維狀聚集體似乎是雷維小體和雷維神經(jīng)突的主要組成，且這些現(xiàn)在被認(rèn)為是用于驗(yàn)尸診斷的最可靠PD標(biāo)記物(Spillantini等1998)。因?yàn)棣?-突觸核蛋白是胞質(zhì)蛋白，所以已經(jīng)假設(shè)由該蛋白誘導(dǎo)的病理學(xué)變化和影響出現(xiàn)在胞質(zhì)中并局限在單個(gè)細(xì)胞中。然而，近期關(guān)于胞外α-突觸核蛋白的研究提示病理學(xué)作用范圍超出其起源的胞質(zhì)(Lee，2008)。最近體內(nèi)和體外地證明了 α-突觸核蛋白的存在及其在胞外流體中的聚集形式。 胞外α-突觸核蛋白似乎通過(guò)泡囊內(nèi)α-突觸核蛋白的非常規(guī)胞吐作用來(lái)遞送，盡管精確的機(jī)制尚未表征。泡囊內(nèi)α-突觸核蛋白傾向于聚集并是胞外聚集體的潛在來(lái)源。胞外空間中的分泌的α-突觸核蛋白的作用可以由使用組織培養(yǎng)系統(tǒng)的研究來(lái)推斷。若干研究報(bào)告了胞外α -突觸核蛋白及其內(nèi)部疏水性片段(非淀粉狀成分或NAC)在所述蛋白被加入至培養(yǎng)基時(shí)的細(xì)胞毒性作用(Albani等2004 ；Bodies等2000 ；Du等2003 ； El-Agnaf 等 1998 ；Forloni 等 2000 ；Lee 等 2004 ；Seo 等 2002 ；Sung 等 2001)。一些研究已經(jīng)證明了纖維狀聚集體的毒性作用(Bodies等2000 ；El-Agnaf等1998)，而其他研究將初原纖維狀或低聚聚集體確定為引起毒性的原因(Du等2003)。α -突觸核蛋白可以容易地結(jié)合到膜中并可以存在于突觸泡囊中和細(xì)胞膜上。不存在很大關(guān)于毒性機(jī)制的充分構(gòu)造的模型。近期研究說(shuō)明α-突觸核蛋白孔樣初原纖維在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的可能作用(Tsigelny等，2007 ；Lee等，2002 ；Voiles和Lansbury, 2002)。一種模型提議低聚α-突觸核蛋白可以形成具有中心孔的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Voiles和Lansbury 2003)。這些聚集體可以與膜結(jié)合(Voiles等2001)，并且它們的膜滲透作用已經(jīng)在合成模型膜，諸如磷脂脂質(zhì)體(Voiles等2001)和平面雙層膜(Kayed等2004)中證明。將這些聚集體插入至細(xì)胞膜中應(yīng)該對(duì)細(xì)胞存活具有災(zāi)難性影響，這歸因于離子和小代謝物在胞質(zhì)和胞外空間之間的自由交換。盡管這種毒性孔模型解釋至少一些低聚聚集體的細(xì)胞毒性，但是孔和孔活性尚未在生物學(xué)系統(tǒng)中得到證明。胞外α-突觸核蛋白，和特別是其他聚集體形式的神經(jīng)毒性的另一種潛在機(jī)制可以包括神經(jīng)炎性應(yīng)答Chang等，2005 ；Klegeris 等，2006)。盡管至今已對(duì)開(kāi)發(fā)治療PD的療法獲得了進(jìn)步，但是仍存在對(duì)另外的療法的巨大需求。本文中任何文件的引用不意欲承認(rèn)該文件是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或關(guān)于本發(fā)明任何權(quán)利要求專(zhuān)利性所考慮的內(nèi)容。關(guān)于內(nèi)容的任何陳述或任何文件的日期基于提交申請(qǐng)時(shí)申請(qǐng)人所能獲得的信息并不構(gòu)成關(guān)于該陳述的正確性的認(rèn)可。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療帕金森病或帕金森病的易感性的絲狀噬菌體，和用于治療患有或易感帕金森病(PD)的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用絲狀噬菌體，所述噬菌體不展示出哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。本發(fā)明還提供藥物組合物，所述組合物包含絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體和第二絲狀噬菌體，其不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細(xì)胞因子的抗體。附圖簡(jiǎn)述圖IA和IB顯示膜α-突觸核蛋白(AS)聚集體的計(jì)算機(jī)模型，來(lái)自以孔樣結(jié)構(gòu)嵌入細(xì)胞膜中的α-突觸核蛋白聚集體前面的透視圖(

圖1Α)和顯示插入至膜中的蛋白深度的膜橫截面圖(圖IB) (Tsigelny等，2007)。圖2Α和2Β顯示噬菌體在體外對(duì)AS片段聚集體的分散活性，如通過(guò)Tht測(cè)量地 (圖2Α)和通過(guò)TEM視覺(jué)化地(圖2Β)。圖3是描述噬菌體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活的影響的圖。圖4Α和4Β顯示在α-突觸核蛋白過(guò)濾阻滯測(cè)定中利用α-突觸核蛋白多克隆抗體，如視覺(jué)化(圖4Α)和在ELISA中測(cè)量(圖4Β)的由噬菌體(輔助子)引起的AS聚集體的減少。圖5Α顯示SH-SY5Y細(xì)胞的膜級(jí)分的Western印跡分析，其證明多種α -突觸核蛋白(AS)低聚物的存在，且圖5B顯示用于在M13處理后測(cè)量低聚物的ELISA。在圖5A中， As使用針對(duì)AS的多克隆抗體(Sigma(西格瑪))來(lái)檢測(cè)。在圖5B中，來(lái)自膜級(jí)分的AS低聚物的量在特異于A(yíng)S低聚物的ELISA中量化，所述AS低聚物使用針對(duì)AS的單克隆抗體 (Sigma (西格瑪)，克隆Syn 211)來(lái)檢測(cè)。在使用野生型絲狀噬菌體處理的SH-SY5Y細(xì)胞的膜級(jí)分中測(cè)量到AS低聚物的量的顯著減少。*=與非處理細(xì)胞相比的限制性差別(ρ < 0. 05)。圖6是顯示與載體相比，在與M13相互作用后AS反應(yīng)性減小的圖。該數(shù)據(jù)表示為用M13注射的一半腦半球中觀(guān)察到的AS的神經(jīng)元聚集體的平均數(shù)與使用PBS載體注射的另一半腦半球相比的比率(+M13)。在-M13對(duì)照中，兩半腦半球均注射PBS載體。發(fā)明詳述定義為了本說(shuō)明書(shū)和附加權(quán)利要求的目的，應(yīng)用以下定義。術(shù)語(yǔ)“患者”、“受試者”和“受體”可交替使用。