專利名稱：：生成可灌注微血管體系的方法專利說明相關(guān)申請本申請是Neumann于2007年09月24日提交的標題為“生成可灌注微血管系統(tǒng)的方法”的共同未決申請US11/860,471的部分系列申請，并在此基礎(chǔ)上要求了優(yōu)先權(quán)。而....丨二述申請US11/860，471是Neumann于2006年03月24日提交的申請?zhí)枮閁S11/388,920的部分系列申請。Neumann的申請U.S.11/388，920和U.S.11/860,471被引入本文作為參本發(fā)明涉及用于研究生理的和病理的血管生長以及響應(yīng)促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生長的方法。
背景技術(shù)：
：在正常的血管生長的過程中(例如，月經(jīng)周期、胎盤形成、發(fā)胖、創(chuàng)傷愈合、炎癥)，新血管的生成是被調(diào)控的并最終停止。值得關(guān)注的是,血管生長失去調(diào)控是病理學上的-一個關(guān)鍵因素。例如，腫瘤的生長、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬涉及直接促成病理狀態(tài)的血管過度增殖。相反，作為老年個體的特征，血管生長的削弱危害了創(chuàng)傷愈合以及由損傷或疾病導致的缺血組織的血管再生(revascularization)。因此,對指導組裝新血管的機制以及啟動和終止血管生長的過程的理解，是控制疾病中的血管形成的策略發(fā)展的核心。在新血管的生長過程中(血管生成(angiogenesis)),萌芽(sprout)源自血管內(nèi)皮細胞，該血管內(nèi)皮細胞排列成毛細血管和后毛細血管(postcapillary)的內(nèi)腔(lument)-血管系統(tǒng)的最小分枝。血管生成是一個復雜的，多步驟的過程。盡管公開了數(shù)以千計的關(guān)于血管生成的研究，但是，對介導和調(diào)控血管生成的生長和形態(tài)發(fā)生的細胞機制了解甚少。由于大部分組織的不透明性,很難在體內(nèi)實時地觀察血管生成萌芽態(tài)的具體情況。很難在三維空間重建組織切片，且無法與血管生長的動態(tài)性質(zhì)相聯(lián)系。此外,很難在組織切片中發(fā)現(xiàn)接近血管生成萌芽的尖端的區(qū)域(控制血管侵入(vascularinvasion)和形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵區(qū)域)。為了克服傳統(tǒng)組織學的局限性，開發(fā)出了多種體內(nèi)的和體外的血管生成“模型”。體內(nèi)的血菅牛成樽型為了克服活體鉬織的不誘明件，研究者通過活體動物體內(nèi)的“窗口”或?qū)ｉT的觀察腔來觀察血管生成，所述動物體內(nèi)的“窗口”包括兩棲類幼蟲的天然透明的尾(ClarkandClark1939)，所述專門的觀察腔可以植入到兔的耳朵(ClarkandClark1939)、小鼠的皮膚(Algire,Chalk:[eyetal,1945)和倉鼠的頰囊(cheekpouches)(GreenblattandShubil968)中，或者由兔角膜囊袋(Gimbrone,Cotranetal.1974)或雞胚絨毛尿囊膜(Ausprunk，Knightonetal.1974)發(fā)展而來。從這些早期的，大量描述性的研究中，得出了對腫瘤誘導的血管化學趨向性的中心范例的驗證，以及能促進血管生長的可擴散的腫瘤衍生分子的相關(guān)發(fā)現(xiàn)。體內(nèi)血管生成的新實驗，檢測了血管向聚合海綿體或皮F植入至嚙齒動物的凝膠基底膜蛋白栓塞中的向內(nèi)生長(PassanitiTayloretal.1992；Andrade,Machadoetal.1997；Akhtar,Dickersonetal.2002；Koike,Vernoneta!.2003)0由于下述原因，體內(nèi)的方法難以實施(1)動物之間血管生成反應(yīng)的種內(nèi)變異；(2)缺乏從一個物種到另一個物種的結(jié)果轉(zhuǎn)譯；(3)購買和飼養(yǎng)動物的花費高；(4)公眾不贊成以研究為目的使用動物；以及(5)在動物手術(shù)和可視化方面以及結(jié)果的評估____丨二遇到的復雜性。體外血管牛成,的二維(2D)樽型在努力了解血管牛成的分子力學的過稈中，將從較大的血管中分離出的內(nèi)皮細胞置于平板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直至它們形成匯合的(confluent)、平鋪狀(pavement-like)的單細胞層，該單細胞層模擬了血管內(nèi)層(lining)內(nèi)皮細胞層(Jaffe,Nachmanetal.1973;Gimbronel976)。盡管可以用作在大血管中對內(nèi)皮損傷的增生性響應(yīng)的模型(Gimbrone,Cotranetal.1974；Fishman,Ryanetal.1975；MadriandStennl982；MadriandPratt1986；Jozaki,Maruchaetal.1990；Rosen,Meromskyetal.1990)，但是，在模擬血管生成的過程中，在剛性基質(zhì)上內(nèi)皮細胞的單層培養(yǎng)物并不典型地組織成毛細血管樣的管狀。然而,在1980年，在成功地長期培養(yǎng)毛細管內(nèi)皮細胞后(FolkmamHaudenschildetal1979),據(jù)報道，培養(yǎng)?；蛉祟惷氀軆?nèi)皮細胞20-40天后,在匯合的單層細胞的上部形成二維的細胞網(wǎng)絡(luò),這個過程被稱為“體外血管生成”(Folkman,Haudenschildetal1980)。內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)為填充有纖維狀/無定形物質(zhì)的“管”和“內(nèi)腔”，所述纖維狀/無定形物質(zhì)被認為是內(nèi)源合成的“軸芯”網(wǎng)絡(luò)，細胞在軸芯上組織起來。后續(xù)的研究報道了類似的二維網(wǎng)絡(luò)的形成,該二維網(wǎng)絡(luò)是由源自大血管的內(nèi)皮細胞(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983)禾口接種在基底膜蛋白的延展性水凝膠(例如:Matrigelgel)頂部的內(nèi)皮細胞形成的(Kubota，Kleimanetal.1988)。盡管血管發(fā)育的二維模型仍沿用至今(基于Matrigel的測試(Kubota，Kleinmanetal.1988)是商業(yè)上可獲得的)，該模型不具備真正的血管生成的以下5個特點1，侵入(invasion)-二維模型中的內(nèi)皮細胞在細胞外基質(zhì)的頂部形成網(wǎng)絡(luò)并顯示出很小的向下進入細胞外基質(zhì)的傾向(Vernon，Angeiloetal.1992,Vernon,Laraetal.1995)。2,方向性-在二維模型中，在體外形成的內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)或多或少會同時遍及預置細胞的區(qū)域，而體內(nèi)血管生成包括通過多級分枝使纖維狀萌芽分叉而向細胞外基質(zhì)的定向(vectorial)侵入。3,正確的極性-盡管二維模型使單細胞管與毛細血管非常類似(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon1994),但是,它們的極性是“由內(nèi)向外的”，即它們將基底膜物質(zhì)沉積在它們的內(nèi)腔表面，并且使它們的凝血酶原表面向外面向周圍的培養(yǎng)基(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983)-這與體內(nèi)的情形相反。4,內(nèi)腔形成-二維模型生成具有專屬內(nèi)腔的內(nèi)皮細胞(EC)管的證據(jù)不足。通常，內(nèi)皮細胞管具有“內(nèi)腔”空間，該內(nèi)腔空間填充有細胞外基質(zhì)(外源的或由細胞合成的)(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon71994；Vernon,Laraetal.1995)。存在專屬內(nèi)腔時，專屬內(nèi)腔通常以由內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)的厚壁所分隔的縫隙狀或狹窄的圓柱形空間的形式出現(xiàn)-與體內(nèi)典型的毛細管的膨脹的、薄壁內(nèi)皮細胞管具有顯著的不同。5,細胞特性-二維模型中的細胞網(wǎng)絡(luò)通過機械過程生成,該機械過程可以由非內(nèi)皮細胞型來實現(xiàn)(Verrton,Angelloetal.1992；Vernon,Laraetal.1995)。當然，數(shù)學建模顯示出，任何能夠使具有延展性的二維細胞外基質(zhì)(內(nèi)源合成的或提供的(例如Matrigei凝膠))具有張力的附著細胞型,均能在最佳條件下生成網(wǎng)絡(luò)(Manoussaki，Lubkinetal.1996)。體外血管牛成的三維(3D)樽型對三維細朐外某質(zhì)中發(fā)牛的體內(nèi)血管牛成的認識已經(jīng)得出多種模型,其中，在體外的三維細胞外基質(zhì)凝膠中誘導萌芽。在早期的三維模型中，內(nèi)皮細胞分散于由芯和管的網(wǎng)絡(luò)(ElsdaleandBard1972)形成的膠原質(zhì)凝膠中(Montesano,Orcietal.1983)。盡管內(nèi)皮細胞管顯示出正確的極性，但是缺乏侵入和方向性的特性(內(nèi)皮細胞被預先植入并均勻地分散在細胞外基質(zhì)中)。雖然如此，已經(jīng)證明這個方法在研究內(nèi)腔形成(DavisandCamarillo1998)和內(nèi)皮細胞對生長因子的響應(yīng)方面是有用的(Madri,Prattetal1988；Merwin.Andersonetal.1990；KuzuyaandKinsellal994；Marx,Perlmutteretal.1994；DavisandCamarillo1996)。在一個可選的方法中，將1毫米大鼠主動脈片段(環(huán)狀)植入三維的血漿凝塊中會生成有分枝的吻合(anastomosing)管(Nicosia,Tchaoetal.1.982)。源自動脈環(huán)的萌芽顯示出類似于血管生成的侵入以及除了極性以外的方向性。利用源自大鼠的主動脈環(huán)或源自小鼠的微血管片段的移植模型，已經(jīng)被用于研究腫瘤、生長因子、多種細胞外基質(zhì)載體、和衰老的情況對血管生成的影響(Nicosia，Tchaoetal.1983；Mori,Sadahiraetal.1988；NicosiaandOttinetti1990；Nicosia,Bonannoetal.1992；VillaschiandNicosia1993；Nicosia,Bonannoetal.1994；Nicosia,Nicosiaetal,1994；NicosiaandTuszynski1994；Hoying.Boswelletal.1996；Arthur,Vernonetal.1998)多種現(xiàn)存的模型誘導純化的內(nèi)皮細胞(如單細胞層或聚集體)萌發(fā)侵入至三維細胞外基質(zhì)凝膠的下面或周圍(MontesanoandOrci1985；Pepper,Montesanoetal.1991；Montesano,Pepperetal.1993；NehlsandDrenckhahnl995；NehlsandHerrmann1996；VernonandSage1999；VernonandGooden2002)。每一種模型都具有特殊的局限性，包括很難用肉眼觀察萌芽形成，受限制的萌芽，切片法(sectioning)的要求,或者缺乏特定類型的內(nèi)皮細胞的效力。Wolverine和Gulec公開了--種三維血管生成系統(tǒng)(US2002/0150879A1),包括將腫瘤組織片段植入基質(zhì)中。可表征出微血管的向外生長以分析該組織的血管生成潛能。但是，這個方法不能提供微血管的內(nèi)腔灌注。Neumann(本發(fā)明人)等，在2003年公開了在體外包括在人工組織中生成可灌注的微血管是可能的。Neumann等人在2003年教導，使用127微米的尼龍釣魚線作為用于制造微血管的軸芯，該軸芯被收縮管材(shrinktubing)夾持。由植入到瓊脂中的大鼠主動脈平滑肌細胞制造血管。這些微血管具有試探性的性質(zhì)，并不適合于產(chǎn)生人類血管移植物。體外血管生長的二維模型不能形成前述列出的血管生成的定義性特征,然而,現(xiàn)有的三維模型重建了其中--些或多數(shù)的特征。重要的是，現(xiàn)今的三維模型中沒有一個模型能重建包含有壓力的、流動的、循環(huán)流體的親代血管。所以，現(xiàn)有的體外三維模型中沒有一個模型能夠進行關(guān)于內(nèi)腔壓力和流動對血管生長和形態(tài)生成的貢獻方面的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了--種在體外生成可灌注微血管的方法。將細胞接種到基質(zhì)內(nèi)的通道中。激活能夠萌發(fā)的細胞由親代血管萌發(fā)微血管的能力。所述細胞的萌發(fā)能力由接種密度觸發(fā)。以培養(yǎng)基灌注所述通道而形成親代血管。培育并灌注所述親代血管以保持活力(viability)并實現(xiàn)微血管形成萌芽而進入周圍基質(zhì)。萌發(fā)的親代血管生長直至形成網(wǎng)絡(luò)。