它們包括作為治療處理目標(biāo)的人和其他哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)關(guān)于帕金森病的“治療”意指基本抑制、減慢或逆轉(zhuǎn)帕金森病的進(jìn)展，諸如減少或抑制α-突觸核蛋白聚集體的形成或分解預(yù)形成的α-突觸核蛋白聚集體；基本改善帕金森病的一種或多種臨床癥狀，諸如減少與帕金森病相關(guān)的炎癥；或疾病預(yù)防帕金森病臨床癥狀的出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“共施用”意指通過(guò)同時(shí)、相繼或分別施用的單劑量形式或多劑量形式施用。 優(yōu)選地，共施用導(dǎo)致各待施加的施用對(duì)以重疊時(shí)期，更優(yōu)選同時(shí)處理的細(xì)胞的作用。術(shù)語(yǔ)“抗體”用于本文中時(shí)包括多克隆抗體、單克隆抗體、具有多肽特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、雙抗體、或其他純化的抗體和重組抗體試劑?？贵w可以是完整抗體， 例如任何同種型(IgG，IgA, IgE, IgM，等)的抗體，或結(jié)合目的抗原的抗體片段。在本發(fā)明中使用的抗體的特殊實(shí)例中，待配制的抗體是具有IgG同種型的抗體?？贵w可以利用常規(guī)或其他技術(shù)來(lái)片段化，并且篩選所述片段與目的抗原的結(jié)合。一般地，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合和/或可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”包括通過(guò)蛋白水解裂解或通過(guò)重組制備抗體分子部分的片斷， 其可以選擇性結(jié)合選擇的蛋白。所述蛋白水解和/或重組片段的非限制性實(shí)例包括Fab， F(ab' )2, Fab'，F(xiàn)v，和包含由肽連接體相連的Vl和/或Vh結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體(scFv)，結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)，Nanobodies (抗體-來(lái)源的生物治療劑，其包含天然存在的重鏈抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能特性)，和UniBodies (缺乏鉸鏈區(qū)的抗體)。scFvs可以共價(jià)或非共價(jià)連接，以形成具有兩個(gè)或更多結(jié)合位點(diǎn)的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段是人源化單克隆抗體或完全人源化的單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“人源化單克隆抗體”用于本文中時(shí)，是來(lái)自非人來(lái)源(受體)的單克隆抗體，其已經(jīng)被改變?yōu)榘葍r(jià)人單克隆抗體(供體)中存在的至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。“完全人源化單克隆抗體”是來(lái)自非人來(lái)源的單克隆抗體，其已經(jīng)被改變?yōu)榘葍r(jià)人單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)中存在的全部氨基酸殘基。人源化抗體還可以包含受體抗體或供體抗體中均不存在的殘基?？梢赃M(jìn)行這些修飾，從而進(jìn)一步改善和最優(yōu)化抗體的功能性。人源化抗體還可以任選地包含人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分。術(shù)語(yǔ)“促炎細(xì)胞因子”指參與與帕金森病相關(guān)的腦炎癥的促炎細(xì)胞因子，其優(yōu)選地包括IL-6，IL-1，IL-17和TNFa，并且最優(yōu)選是IL-6。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)”指任何細(xì)胞粘著序列，其作為細(xì)胞粘著/附著于細(xì)胞的結(jié)果，促進(jìn)內(nèi)在化。已知許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞粘著序列并且包括Arg-Gly-Asp (RGD) 細(xì)胞粘著序列，來(lái)自HIV的Tat肽和包含序列Arg-Glu-Asp (RED)，Arg-Lys-Lys (RKK)， Leu-Asp-Val(LDV ；Humphries,1992)， Leu-Leu-Gly (LLG ；Koivunen 2001), Asp-Gly-Glu-Ala(DGEA ；SEQ ID NO 2), Ile-Arg-Val-Val-Met(IRVVM ；SEQ ID NO 3 ； Kosfeld 等，1993)，Pro-His-Ser-Arg-Asp (PHSRN ；SEQ ID NO 4)和 RFYWMWK(SEQ ID NO 5;K0Sfeld等，199 的肽。在細(xì)胞粘性分子諸如層粘連蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白，纖維蛋白原，血小板反應(yīng)蛋白，等中已知許多細(xì)胞粘著序列(也稱(chēng)為細(xì)胞附著基序)。術(shù)語(yǔ)“α-突觸核蛋白抗原”指來(lái)自人α-突觸核蛋白的抗原，其中人α -突觸核蛋白優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ ID NO 6 (NCBI基因ID :6622，登記號(hào)ΝΡ000336 ；UniProtKB/ Swiss-Prot登記號(hào)Ρ37840)?！?α -突觸核蛋白抗體”是識(shí)別和結(jié)合α -突觸核蛋白SEQ ID NO 6或其變體或突變體的抗體。術(shù)語(yǔ)“ β -淀粉狀抗原”指來(lái)自斑形成“ β -淀粉狀肽”的抗原，也稱(chēng)為“ β ΑΡ”， “βΑ”，“Αβ ”或“ΑβΡ”，其源自人淀粉狀前體蛋白?！唉?淀粉狀抗體”是識(shí)別和結(jié)合天然存在的人A β 1-42肽及其變體和突變體的β -淀粉狀肽的抗體。用于本文中時(shí)，“藥物組合物”指本文中偶數(shù)的一種或多種活性成分與其他化學(xué)成分諸如生理學(xué)適合的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)化合物向患者的施用。短語(yǔ)“生理學(xué)可接受載體”和“藥用載體”，可交替使用，指不對(duì)生物體引起顯著刺激并不消除所施用的化合物的生物學(xué)活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。