本發(fā)明克服了現(xiàn)有血管生成模型的局限性,提供了通過將用于在三維細胞外基質(zhì)(ECM)中生成侵入的、管狀的微血管萌芽的已驗證方法與用于構(gòu)建將成為內(nèi)腔流動源頭的組織工程化親代血管的新方法相結(jié)合的方法和系統(tǒng)。通過灌注液，可以將調(diào)節(jié)血管生成的化合物施用于已知存在特定靶受體的內(nèi)皮細胞的內(nèi)腔表面。營養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)腔流體的存在將會充分地增加體外毛細管的存活時間和穩(wěn)定性。內(nèi)腔灌注已顯示出對血管生長和成熟具有積極影響(Frerich,Zuckmanteletal.2008)。這意味著內(nèi)腔灌注的血管會更穩(wěn)定。而且,平滑肌細胞或外周(pericytes)細胞、內(nèi)皮祖細胞、甚至是干細胞參與親代血管的形成會輔助血管成熟過程的部分功能。公開的血管生成系統(tǒng)可以用于評估多種實驗性參數(shù),包括缺氧/氧過量、特定的可溶性或不溶性生物活性化合物的測試、經(jīng)過基因修飾(geneticallymodified)的細胞的使用、以及經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導的基因傳遞。檢測同型(homophilic)或異型(heterotypic)細胞間相互作用、細胞與基質(zhì)的相互作用、細胞與生長因子的相互作用、以及機械化流動，作為誘導最終激活細胞的整體表型行為(例如在親代血管萌發(fā)微血管中所觀察到的表型行為)的細胞信號的刺激。此外，可評估來自于高密度接種的物理力對萌發(fā)能力表型的貢獻。不受特定理論的限制,例如高密度接種內(nèi)皮細胞會導致物理擠壓使內(nèi)皮細胞在此過程中擠成一團。在開始接種期間不可能使內(nèi)皮細胞在血管形成中呈典型的橫向(laterally)伸展，因為此時細胞被緊密地擠在一起。因而向基質(zhì)內(nèi)的生長優(yōu)先觸發(fā)萌發(fā)表型。此外，在單位內(nèi)腔表面面積中具有更多數(shù)量的細胞，通過細胞的簡單遷移和聚結(jié)(coalescence)而不是細胞分裂可以更快地形成萌芽?？山忉屧谘苄纬芍姓{(diào)控這種細胞表型的基因和基因產(chǎn)品的貢獻。該系統(tǒng)還可以用于與創(chuàng)傷修復、衰老、癌癥、牛皮蘚、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、炎癥、中風和動脈粥樣硬化相關(guān)的血管生成的研究。重要的是,本發(fā)明教導的下述模型可以適用于提供能夠并入生物工程化人工組織的功能齊全的血管系統(tǒng)。本發(fā)明也提供了新型方法,包括用于生成微血管、從內(nèi)皮細胞中生成微血管、以及生成大血管(例如，具有冠狀動脈大小的血管)的多支管設(shè)計。例如，這些和其它重要的新教導包括一種生成微血管網(wǎng)絡(luò)的方法，該方法是以下述說明書和權(quán)利要求書的描述為依據(jù)的。圖1A、圖IB和圖1C示意性地描述了親代血管生成的實例。圖2k、圖2B、圖2C和圖2D示意性地描述了已知的熱收縮過程的實例。圖3A示意性地描述了已知的安裝培養(yǎng)/灌注設(shè)備的設(shè)計圖。圖3B示意性地描述了安裝培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制備方法所用的設(shè)計圖。圖4A和圖4B示意性地描述了培養(yǎng)/灌注設(shè)備的多支管的制造。圖5A、圖5B和圖5C示意性地描述了微裝配的培養(yǎng)/灌注設(shè)備的可選設(shè)計圖。圖6示意性地描述了細胞接種程序。圖7示意性地描述了兩個生物人工親代血管之間的毛細管網(wǎng)絡(luò)。圖8a示意性地描述了在體外接種平滑肌細胞后的多個軸芯的圖例。圖8b示意性地描述了灌注的肌板(muscleplate)的實例。圖9示意性地描述了CPD的可選實施方式。圖10描述了單個親代血管生長形成萌芽進入周圍基質(zhì)。圖1.1描述了一個親代血管通過萌芽網(wǎng)絡(luò)與另一親代血管連接。圖12描述了通過將細胞接種至膠原基質(zhì)通道中而生成親代細胞的可選方法。圖13A描述了激活細胞和親代血管萌發(fā)能力的方法。圖13B示意性地描述了CPD的一個實施方式。圖13C示意性地描述了在以膠原充滿基質(zhì)腔之前和細胞接種之前的CPD。圖13D示意性地描述了膠原接種、回收軸芯、和通過軸芯接種細胞之后的CPD。圖13E示意性地描述了灌注期間的CPD。圖14A示意性地描述了在高密度接種人臍靜脈內(nèi)皮細胞(IIUVECs)的基質(zhì)內(nèi)的通道的實例。圖14B示意性地描述了在接種HUVECs且細胞密度導致通道栓塞的基質(zhì)內(nèi)的通道。圖14C示意性地描述了灌注之后去除未附著的HUVECs的通道。圖15A描述了膠原基質(zhì)中的空通道。圖15B描述了在高密度接種后具有附著細胞的圖15A中的通道。圖15C示意性地描述了圖15B所描述的接種通道的橫截面。圖16描述了在高密度梯度接種內(nèi)皮細胞之后的第1天的基質(zhì)通道(....丨二面版塊)。也描述了在灌注12天之后的相同通道(下面版塊)。萌發(fā)的誘導與細胞密度相關(guān)是顯而易見的(下面版塊)。圖17描述了已生長--周和三周并吻合(anastomosis)形成復雜微血管網(wǎng)絡(luò)的兩個有萌發(fā)能力的親代血管。圖18描述了從第1天至第8天親代血管的生長和相關(guān)微血管的萌發(fā)。圖19描述了微血管以標記的麥胚凝集素染色來顯示血管結(jié)構(gòu)和以熒光染料DAPI來顯示核。圖20A示意性地描述了初始細胞接種密度對沿親代微血管的位置的圖。圖20B描述了在具有細胞密度重疊區(qū)的初始細胞接種密度下親代微血管的萌發(fā)圖20C描述了接種24小時之后親代微血管的萌發(fā)圖。圖20D描述了接種48小時之后親代微血管的萌發(fā)圖。圖20E描述了接種72小時之后親代微血管的萌發(fā)圖。圖20F描述了接種96小時之后親代微血管的萌發(fā)圖。圖21A示意性地描述了平均萌芽長度(微米)對沿親代微血管的位置(mm)的圖。圖21B示意性地描述了平均萌芽長度(微米)對初始接種密度(每平方毫米的細胞數(shù)量)的最佳擬合圖。圖22描述了以細胞示蹤綠(暗的)染色的人臍帶內(nèi)皮細胞(HUVECs)和可收縮的圍繞在HUVECs血管周圍位置的大鼠平滑肌細胞(明顯的/亮的)的復合萌發(fā)圖。圖23示意性地描述了為微血管萌發(fā)試驗將細胞高密度接種至基質(zhì)通道中并形成親代血管。圖24A示意性地描述了在CPD中存在較高量的具有促血管生成特性的細胞、產(chǎn)物和組織的微血管萌發(fā)試驗。圖24B示意性地描述了在CPD中存在較高量的具有促血管生成特性的細胞、產(chǎn)物和組織的微血管萌發(fā)試驗。圖25A示意性地描述了在CPD中存在較高量的具有抗血管生成特性的細胞、產(chǎn)物和組織的微血管萌發(fā)試驗。圖25B示意性地描述了在CPD中存在較低量的具有抗血管生成特性的細胞、產(chǎn)物和組織的微血管萌發(fā)試驗。圖26A描述了來自CPD2600的兩個膠原通道的明視圖，一個接種了已形成萌發(fā)親代血管的HUVECs,而第二個接種了BT474細胞系的乳腺癌細胞2608。圖26B描述了來自圖26A中的CPD的相同接種的膠原通道的相應(yīng)熒光顯微鏡圖。本文列出實施例的目的是為了進一步了解本發(fā)明。這些實施例是示例性的，本發(fā)明并不僅限于這些實例性的實施方式。本發(fā)明的方法可以用于研究生理學和病理學的血管生長和響應(yīng)促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生長。其它有益的應(yīng)用是評估癌組織血管生成的可能和對抗血管生成藥物的響應(yīng)方法。進一步應(yīng)用和方法是用于血管萌發(fā)的生理學或病理學的基礎(chǔ)研究。此外，本發(fā)明的方法可用于構(gòu)建多種創(chuàng)傷愈合設(shè)備以及用于組織工程化構(gòu)建的血管形成。在一個實施例中，公開了一種用于生成可灌注的三維微血管網(wǎng)絡(luò)的方法和設(shè)備。此處所用“EC”指內(nèi)皮細胞,“SME，，指平滑肌細胞，以及“CAS”指冠狀動脈替代物。一般來說，用于培養(yǎng)和灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的設(shè)備由可在中心處容有一個或多個軸芯的腔室構(gòu)成(最好如圖1所示)。該腔室能夠通過使用許多技術(shù)由任何生物相容性的材料制得，例如,通過使激光切割的框架形成夾層、通過在硅酮(silicone)板上鉆孔和通道、或通過成模技術(shù)。以可收回的(retractable)方式將軸芯裝在腔室中。這可以通過將軸芯的端部固定在管中來實現(xiàn)，例如，通過熱收縮(如圖2所示)。軸芯的直徑取決于期望的血管管徑。可改變設(shè)置以適應(yīng)單個血管、兩個血管、或直至二維或三維中的整體血管陣列(arrays)。軸芯可以是多種材料，例如,聚合纖維、玻璃纖維、線材等。通過將細胞接種在軸芯上,刺激細胞在所述軸芯周圍增殖，當細胞形成管壁后取出所述軸芯，從而生成微血管。隨后將血管植入基質(zhì)中。依賴于培養(yǎng)的條件、基質(zhì)的組成、以及血管生成刺激的存在(例如，生長因子)，親代血管將形成萌芽而進入周圍的基質(zhì)中。11所述萌芽將會相互連接而形成微細管網(wǎng)絡(luò)。在除去所述軸芯后,將設(shè)備連接到灌注系統(tǒng)上，向血管中注入內(nèi)腔液體流。現(xiàn)在參考圖1A、圖IB和圖1C，圖中描述了生成親代血管的示意性實例。圖1A顯示了在生長培養(yǎng)基100中的內(nèi)皮細胞1,被接種在軸芯2上，軸芯2由設(shè)備主體3中的收縮管4支撐。圖1B顯示了所述細胞1增殖并形成細胞套筒(sleeve)102形式的環(huán)狀層。圖1C顯示了在細胞外基質(zhì)(ECM)凝膠110中取出軸芯2后，所述細胞套筒被灌注生長培養(yǎng)基100。本發(fā)明公開的方法包括對用于組織工程化應(yīng)用和研究模型的可灌注生物人工血管結(jié)構(gòu)進行工程化。公開的方法的基本原理包括培養(yǎng)細胞而在被緊固在薄壁管或其它固定物上的可去除軸芯的周圍環(huán)繞細胞層。一旦細胞層達到期望的壁厚度，即取出軸芯，并在灌注系統(tǒng)的幫助下向由此生成的生物人工血管(BAVs)中灌注培養(yǎng)基、血液、血液替代物、或其它流體。公開的方法可以用于生產(chǎn)大量制造的或常規(guī)生成的血管、體外灌注的血管生成模型、創(chuàng)傷愈合設(shè)備、組織成分、整個組織和器官、以及研究模型。培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制造現(xiàn)在參考圖2A、圖2B、圖2C和圖2D,圖中描述了已知的熱收縮過程的示意性實例。特別如圖2A所示,每個培養(yǎng)/灌注的設(shè)備(CPD)可以包括一個或多個裝在支撐框架12內(nèi)的軸芯2。軸芯2的直徑為期望的血管口徑,軸芯2的末端與醫(yī)藥級收縮管片段4緊密配合。軸芯2可以包括生物相容性纖維(例如，聚合物纖維、玻璃纖維、線材、或等同物)，根據(jù)待模擬的血管尺寸，軸芯2的直徑可以為幾微米到幾毫米。在一個實施例中，采用含有光學纖維的微毛細管作為軸芯。更詳細的描述如圖2B所示’每個收縮管片段4的中間部位14在一個軸芯2的周圍熱收縮。隨后，特別如圖2C所示，軸芯2被收回，并將管切斷。圖2D示出了重置軸芯以便將該軸芯的兩端封閉在正切斷并分離的收縮管片段4中之后的情況?？梢允褂枚喾N材料和工藝構(gòu)建框架12?？梢愿淖冊O(shè)置以適應(yīng)單獨的生物人工血管或生物人工血管陣列。同樣地,通過將軸芯陣列分層放置，由血管網(wǎng)絡(luò)可以生成厚的、可灌注的組織。灌注腔室的制造現(xiàn)在參考圖3A,描述了已知的用于灌注多個軸芯/收縮管組件(assemblies)11的設(shè)置。框架20可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾壓制成。分配腔室30可以包括在設(shè)計中，這樣可以允許同時灌注多個生物人工血管。包含軸芯2的一套線程(thread)的末端被收集在硅管23中。聚酯膜框架的激光切割現(xiàn)在參考圖3B，示意性地描述了用于安裝培養(yǎng)/灌注設(shè)備的制造方法的新設(shè)計。單血管設(shè)計(CPD70)可以便利地通過將軸芯2夾在兩個激光切割的Myiar框架22之間而生成,所述軸芯2由熱收縮管4支撐。一個環(huán)狀的環(huán)氧多支管21可以方便地用于支撐軸芯！收縮管組件11，該多支管的構(gòu)成將在下面說明。將軸芯/收縮管組件夾在兩個聚酯膜等(例如Mylar)的框架之間，并將粘著的側(cè)面壓在一起，這樣每個軸芯通過在端部的兩個收縮管片段4’懸掛在框架窗口76中。通過在框架22中包括至少一根細穩(wěn)固線材26，并通過封裝在圓柱形的環(huán)氧多支管中，來穩(wěn)定并強化兩個收縮管4’，所述環(huán)氧多支管是通過使用硅酮管的模具，環(huán)繞著收縮管和至少一根細的穩(wěn)固線材26而鑄成的。所述兩個收縮管片段4’最后將變成CPD70的流入口和流出□。現(xiàn)在參考圖4A和圖4B,圖中示意性地描述了一種生成用于培養(yǎng)增殖(profusion)設(shè)備的多支管的方法。圖4A特別描述了通過例如硅酮管50的套管被拉出的多個收縮管/軸芯組件11。注入環(huán)氧膠水40以填充硅酮管50并使它硬化(harden)。圖4B特別描述了環(huán)氧膠40硬化后以及硅酮管50被切開并被移開之后的情況。