術(shù)語(yǔ)“賦形劑”指添加至藥物組合物以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖和多種類(lèi)型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、 植物油和聚乙二醇。術(shù)語(yǔ)“野生型絲狀噬菌體”用于本文中時(shí)意指天然存在的絲狀噬菌體，所述絲狀噬菌體與其在自然界中典型相關(guān)的其他成分分隔開(kāi)。術(shù)語(yǔ)還包括可商購(gòu)的絲狀噬菌體，其特征為“野生型”。術(shù)語(yǔ)“失活的野生型絲狀噬菌體”用于本文中時(shí)意指這樣的野生型絲狀噬菌體，其不通過(guò)重組DNA手段遺傳改變，但是已經(jīng)，諸如通過(guò)UV照射，致使不能復(fù)制。致使噬菌體不能復(fù)制但是不干涉噬菌體絲狀結(jié)構(gòu)(保持其通過(guò)嗅覺(jué)途徑滲透入腦中的能力)的任何機(jī)制通過(guò)本發(fā)明預(yù)期。
術(shù)語(yǔ)“WT噬菌體”指野生型絲狀噬菌體和失活的野生型絲狀噬菌體二者。用于治療的絲狀噬菌體和治療方法在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療帕金森病或?qū)ε两鹕〉囊赘行缘慕z狀噬菌體和通過(guò)向患者施用絲狀噬菌體來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)，(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體，或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在該實(shí)施方案的一方面，噬菌體作為藥用組合物的一部分施用于患者，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在該實(shí)施方案的另一方面，噬菌體是WT噬菌體。在不受理論束縛的條件下，提議本發(fā)明中使用的噬菌體結(jié)合膜中的胞外α -突觸核蛋白或α-突觸核蛋白聚集體并減少細(xì)胞膜中α-突觸核蛋白的聚集。本發(fā)明人提議膜中α-突觸核蛋白聚集體的這種減少也導(dǎo)致α-突觸核蛋白的胞內(nèi)聚集體的減少，其可能由α-突觸核蛋白的平衡由胞內(nèi)向胞外移動(dòng)引起。然而，在不受人具體機(jī)制束縛的條件下， 本發(fā)明的絲狀噬菌體和方法有效用于治療患有或易感帕金森病的患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲狀噬菌體有效用于鼻內(nèi)施用。鼻內(nèi)使用容許這些噬菌體跨過(guò)血腦屏障。噬菌體然后在不對(duì)外周器官產(chǎn)生不利影響的條件下，經(jīng)由尿液和糞便從腦和身體中排出。促炎細(xì)胞因子對(duì)帕金森病的神經(jīng)炎性癥狀作出貢獻(xiàn)。去除這些促炎細(xì)胞因子將改善這些癥狀。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療帕金森病或?qū)ε两鹕〉囊赘行缘恼故咎禺愑诖傺准?xì)胞因子的抗體的絲狀噬菌體，和通過(guò)向患者施用展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體的絲狀噬菌體來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法。在該實(shí)施方案的一方面，噬菌體通過(guò)鼻內(nèi)施用。在另一方面，噬菌體作為藥用組合物的一部分施用，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在另一方面，特異于促炎細(xì)胞因子的抗體是IgG類(lèi)的抗體并具有Fc部分。在再一方面，所述抗體是特異于IL-6的抗體。在又一方面，具有促炎細(xì)胞因子的噬菌體不包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。當(dāng)鼻內(nèi)施用時(shí)，具有抗體的噬菌體將被遞送至腦，在那里它們將通過(guò)其上展示的抗體被指引至促炎細(xì)胞因子，由此滅活這些細(xì)胞因子。這些噬菌體-展示抗體的噬菌體部分應(yīng)該具有雙重作用，即使所述抗體越過(guò)血腦屏障和直接抑制α -突觸核蛋白聚集。根據(jù)相關(guān)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于治療的第一和第二絲狀噬菌體和通過(guò)向患者共施用(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體， 其中所述第二噬菌體不展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法。在一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。在另一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；或 (ii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α -突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在另一方面，各絲狀噬菌體作為藥用組合物的一部分施用，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在任意上述組合物的另一方面，所述第二絲狀噬菌體是WT噬菌體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體是UV-照射的噬菌體。在又一方面，所述第一和所述第二噬菌體各自鼻內(nèi)施用于患者。在另一方面，特異于促炎細(xì)胞因子的抗體是IgG類(lèi)的抗體并具有Fc部分。在再一方面，所述抗體是特異于 IL-6的抗體。在另一方面，所述第一噬菌體不包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知任何技術(shù)將噬菌體制成展示針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體。例如，可以通過(guò)公知的技術(shù)將抗體改造為單鏈抗體并且可以修飾噬菌體載體以使其在噬菌體表面上展示這樣的單鏈抗體(scFv)。導(dǎo)致任何給定的抗體，優(yōu)選單克隆抗體展示在噬菌體上的另一種方法時(shí)產(chǎn)生展示多肽的噬菌體，所述多肽結(jié)合免疫球蛋白的Fc部分。這樣的噬菌體是本領(lǐng)域中已知的且記述在PCT公開(kāi)W02007/095616中。使用這樣的修飾的噬菌體，可以?xún)H通過(guò)使抗體和噬菌體相接觸而導(dǎo)致任何含有Fc部分的抗體在其上展示。抗體的Fc部分應(yīng)該通過(guò)由噬菌體展示的Fc結(jié)合多肽來(lái)結(jié)合。因此，抗體或其片段的結(jié)合得到促進(jìn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合免疫球蛋白的Fc部分的多肽是蛋白A、蛋白G、其包含蛋白A的抗體結(jié)合部分(即結(jié)合結(jié)構(gòu)域B)的片段或蛋白G、或蛋白A或蛋白G的變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白A的變體是具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的變體。當(dāng)使用缺乏Fc區(qū)的抗體時(shí)，其必須通過(guò)噬菌體直接展示。