剩下的是硬化的環(huán)氧棒44。將軸芯收回至切點之后,切斷環(huán)氧棒44，留下由收縮管形成的通道42。多個收縮管的端部46可以被整合，以形成多支管21。疊加單個的CPDs或CPD框架集合可用于生成三維血管陣列。可選擇的方法現(xiàn)在參考附圖5A、圖5B和圖5C，示意性地描述了用于微組裝的培養(yǎng)/灌注設(shè)備的可選設(shè)計圖。圖5A特別描述了通過小孔(perforations)54將一套軸芯2引入框架,所述小孔具有套筒56,它們用于替代收縮管。圖5B特別描述了細胞接種前的CPD,包括安裝在框架壁52....丨二的一套軸芯2。圖5C特別描述了一個可選實例，該實例為具有血管62的培養(yǎng)/灌注設(shè)備，其中微組裝多支管64可以在框架52外面聯(lián)接在套管56上。如這里所示,血管62在軸芯上生長，并在軸芯被移除后而被保留下來。可以使用微組裝的方法(例如微成型)來大量生產(chǎn)這樣的CPD框架組件。血管生成和灌注現(xiàn)在參考圖6，這里示意性地描述了細胞接種程序。為了制備用于細胞接種的CPDs70,首先對它們進行清洗并用紫外線滅菌。在無菌條件下,將CPDs被固定在一個表面上(例如彼得里(Petri)盤72的底部)。隨后在CPD框架組件70的內(nèi)部窗口76(如圖3B所示)中填充含有附著蛋白(例如層粘連蛋白-1)的溶液。根據(jù)需要,可以使用一個或多個襯墊(spacer)77。在培育期后,將含有附著蛋白的溶液除去，然后將培養(yǎng)基中含有期望類型細胞(例如平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、和在某些情況下外周細胞和成纖維細胞，以及包含干細胞的前體細胞類型)的懸浮液轉(zhuǎn)移至所述CPD70的窗口76中。通過將一定體積的細胞懸浮液填充在窗口中來進行細胞接種，翻轉(zhuǎn)CPD框架集合70使它的上部向下，因此產(chǎn)生了懸滴(hangingdrOplet)80。在大約為45分鐘的培育期內(nèi)，大量細胞將附著在位于CPD框架組件中的軸芯/收縮管組件上。過量的細胞將沉到懸滴的端部，并可以很容易的被收集和除去。然后將包括一個或多個CPD框架組件的彼得里(Petri)盤恢復到朝上的位置,填充培養(yǎng)基直到CPD框架組件被浸沒，并進行培養(yǎng)。在一個實施例中的培養(yǎng)條件包括環(huán)境中C02含量為5%，溫度為37°C。附著在軸芯/收縮管組件上的細胞，將向外延伸并增殖,形成同軸的單細胞層(例如內(nèi)皮細胞)或150微米或更厚的多細胞層(例如平滑肌細胞)。達到期望的壁形狀或厚度時，取出軸芯從而制得空心細胞管。較薄的壁需要通過在取出軸芯前在細胞套管的周圍涂覆凝膠(例如瓊脂糖、膠原蛋白、凝膠基底膜蛋白等等)進行保護，以防止破裂。然后將CPD框架組件的多支管連接到灌注系統(tǒng)上,灌注選擇的流體，例如生長培養(yǎng)基。在另一個實施方式中，一種由人血管內(nèi)皮細胞(IIUVEC)生成內(nèi)皮“親代”血管的方法包括下述步驟，其中首先清洗培養(yǎng)設(shè)備，并用紫外線從各個側(cè)面照射滅菌30分鐘。在無菌條件下，將設(shè)備固定在具有無菌條(sterilestrip)的彼得里(Petri)盤的底部。然后,用層粘連蛋白附著蛋白溶液填充所述設(shè)備的內(nèi)部窗口。也可用其它的附著蛋白代替,例如纖連蛋白(fibronectin)、玻連蛋白(vitronectin)、纖維蛋白(fibrin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD)蛋白、RGD-肽、明膠(gelatin)、膠原、不同亞型膠原和等同物。培育過夜后，除去含有附著蛋白的溶液,并將培養(yǎng)基中的人血管內(nèi)皮細胞的懸浮液轉(zhuǎn)移至所述設(shè)備的窗口中。翻轉(zhuǎn)彼得里(Petri)盤使上部向下，在所述設(shè)備的窗口中產(chǎn)生了細胞-培養(yǎng)基懸浮液的懸滴。在細胞培養(yǎng)箱中(C02含量為5%，溫度為37°C)培育45分鐘后，大量細胞將附著到所述設(shè)備中的軸芯/收縮管組件上。然后將彼得里(Petri)盤回轉(zhuǎn)到朝上的位置,在其中填充用于人血管內(nèi)皮細胞的生長培養(yǎng)基，直到設(shè)備被浸沒。未附著在軸芯上的細胞將落下并被吸出和除去。然后將所述彼得里(Petri)盤放置在培養(yǎng)箱(C02含量為5%，溫度為37°C)中。附著在所述軸芯上的細胞將向外擴散并增殖，形成同軸的人血管內(nèi)皮細胞的單細胞層。除去所述彼得里(Petri)盤中的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)設(shè)備的窗口中裝入膠原溶液并使其凝固(solidify)，并包圍帶有細胞層的軸芯。人血管內(nèi)皮細胞將形成萌芽而進入膠原凝膠中。然后將軸芯慢慢地取出，留下可灌注的人血管內(nèi)皮細胞的“親代”微血管。然后，將所述設(shè)備的多支管連接到灌注系統(tǒng)，并灌注人血管內(nèi)皮細胞的生長培養(yǎng)基。灌注系統(tǒng)CPDs可以以線性模式或循環(huán)模式聯(lián)接在灌注系統(tǒng)上。線性設(shè)置可以由重力流系統(tǒng)形成，或者由商業(yè)可獲得的或常規(guī)構(gòu)建的注射泵形成。在注射器中裝滿灌注培養(yǎng)基并將其安裝在注射器泵上，通過氣密管材與CPDs的上游端連接。CPDs可以儲存在無菌條件的培養(yǎng)箱中，或在CDPs內(nèi)部建立無菌的細胞培養(yǎng)環(huán)境。將CPDs的下游多支管連接到收集灌注液的蓄水池的末端?？梢酝ㄟ^使用蠕動泵構(gòu)建循環(huán)系統(tǒng)。所述線性系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)均可以被固定在氣體交換設(shè)備上。氣體的濃度、灌注的壓力、流程、溫度、和營養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物的濃度可通過傳感器進行測量。所收集的數(shù)據(jù)進入反饋回路，以嚴格控制所需的參數(shù)。特定應(yīng)用用于與血管生成相關(guān)研究的模型現(xiàn)在參考圖7，圖7示意性地描述了在兩個生物人工親代血管200、202之間的微血管網(wǎng)絡(luò)。通過減少流體(f)流入“靜脈”親代血管202，并增加在“動脈”親代血管200上的阻力R,使流動的灌注液204通過毛細管206改道。從而,驅(qū)動灌注液204從具有較高壓力的血管進入具有較低壓力的血管，以模擬從毛細管床的動脈端到靜脈端的自然血流。例如,在一個具體實施方式中，以相同速度灌注兩個親代血管并保持出口阻力一致。如果流體增加進入第一血管，同時流體減少進入第二血管，灌注液會改道從第一血管進入第二血管。在其它實施方式中為了進一步促進改道，可增加第一血管下游端的阻力并降低第二血管的阻力。這可以通過提高或降低背壓實現(xiàn)。在可選的實施方式中，第一血管的F游端和第二血管的上游端會完全封閉；然后灌注液通過第一血管進入，并通過微血管網(wǎng)絡(luò)進入第二血管，再通過第二微血管親代血管的下游端離開。軸芯法也可以用于血管生成研究、白細胞附著試驗模型的開發(fā)，或作為用于藥物測試以及在創(chuàng)傷愈合、衰老、癌癥、牛皮蘚、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、炎癥、中風和和動脈粥樣硬化的研究上的需要。只采用內(nèi)皮細胞,或者內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、和外周細胞的結(jié)合，能夠環(huán)繞微米直徑的軸芯來培養(yǎng)親代生物人工微血管(BMVs),并植入到細胞外基質(zhì)的載體凝膠中。在某些情況中可使用其它細胞類型包括成纖維細胞、祖細胞、干細胞和等同物。然后將所述軸芯取出，將親代內(nèi)皮細胞管留在細胞外基質(zhì)凝膠210中。軸芯的取出可以手動完成，或者借助于自動化設(shè)備,可以使用從極慢到極快的不同速度進行。其它變化可以包括在冷凍狀態(tài)下從生物人工微血管中取出軸芯，用熱反應(yīng)性聚合物涂覆軸芯，或牽拉軸芯的任-一端使它變細直至斷裂?；衔锟梢哉T導親代血管形成萌芽而進入凝膠210中，所述化合物例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、和佛波酯、12-肉豆蔻酸-13-佛波乙酯(PMA),它們被加入到凝膠和/或灌注液(例如生長培養(yǎng)基)中。其它可用于誘導萌發(fā)的生長因子包括長R3胰島素樣生長因子(R3IGF-1)、胰島素樣生長因子(例如IGF-1)、白介素-8(IL-8)和人表皮生長因子(hEGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、肝素結(jié)合EGF樣生長因子(IIB-EGF)、血管生成素(angiopoietins)、胎盤生長因子、細胞因子，多種趨化因子(例如SDF-1a)、TGF-13、和可溶性有絲分裂原。此外，細胞接種密度也可以誘導萌發(fā)能力表型?？梢酝ㄟ^在兩個相鄰的親代生物人工微血管間形成壓力差來生成復雜的微細管網(wǎng)絡(luò)222，從而模擬動脈和靜脈血流。液體流將改向，從“動脈”生物人工微血管通過相互連接的萌芽進入“靜脈”生物人工微血管。有利地,所述灌注液可以含有含氧細胞生長培養(yǎng)基,不含血清、和促血管生成或抗血管生成的物質(zhì)。在另一個實施例中，所述灌注液可以是補充了血清和/或影響血管生成的化合物的含氧細胞生長培養(yǎng)基。而在另一個實施方式中，所述灌注液可以是含氧的生理鹽溶液。在某些情況中該培養(yǎng)基是在生理范圍內(nèi)有緩沖能力的。在另一個實施例中，所述灌注液可以包括含氧血液、血液組分、或血液替代品。在另一個實施方式中，所述灌注液可以是不含氧的，并通過基質(zhì)擴散來實現(xiàn)系統(tǒng)的充氧。而在另一個實施方式中,可以在灌注液中加入促血管生成或抗血管生成的化合物。在一個實施方式中，在所述基質(zhì)中加入促血管生成的化合物或抗血管生成的化合物等。而在另一個實施方式中，所述細胞包括基因修飾的細胞，該細胞能夠向灌注液中或基質(zhì)中釋放產(chǎn)物。而在另一個實施方式中，所述基質(zhì)可以優(yōu)選含有纖維蛋白、膠原、基底膜基質(zhì)、細胞外基質(zhì)成分和明膠。一種可用的基質(zhì)是Matrigel凝膠。在另一個實施方式中，所述基質(zhì)可以包括瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽或硅膠。在另一實施方式中，基于基底膜的基質(zhì)可以包括IV型膠原、基底膜蛋白多糖(perlecan)、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白(integrin)、巢蛋白(enactins)，營養(yǎng)不良蛋白聚糖(dystroglycans),VII型膠原纖維和VII型膠原微原纖維(microfibrils)。在另一個實施方式中，基于細胞外的基質(zhì)可以包括蛋白聚糖、糖胺聚糖(glycosaminoglycans)、硫酸肝15素蛋白聚糖(heparinsulfateproteoglycans)、硫酸軟骨蛋白聚糖(chondroitinsulfateproteoglycans)、硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖(keratinsulfateproteoglycans)、透明質(zhì)酸、膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、彈性蛋白和層粘連蛋白。在一個實施方式中，所述細胞可以選自由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、外周細胞、成纖維細胞、祖細胞、干細胞、肌細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、人細胞、動物細胞、植物細胞、真核細胞、基因工程化細胞、基因修飾的細胞、病態(tài)細胞、病毒感染的細胞和癌細胞所組成的組中。類似地,細胞可以位于所述基質(zhì)中，所述細胞可以選自由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、外周細胞、成纖維細胞、祖細胞、干細胞、肌細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、人細胞、動物細胞、植物細胞、真核細胞、基因工程化細胞、基因修飾的細胞、病態(tài)細胞、病毒感染的細胞和癌細胞所組成的組中，它們分散在整個基質(zhì)中，或者局部集中。在一些情況下，健康或病態(tài)組織(例如癌組織)的片段被植入到基質(zhì)中。在其它情況下，病毒感染的或基因工程的組織被植入基質(zhì)中。源自親代血管的萌芽可以在體外以切片材料或整體標本(whole-mount)的形式進行顯微鏡研究。以熒光溶液(例如熒光右旋糖酐)灌注生物人工微血管可以輔助分析萌芽直徑、萌芽內(nèi)腔的開放(patency)、和吻合(anastomization)的程度。萌芽形態(tài)的三維重建可以通過將由共聚焦顯微鏡得到的熒光圖像的z軸重疊來實現(xiàn)?？梢酝ㄟ^使用抗層粘連蛋白和IV型膠原的第--抗體和熒光或過氧化物酶標記的第二抗體的免疫標記在整體標本和組織(石蠟)切片對通過萌芽220的細胞外周基底膜基質(zhì)的合成進行監(jiān)控。在復合的EC/SMC萌芽中，可以通過使用人CD31(克隆P2B1-Chemicon公司)的FITC單克隆抗體(MAb)或FITC-UEA1凝集素(一種用于人類內(nèi)皮細胞的特異性標記物)標記內(nèi)皮細胞，對兩種細胞型之間的空間關(guān)系進行檢測。