絲狀噬菌體是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的病毒，其包含環(huán)狀單鏈DNA基因組。它們?cè)谏a(chǎn)性感染過(guò)程中不殺死它們的宿主。感染包含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli)的噬菌體總稱(chēng)為Ff噬菌體。它們不感染哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述發(fā)明中使用的各種絲狀噬菌體獨(dú)立地選自絲狀噬菌體M13、Π和fd。在一方面，當(dāng)使用第一和第二絲狀噬菌體時(shí)，各噬菌體是同一亞型的噬菌體并且選自絲狀噬菌體M13、fl和fd。改造具有特異于促炎細(xì)胞因子的抗體或結(jié)合免疫球蛋白Fc部分的多肽的噬菌體，以在其表面上展示所述蛋白。這典型地涉及表達(dá)待展示的多肽的cDNA克隆，作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白。展示外源蛋白或肽作為與噬菌體外殼蛋白的融合的絲狀噬菌體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢允褂枚喾N噬菌體和外殼蛋白，包括，但不僅限于M13蛋白 III，M13 蛋白 VIII，M13 蛋白 VI，M13 蛋白 IX，和 fd 小外殼蛋白 pill (Saggio 等，1995 ； Uppala和Koivunen，2000)?？色@得一大列載體來(lái)生成這樣的融合蛋白(參見(jiàn)Kay等，1996 ； Berdichevsky等，1999 ；和Benhar，2001)。用于將外源編碼序列插入至噬菌體基因中的方法是公知的(參見(jiàn)例如，Sambrook等，1989 ；和Brent等，2003)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合免疫球蛋白的Fc部分的多肽通過(guò)其與絲狀噬菌體的小外殼蛋白(蛋白III)的融合來(lái)展示。本文中描述的方法還包括那些方法，其中鑒定患者為需要特別指定的治療。鑒定患者需要所述治療可以通過(guò)患者或健康護(hù)理專(zhuān)業(yè)人員的判斷并可以是主觀(guān)的(例如鑒定) 或客觀(guān)的(例如可通過(guò)測(cè)試或診斷方法測(cè)量)。藥物組合物在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物(例如，無(wú)熱原)，所述藥物組合物包含(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體。在一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。在另一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) α-突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(ii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在該實(shí)施方案的一方面，所述第二噬菌體是WT噬菌體。在更特殊的方面，所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。在另一方面，特異于促炎細(xì)胞因子的抗體是IgG類(lèi)的抗體并具有Fc部分。在又一方面，所述組合物中的第一噬菌體展示特異于IL-6的抗體。在再一方面，所述第一噬菌體不包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。在進(jìn)一步的方面，所述組合物配制為用于鼻內(nèi)施用。用于配制和施用藥物的技術(shù)可以參見(jiàn)〃 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓制藥科學(xué))，“Mack Publishing Co.(馬克出版公司)，Easton, PA，最新版，其通過(guò)參考被結(jié)合在本文中并且在本領(lǐng)域中公知。根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物因此可以以常規(guī)方式，使用一種或多種包括賦形劑和助劑的生理學(xué)可接受載體來(lái)配制，其促進(jìn)處理活性成分進(jìn)入可以制藥使用的制劑。為了通過(guò)鼻吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分方便地以氣溶膠噴霧表觀(guān)形式，由加壓包裝或噴霧器中，借助于合適的推進(jìn)物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳來(lái)遞送。鼻腔噴霧劑，其不需要加壓包裝或噴霧器作為吸入噴霧劑，可以備選地用于鼻內(nèi)施用。在加壓氣溶膠的情形中，給藥單元可以通過(guò)提供閥來(lái)遞送計(jì)量的量來(lái)確定。分配器中使用的例如，明膠的膠囊和藥盒可以被配制為包含所述化合物和合適的粉末基諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。適合在本發(fā)明的方法的背景中使用的藥物組合物包括這樣的組合物，其中以有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量包含活性成分。更具體地，有效量意指有效治療帕金森病的活性成分的量。治療有效量的確定充分在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，特別是根據(jù)本文中提供的詳細(xì)內(nèi)容。給藥量和間隔可以逐個(gè)地調(diào)節(jié)，以提供足以治療的絲狀病毒展示載體的腦水平 (最小有效濃度，MEC)。