可以用人的ci-SM肌動蛋白的單克隆抗體并隨后用RITC抗小鼠第二抗體對平滑肌細胞進行標記。內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的細節(jié)以及內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之間的相互作用，可以從用前述試劑標記的石蠟切片中獲得。所描述的構(gòu)建方法是具有高重復性的,可作為商業(yè)上大量生產(chǎn)血管生成設(shè)備的基礎(chǔ)。經(jīng)過適當?shù)谋４?例如冷凍保存)，研究人員能夠以現(xiàn)貨的方式獲得預生長的親代血管或整個微血管網(wǎng)絡(luò)。冠狀動脈的替代品為了生成冠狀動脈的替代品，挑選具有一定外徑的軸芯來制備冠狀動脈替代品，該冠狀動脈替代品具有內(nèi)徑約為4-5.5毫米的血管內(nèi)腔?？蛇x地,所述軸芯可以是空心管，其可被灌注且它的滲透性足以滿足在冠狀動脈的替代品的生長期間的營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的交換。冠狀動脈的替代品可以只由平滑肌細胞生長得到，因此，生成的結(jié)構(gòu)類似于血管中的中膜層,或可以由兩種或三種細胞型形成復合結(jié)構(gòu)。將平滑肌細胞接種在軸芯上,并生長至300-400微米的環(huán)形層。為了加速冠狀動脈替代物的生成，可以用下述方式操縱SMC表型在初始的生長階段，使細胞進入高度增殖的表型；然后在血管壁達到期望的厚度后轉(zhuǎn)換成分化狀態(tài)。表型轉(zhuǎn)換(switch)將導致平滑肌細胞的生長速率顯著地減緩,并誘導細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(例如膠原和彈性蛋白)的產(chǎn)生,這些蛋白影響血管的機械性能。可以通過控制特定基因的表達實現(xiàn)表型的轉(zhuǎn)換。例如，在四環(huán)素反應(yīng)性啟動子的幫助下，基因表達(例如彈性蛋白)受到抑制直到管壁達到期望的厚度(ClontechLaboratoriesInc.)。從生長培養(yǎng)基中除去四環(huán)素，可以激活插入的基因。例如,彈性蛋白的過度表達,將進一步抑制細胞的增殖以及執(zhí)行管壁內(nèi)的結(jié)構(gòu)功能和信號功能。機械調(diào)節(jié)(例如動脈流)可以用于強化冠狀動脈替代品，并誘導細胞的生理排列(physiologicalalignment)。也可以使用其它外部或內(nèi)部的“表型轉(zhuǎn)換”。例如通過重組DNA技術(shù)對內(nèi)皮和平滑肌特異基因或其它候選基因進行改造使其可以通過天然的、細胞或組織特異性的、可誘導的、和異源啟動子介導表達。此外，先進的慢病毒轉(zhuǎn)導體系能夠使在所期望啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的目的基因整合到靜止或其它細胞類型中(ClontechLaboratoriesInc.,InvitrogenCorp.)。這些方法可實現(xiàn)對基因數(shù)量、表達水平、突變分析、和調(diào)節(jié)的操作，所有這些都可以控制細胞表型的轉(zhuǎn)換。在取出軸芯后或在平滑肌細胞的調(diào)整(conditioning)和重建后，可以直接將內(nèi)皮細胞接種在SMC套管上。內(nèi)皮細胞的接種可以通過將內(nèi)皮細胞懸浮液灌注到SMC套管中來完成。然后停止流動一段時間，以實現(xiàn)內(nèi)皮細胞的適當附著。如果需要，為了促進內(nèi)皮細胞平均分布，可以旋轉(zhuǎn)或重復地上下倒轉(zhuǎn)血管?？蛇x地，可以先將內(nèi)皮細胞接種在軸芯....I。在這種情況下，平滑肌細胞被接種在匯合的內(nèi)皮細胞層上。使用這個方法，需要防止內(nèi)皮細胞向富含氧氣和養(yǎng)分的冠狀動脈代替品的外圍遷移。如果期望，在SMC套管外面接種成纖維細胞能夠形成動脈外膜層。在某些情況下,為了血管的生長可以接種外周細胞，它們有利于基底膜的形成。在其它情況下，為了血管的生長也可以接種祖細胞和/或干細胞。用于生成冠狀動脈替代品的細胞可以源自自體同源的(autologous)、異源的、或異種的材料。所述細胞可以是干細胞、前體細胞、或分化細胞。所述細胞可以進行基因修飾，以獲得特定的表型或降低宿主生物體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明公開的CPD方法提供了用于大量生產(chǎn)可現(xiàn)貨供應(yīng)的血管替代品或為受體定制設(shè)計的血管替代品的選擇。本發(fā)明公開的CPD方法還適用于組織工程化的冠狀動脈替代品模型的開發(fā)，動脈粥樣硬化、動脈生成的研究,不同的血管細胞類型彼此之間以及與細胞外基質(zhì)組分之間的相互作用的研究，一氧化氮效應(yīng)的研究，和多種藥物的研究。不同大小或類型的血管和淋巴管本發(fā)明公開的CPD方法還可以用于生成在直徑和類型上不同于冠狀動脈的血管。軸芯直徑的改變將改變血管的直徑。在某些情況下，軸芯可以從大約20微米至大約500微米，接近更小血管的大小。在其它情況下，軸芯可從大約200微米至大約5.5毫米，接近中等至更大的血管。可以通過細胞的表型和/或抑制細胞增殖的時間點來改變血管的類型(例如動脈、靜脈、淋巴管)。例如靜脈僅含有小的平滑肌細胞層。其它管狀組織本發(fā)明公幵的CPD方法可以被用于其它管狀組織的工程化，例如膽管、淚管、咽鼓管(pharyngotympanytube)、輸卵管、輸精管、輸尿管、尿道、肺氣管等。本發(fā)明公開的CPD方法也證明可用于由包括膠質(zhì)細胞在內(nèi)的不同類型細胞生成神經(jīng)導管,并指導神經(jīng)的生長和修復。用于工程化組織的BAV系統(tǒng)本發(fā)明公開的CPD方法可以用于通過使用可去除的軸芯陣列作為骨架的組織和器官的工程化。將期望的組織/器官(肌肉、肝臟、腎臟、肺、皮膚等)的細胞接種到涂覆有附著蛋白的軸芯上。這些軸芯可由固體纖維或線材制成，或可選地由可灌注的、滲透性的管制成，例如纖維素。所述軸芯以允許結(jié)合單細胞套管的精確間距相互分離。使用這個方法可以形成片狀或塊狀的組織。然后取出軸芯(或以不同方法去除)，通過灌注系統(tǒng)的幫助向生物人工組織進行內(nèi)部灌注。創(chuàng)傷愈合設(shè)備預制的生物人工血管系統(tǒng)可以用于幫助創(chuàng)傷愈合，例如糖尿病人的慢性潰瘍(ulcers)。生物人工微血管網(wǎng)絡(luò)可以被植入片狀的載體材料中(例如來自富含血管生成生長因子的細胞外基質(zhì)凝膠中)，并放置在創(chuàng)傷處。用含氧的營養(yǎng)液進行自動灌注，所述生物人工血管將會促進供體血管和皮膚的萌發(fā)。