MEC對(duì)于各種制劑是不同的，但是可以由體外數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估。獲得MEC 所必需的劑量應(yīng)該取決于個(gè)體特征。給藥間隔也可以使用MEC值來(lái)確定。制劑應(yīng)該利用這樣的方案來(lái)施用，所述方案保持腦水平在治療期間內(nèi)10-90 %的時(shí)間，優(yōu)選30-90 %的時(shí)間和最優(yōu)選50-90 %的時(shí)間內(nèi)高于MEC。根據(jù)患者中待治療的帕金森病的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，給藥可以是單次給藥或多次施藥，治療時(shí)期持續(xù)數(shù)日至數(shù)周或直至實(shí)現(xiàn)帕金森病狀態(tài)的消減。待施用的組合物的量當(dāng)然應(yīng)該取決于待治療的受試者、痛苦的嚴(yán)重性、開(kāi)處方醫(yī)師的判斷等。本發(fā)明的方法中使用的組合物，如果需要，可以存在于包裝或分配器裝置，諸如 FDA批準(zhǔn)的試劑盒中，其可以包含一種或多種包含活性成分的單位給藥形式。所述包裝可以，例如，包括金屬或塑料薄片，諸如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可以附帶有關(guān)于施用的說(shuō)明書(shū)。所述包裝或分配器裝置還可以通過(guò)公告聯(lián)合處于管理醫(yī)藥品制造、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的容器來(lái)提供，所述公告反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的組合物或人或獸施用形式。該公共，例如，可以是由美國(guó)食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration) 批準(zhǔn)的處方藥的標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁(yè)。還可以制備包含在兼容藥物載體中配制的本發(fā)明制劑的組合物，將其置于合適容器中，并標(biāo)記指定病癥的治療，好像以上進(jìn)一步詳述的那樣。在一個(gè)特殊實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療帕金森病的試劑盒，其在分開(kāi)的容器中包含(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；和(C)描述使用該試劑盒來(lái)治療帕金森病的方法的說(shuō)明書(shū)。雖然現(xiàn)在已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，但是通過(guò)參考以下實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例通過(guò)示范是方式提供并且不意欲限制本發(fā)明。
實(shí)施例該實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明絲狀噬菌體對(duì)參與PD發(fā)病機(jī)理的α -突觸核蛋白聚集體分解的影響。
制備絲狀噬菌體M13絲狀噬菌體由感染的TGl大腸桿菌培養(yǎng)物，使用Mi;3K07輔助噬菌體(New England Biolabs (新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)，Beverly, ΜΑ)，在含有50 μ g/ml卡那霉素 (kanamycin)的2YT培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich (西格瑪奧德里奇)，Louis，M0)中制備。離心細(xì)菌細(xì)胞(8300Xg，15min)，并噬菌體通過(guò)添加l/5(wt/vol)的16. 7%聚乙二醇(PEG) 從上清中沉淀出來(lái)，并離心(14，OOOXg, lh，在4°C )。將沉淀物重新懸浮在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(上清體積的3%)中。剩余的細(xì)菌通過(guò)以6，OOOXg離心15min除去，并然后對(duì)噬菌體進(jìn)行PEG-NaCl沉淀。最后將沉淀物重新懸浮在PBS (上清體積的2% )中并使噬菌體溶液經(jīng)過(guò)無(wú)熱原0. 45 μ m濾器過(guò)濾以除去任何剩余的細(xì)菌。球形噬菌體通過(guò)在具有等體積氯仿的PBS中培養(yǎng)絲狀噬菌體產(chǎn)生。溶液在室溫(RT)下經(jīng)過(guò);3min渦旋6次，每次10s， 并以18，5000xg離心lmin。水溶液和氯仿溶液均無(wú)蓋地置于排風(fēng)罩內(nèi)，直至所有氯仿殘余已經(jīng)蒸發(fā)并然后重新懸浮在PBS中達(dá)到初始體積。通過(guò)使用超聲波細(xì)胞分解儀(Microson Heat Systems (Microson 熱系統(tǒng))，F(xiàn)armingdale，NY，美國(guó))對(duì)處于冰上的 PBS 中的 500 μ 1 IxlO13個(gè)噬菌體進(jìn)行超聲波處理l^^sec來(lái)破壞噬菌體的完整性。研究體外α -突觸核蛋白聚集測(cè)試和分析與人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO 7)的氨基酸71-82，即雷維小體中心相對(duì)應(yīng)的12個(gè)氨基酸的片段，和完全重組α-突觸核蛋白二者的聚集水平。檢驗(yàn)絲狀噬菌體防止并分解所述肽和重組α-突觸核蛋白二者的能力。α-突觸核蛋白聚集的水平針對(duì)硫黃素T(Tht)和蛋白質(zhì)過(guò)濾測(cè)定來(lái)決定，如下所述。通過(guò)電子顯微術(shù)視覺(jué)化α -突觸核蛋白原纖維和絲狀噬菌體為了評(píng)價(jià)絲狀噬菌體的抗聚集作用，將900μ 1跨越α-突觸核蛋白的氨基酸殘基 71-82的α-突觸核蛋白片段樣品在37°C溫育6周。在該階段，使用聚集的肽溫育絲狀噬菌體1周的時(shí)期。檢驗(yàn)兩種噬菌體濃度1012/ml和IO11AiL將肽樣品稀釋至水性0.3μΜ Tht溶液中，達(dá)到最濃度225 μ Μ。量化480nm處的樣品熒光發(fā)射。如通過(guò)480nm處發(fā)射的減少觀(guān)察的，在含有1012/ml噬菌體的量的樣品中檢測(cè)到顯著的43%減少(圖2A)。樣品還通過(guò)透射電子顯微術(shù)(TEM)來(lái)觀(guān)察。將樣品加載在碳格中并包被乙酸鈾酰。在僅含有α-突觸核蛋白肽的樣品中，檢測(cè)到顯著量的處于密集形式的復(fù)合原纖維(圖 2Β，左圖)。在使用IO11噬菌體溫育的樣品中觀(guān)察到原纖維量和復(fù)雜性的充分降低，而在使用IO12噬菌體溫育的樣品中，沒(méi)有檢測(cè)到原纖維，并且僅可見(jiàn)無(wú)定形聚集體(圖2Β，中圖和右圖)。作為細(xì)胞模型的SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)物成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y是作為PD模型使用的良好候選者，因?yàn)樗嵌喟桶纺芗?xì)胞。所述細(xì)胞使用野生型人α-突觸核蛋白基因和突變?chǔ)?突觸核蛋白Α53Τ基因來(lái)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。 通過(guò)Wfestern印跡來(lái)確定α -突觸核蛋白表達(dá)。 使用α-突觸核蛋白抗體染色細(xì)胞以視覺(jué)化雷維小體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染從而過(guò)表達(dá)Α53Τα -突觸核蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞在IOcm器皿中生長(zhǎng)并保持在含有非必需氨基酸(NEAAs)并增補(bǔ)FCS (10% )，谷氨酰胺Q(chēng)mM)，青霉素-鏈霉素溶液(1%)的 DMEM Ham' s F12(l 1)改良培養(yǎng)基(Biological hdustries (生物工業(yè)))中，其處于37°C，5%C02的濕潤(rùn)溫育器中。細(xì)胞溶解為了分離α-突觸核蛋白，利用由Lee等Q004)所述的細(xì)胞提取，如由本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)地，進(jìn)行溶解程序。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞使用PBS來(lái)沖洗，使用收集在15ml管中的 1. 5ml胰蛋白酶/器皿進(jìn)行胰蛋白酶化，使用PBS離心并再次洗滌，隨后收集至Eppendorf 管中。細(xì)胞使用 ΙΟΟμ 1 緩沖液 T (含有 20mM Tris pH7. 4,25mM KCl,5mM MgCl2，0. 25M 蔗糖，Triton X-IOO和蛋白酶抑制劑混合物)來(lái)溶解，吸吹直至不存在細(xì)胞團(tuán)，在室溫下溫育lOmin，并以13，OOOkg離心lOmin。收集上清并將其置于分開(kāi)的Eppendorf管中，標(biāo)記為"sup"(注意任何上清均不應(yīng)該與沉淀物級(jí)分保持在一起)。用緩沖液N(含有0. IM Na2CO3,pH 11. 5和蛋白酶抑制劑混合物)在不混合的條件下輕輕地覆蓋該沉淀物，并在4°C 溫育過(guò)夜。這容許該蛋白輕輕地重新懸浮在該緩沖液中。溫育后，利用小吸移管頭移出現(xiàn)在渾濁的緩沖液并棄去。管中的剩余物質(zhì)標(biāo)記物“沉淀物”。將上清和沉淀物提取物保持在_20°C，并通過(guò)Wfestern印跡來(lái)分析，從而測(cè)量可溶和不可溶α -突觸核蛋白的量。噬菌體毒性使用噬菌體溫育后的不同SH-SY5Y細(xì)胞的存活力使用MTT試劑來(lái)測(cè)試。在96孔板中，使用IxlO9和IxlO11噬菌體/孔來(lái)溫育細(xì)胞過(guò)夜。該溫育后沒(méi)有觀(guān)察到細(xì)胞死亡(圖 3)。過(guò)濾阻滯測(cè)定為了蛋白聚集體過(guò)濾，使用可商購(gòu)的狹線(xiàn)印跡裝置(Bio-Rad Laboratories，慕尼黑，德國(guó))。樣品經(jīng)過(guò)阻斷的硝化纖維膜(0-. 2 μ m孔尺寸，Schleicher & Scheull,Dassel, 德國(guó))來(lái)過(guò)濾。過(guò)濾后，使用0.1% SDS洗滌各狹線(xiàn)。α-突觸核蛋白聚集體使用單克隆抗體LB509(1 10，000)及二級(jí)HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體來(lái)檢測(cè)，并最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光來(lái)視覺(jué)化。PAF印跡的密度計(jì)量化使用SigmaGel vl. 0來(lái)進(jìn)行。加入相等數(shù)量的細(xì)胞/IOcm器皿，并容許達(dá)到80%匯合。在那時(shí)，使用不同量的噬菌體處理細(xì)胞M和72小時(shí)。然后從各板收集細(xì)胞并溶解和分析，如下所述。過(guò)表達(dá)野生型α -突觸核蛋白的不同SH-SY5Y細(xì)胞使用總量IxlO12噬菌體在37°C溫育3小時(shí)的時(shí)期或過(guò)夜。提取可溶和不可溶的級(jí)分并通過(guò)0.2μπι硝化纖維膜來(lái)過(guò)濾不可溶的級(jí)分。保留濾器上的α -突觸核蛋白聚集體的量在未處理的細(xì)胞中較高(圖4Α)。α -突觸核蛋白低聚物的ELISA改進(jìn)用于檢測(cè)α -突觸核蛋白低聚種類(lèi)的ELISA(El-Agnaf等，2000)，從而測(cè)量 SH-SY5Y細(xì)胞不可溶級(jí)分中的α-突觸核蛋白低聚物的量。為了僅檢測(cè)AS的低聚物，使用用于包被(與生物素綴合)的相同單克隆抗體。在使用噬菌體處理3小時(shí)和溫育過(guò)夜的細(xì)胞的不可溶級(jí)分中均檢測(cè)到AS低聚物的40% -50%減少。在細(xì)胞模型中Μ13噬菌體與α -突觸核蛋白的相互作用α-突觸核蛋白(AQ是位于突觸前端的天然未折疊蛋白。As容易地通過(guò)N端結(jié)合至膜中，并由此以?xún)煞N形式存在于細(xì)胞中膜結(jié)合和無(wú)序胞質(zhì)形式。不斷積累的數(shù)據(jù)表明 AS的膜形式在細(xì)胞毒性中起作用。初原纖維可以形成在細(xì)胞膜上的嵌入的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并引起膜滲透性。最近證明AS在存在液體的條件下具有較高聚集的傾向并且膜聚集體可以誘導(dǎo)AS胞質(zhì)形式的聚集。在此，呈現(xiàn)在過(guò)表達(dá)野生型AS的SH-SY5Y細(xì)胞中使用野生型(MU)絲狀噬菌體處理后的AS低聚物的調(diào)節(jié)。細(xì)胞的膜級(jí)分利用用于A(yíng)S檢測(cè)的膜提取試劑盒(MBL)，通過(guò) Western印跡分析來(lái)提取。在膜級(jí)分中不僅檢測(cè)到AS單體，而且還檢測(cè)到AS 二聚體和三聚體(圖5A)，這證明在我們的細(xì)胞模型的膜區(qū)室內(nèi)存在A(yíng)S低聚物。在使用絲狀噬菌體溫育后，絲狀噬菌體對(duì)AS膜低聚化作用的影響顯示在圖5A和5B中。SH-SY5Y細(xì)胞利用視黃酸來(lái)區(qū)分，并使用處于噬菌體/ml的野生型噬菌體來(lái)溫育過(guò)夜。次日提取膜級(jí)分，并在設(shè)計(jì)用于僅識(shí)別AS低聚種類(lèi)的ELISA中測(cè)量各提取物樣品的AS低聚物的量(圖5B)。在使用絲狀噬菌體溫育后的SH-SY5Y細(xì)胞中測(cè)量到來(lái)自膜級(jí)分的AS低聚物的顯著減少。野生型噬菌體對(duì)由膜級(jí)分提取的AS聚集體的影響提示野生型噬菌體影響質(zhì)膜上的AS，其可能是通過(guò)經(jīng)由以前證明的相互作用區(qū)域與AS直接相互作用實(shí)現(xiàn)，所述相互作用區(qū)域位于A(yíng)S 的NAC區(qū)的氨基酸73-85。還可能的是，由于使用噬菌體長(zhǎng)期溫育細(xì)胞，小百分比的噬菌體內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞，從而影響細(xì)胞中除質(zhì)膜以外的其他膜區(qū)室。噬菌體與細(xì)胞的結(jié)合以及可能的內(nèi)在化作用可以通過(guò)激活溶酶體降解來(lái)促進(jìn)α-突觸核蛋白從質(zhì)膜中清除。使用帕金森病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型來(lái)研究與α -突觸核蛋白的Μ13相互作用年齡為7個(gè)月的PDGFa-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠(D品系)和非轉(zhuǎn)基因小鼠接受海馬內(nèi)注射IxlO14 Μ13噬菌體，并在7天后使用針對(duì)α-突觸核蛋白的抗體Μ13和Ibal(用于小膠質(zhì)活化)通過(guò)IHC分析腦。在注射Μ13的α-突觸核蛋白Tg小鼠中觀(guān)察到大量Μ13 免疫反應(yīng)性。在新皮質(zhì)和海馬中的神經(jīng)元細(xì)胞體中觀(guān)察到Μ13免疫染色。在海馬中，Μ13免疫染色也在神經(jīng)氈中很豐富。在一半球中進(jìn)行Μ13注射和在另一半球中進(jìn)行磷酸鹽緩沖液 (PBS)載體注射后，在腦兩半球中測(cè)量α-突觸核蛋白的神經(jīng)元聚集體的平均數(shù)目，并且各半球中測(cè)量值之間的比率顯示在圖6中。雖然現(xiàn)在已經(jīng)完整地描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍并不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)的條件下，在廣泛范圍的等價(jià)參數(shù)、濃度和條件下進(jìn)行。盡管本發(fā)明已經(jīng)關(guān)于其具體的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解可以進(jìn)一步改進(jìn)。本申請(qǐng)意欲涵蓋本發(fā)明的任何變體、應(yīng)用或改進(jìn)，它們一般性地遵從本發(fā)明原則并包括如在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中已知或常規(guī)實(shí)踐范圍內(nèi)的和如可以應(yīng)用于在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)如上所述的基本特性的那些偏離本發(fā)明的內(nèi)容。參考已知的方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法不以任何方式承認(rèn)相關(guān)領(lǐng)域中公開(kāi)、教導(dǎo)或提示了本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨浮＞唧w實(shí)施方案的前述描述應(yīng)該如此完整地揭示本發(fā)明的一般天性，從而使其他人可以通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)(包括本文中引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)，在不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)、不偏離本發(fā)明一般概念的條件下，容易地改變和/或改進(jìn)多種應(yīng)用諸如具體的實(shí)施方案。因此，基于本文中存在的教導(dǎo)和指導(dǎo)，這些改進(jìn)和改變意欲屬于所公開(kāi)的實(shí)施方案的等價(jià)物的含義和范圍。應(yīng)該理解本文中的措詞或術(shù)語(yǔ)是為了描述而非限制的目的，因此本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)或措詞應(yīng)該由技術(shù)人員根據(jù)本文中存在的教導(dǎo)和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的知識(shí)來(lái)解釋。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.用于治療帕金森病或?qū)ε两鹕〉囊赘行缘慕z狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體展示針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體。
2.用于治療帕金森病或?qū)ε两鹕〉囊赘行缘慕z狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；或(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體是WT噬菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體是UV照射的噬菌體。
6 用于治療帕金森病的第一和第二絲狀噬菌體，其中a)所述第一絲狀噬菌體展示針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體；和b)所述第二絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii)α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的絲狀噬菌體，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4和5中任一項(xiàng)的絲狀噬菌體，其中展示結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體的絲狀噬菌體進(jìn)一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結(jié)合部分，并且其中結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體與蛋白A或蛋白G的抗體結(jié)合部分結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-10中任一項(xiàng)的絲狀噬菌體，其中所述結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體是結(jié)合IL-6的抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的絲狀噬菌體，其中各噬菌體用于鼻內(nèi)施用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1和3-12中任一項(xiàng)的絲狀噬菌體，其中各絲狀噬菌體獨(dú)立地選自 M13、Π和fd噬菌體，及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的絲狀噬菌體，其中各絲狀噬菌體是M13。
15.一種藥物組合物，其包含a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α -突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細(xì)胞因子的抗體；和c)藥用載體。
16.權(quán)利要求15的組合物，其配制為用于鼻內(nèi)施用。
17.權(quán)利要求15或16的組合物，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。
18.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
20.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一絲狀噬菌體進(jìn)一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結(jié)合部分，并且其中結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體與蛋白A或蛋白G的抗體結(jié)合部分結(jié)合。
21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的組合物，其中所述結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體是結(jié)合 IL-6的抗體。
22.權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一和第二絲狀噬菌體中的每個(gè)獨(dú)立地選自M13、Π和fd噬菌體，及其混合物。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述第一和第二絲狀噬菌體是M13。
24.一種通過(guò)向有此需要的患者施用絲狀噬菌體來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)；(ii) α-突觸核蛋白抗原或 α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。
25.一種通過(guò)向有此需要的患者施用絲狀噬菌體來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法，所述絲狀噬菌體展示針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述噬菌體不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。
27.權(quán)利要求M或25的方法，其中所述噬菌體是WT噬菌體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述噬菌體是UV照射的噬菌體。
29.一種通過(guò)向有此需要的患者共施用以下各項(xiàng)來(lái)治療患有或易感帕金森病的患者的方法a)第一絲狀噬菌體，其展示針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體；和b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)； (ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體； 或(iv)針對(duì)促炎細(xì)胞因子的抗體。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)。
31.權(quán)利要求四或30的方法，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
33.權(quán)利要求25-32中任一項(xiàng)的方法，其中展示結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體的絲狀噬菌體進(jìn)一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結(jié)合部分，并且其中結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體與蛋白 A或蛋白G的抗體結(jié)合部分結(jié)合。
34.權(quán)利要求25-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體是結(jié)合IL-6 的抗體。
35.權(quán)利要求M-34中任一項(xiàng)的方法，其中各噬菌體通過(guò)鼻內(nèi)施用。
36.權(quán)利要求M-35中任一項(xiàng)的方法，其中各絲狀噬菌體獨(dú)立地選自M13、fl和fd噬菌體，及其混合物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中各絲狀噬菌體是M13。
全文摘要
本發(fā)明涉及展示特異性結(jié)合促炎細(xì)胞因子的抗體的絲狀噬菌體單獨(dú)地或與不展示哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化信號(hào)的絲狀噬菌體組合地治療帕金森病的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/76GK102223887SQ200980146744
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日
發(fā)明者海姆·M·戴門(mén)特, 貝卡·所羅門(mén) 申請(qǐng)人:臺(tái)拉維夫大學(xué)拉莫特