可選地，這樣的生物人工血管修復片段可以夾在創(chuàng)傷和皮膚移植物之間，并促進移植物的向內(nèi)生長。生物人工血管可以用于植入式給藥設(shè)備。從病人體內(nèi)取得的細胞,能夠在體外進行基因修飾以生成特定的蛋白(激素、酶等)。使用上述方法，可以使這些細胞生長成生物人工血管或血管網(wǎng)絡(luò)。重新植入到宿主中，所述細胞可以繼續(xù)產(chǎn)生目標物質(zhì)并將它釋放到局部或全身。人工組織和器官如上所述，組織工程化的血管網(wǎng)絡(luò)可以用于生成組織或乃至整個器官。一個方法是生成一個或多個體外可灌注的親代血管。將從期望的組織或器官中得到的實質(zhì)(parenchymal)細胞接種在所述親代血管的周圍,例如，在凝膠中。也可加入不同的基質(zhì)細胞類型(例如免疫細胞、炎癥細胞、外周細胞、成纖維細胞、或內(nèi)皮細胞)。通過親代血管給實質(zhì)細胞供應(yīng)養(yǎng)分和氧氣。隨著實質(zhì)細胞的增殖，養(yǎng)分和氧氣的需求量將增加。所述細胞釋放血管生成因子，并刺激血管萌發(fā)。血管系統(tǒng)以與組織生長相同的速率萌發(fā)，其非常類似于自然生長。因此，這個系統(tǒng)也將是一個用于發(fā)育生物學研究的良好模型。另一個方法利用平行排列的軸芯陣列作為基質(zhì)細胞的骨架。隨著基質(zhì)細胞的增殖，環(huán)繞軸芯形成細胞層。最終，所有軸芯之間的空間被實質(zhì)細胞充滿，生成了片狀組織。在取出軸芯后，該組織可以通過在軸芯處留下的通道進行灌注。通過內(nèi)腔接種，這些通道能夠變成內(nèi)皮狀。該方法不限于在二維空間?？梢远逊e多個片狀組織,或使用三維骨架。本發(fā)明的發(fā)明人使用了用于肌肉組織的工程化的二維陣列和三維陣列。而在另一個方法中，能夠獨立地生成組織層和血管網(wǎng)絡(luò)層，然后間歇地進行堆積。所有的這些方法能夠生成具有一種或兩種細胞型的簡單模型，或者能夠生成含有多個細胞型的復合構(gòu)型。在植入后，以這些方法工程化的組織或器官可直接與血流接觸,或通過灌注系統(tǒng)持續(xù)灌注直至宿主脈管系統(tǒng)生長進移植物中。灌注組織工程化肌肉結(jié)構(gòu)的實施例現(xiàn)在參考圖8a,描述了在體外接種平滑肌細胞后的多個軸芯的圖片。多個軸芯與收縮管單元M被夾持在Mylar框架中。軸芯M之間的距離可以調(diào)整到約100微米。所有收縮管片段的末端結(jié)合在一個上游多支管和一個下游多支管中(圖中未示出)。所述Mylar框架是經(jīng)過滅菌的，內(nèi)腔被覆蓋并使用每毫升5X106個的大鼠動脈平滑肌細胞SM(RASMCs)的懸浮液進行接種。所述SM細胞附著在每個單獨的軸芯M上并增殖，因而形成了環(huán)狀層。10天后，獨立的層結(jié)合到一起并最終形成了平滑肌細胞的厚片或厚盤。在生長培養(yǎng)基中再放置7天后，向培養(yǎng)基中補充50U/毫升的肝素(heparin)，并再培養(yǎng)7天。然后，取出所有的軸芯，并用肝素培養(yǎng)基以10毫升/天的速度對組織進行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝素培養(yǎng)基的100毫米Petri盤的底部。對SMC盤灌注11天。灌注結(jié)束后,通道CH的功能仍被保留，并在體外清晰可見(如圖8b所示)?，F(xiàn)在參考圖8b，描述了灌注肌板MP的實例。所示的灌注流體通過管道末端(T)進入由除去的軸芯留下的通道(CH)中?，F(xiàn)在參考圖9,示意性描述了CPD的可選實施方式。在一個實施例中，CPD900包括并列放置在第一載玻片904和第二載玻片920之間的一層902。該層902的厚度適宜于植入以通道922相接的多個流通口。所述多個流通口包括細胞懸浮液口914、多個入口912和多個出口918。以通道922相接的口可以流通并類似地分享流體功能。排布了多個口(例如口912)以提供多個出入點。優(yōu)選地,其它應(yīng)用可采用帶流體腔和以微流體材料形成的口的微流體設(shè)計。同樣地，所述層可含有硅酮或適宜用于顯微鏡或微流體應(yīng)用的其它材料。膠原腔906優(yōu)選由一對空的、柔韌的毛細管916或等同物定位用于出入。所用毛細管的數(shù)量從一到遠大于二,這由CPD的大小和生成血管的數(shù)量所調(diào)節(jié)。通過管入口940A、940B可由一個或多個注射泵通過層出入每個口和腔,其中所述注射泵依附在具有針的注射器上。雖為了簡化附圖只顯示兩個注射泵管入口940A、940B，但可以理解的是根據(jù)情況可采用分離的注射泵、注射器或等同物來注入或抽取材料至每個腔和/或口。在一個實施方式中，所述注射泵與氣密注射器連接。描述了可選實施方式CPD900的特征,可幫助理解本發(fā)明現(xiàn)在要描述的構(gòu)建CPD的方法。在一個實施例中，層902采用硅酮層，在硅酮層上鉆孔得到洞和通道的模型，并以粘合頂層943和粘合底層945覆蓋硅酮層。然后，以空心針刺穿所述硅酮，之后將它用于指引聚酰亞胺涂覆的熔融石英毛細管916進入膠原腔906以及進入一個入口912。以小口徑管910支撐兩個毛細管，引導從主腔進入出口908。然后在粘合層的幫助下將所述硅酮層902夾持在兩個載玻片之間。然后將CPD900高壓滅菌并保存?zhèn)溆?。為獲得準備生成血管的腔906，制備膠原溶液，通過注射針直接將該溶液注入膠原腔906中，并在培養(yǎng)箱中過夜形成凝膠。再通過將注射針插入兩個入口將CPD900與注射泵相接。依次將注射針與氣密管相接，形成兩個氣密注射器,充入調(diào)節(jié)好pH的生長培養(yǎng)基，并安裝注射泵。以相似的方式將兩個出口908A、908B與廢液儲池相接。然后按操作灌注泵一樣打開注射泵，由此充進入口繼而填充入口、毛細管和出口。當所有空氣被排出體系時，以鑷子夾取每個毛細管,將伸入膠原腔的端部通過膠原凝膠往回拉直至毛細管端部到達基質(zhì)腔中。按這個程序,在膠原凝膠中形成了兩個可灌注通道。為了將細胞接種至膠原通道中，將高度濃縮的內(nèi)皮細胞懸浮液注入到細胞懸浮液口中。然后關(guān)掉注射泵，其它毛細管端部被拉回至含有細胞的小儲池914R中，這導致大量細胞立即回流進入所述膠原通道。通過廢液儲池的高度，可嚴密控制細胞的流動速率。在某些情況下,所述流動速率可以調(diào)節(jié)到接近天然毛細血管和血管的體內(nèi)流動速率。然后將CPD在培養(yǎng)箱中放置45分鐘,使細胞附著到膠原通道的壁—t?？蓪PD倒轉(zhuǎn)幾次或以其它操作使細胞呈最佳分布。最后，毛細管被拉出細胞儲池進入作為入口的一部分的儲池,打開注射泵并設(shè)定期望的灌注速率。過量的細胞被洗出。這個接種程序可在生長一段時間之后獲得具有同源單細胞層的兩個親代血管，其中注入了更加高度濃縮的細胞數(shù)會使所需時間更短。應(yīng)注意的是依據(jù)所用的軸芯類型，可通過抽取和/或降解從基質(zhì)中去除軸芯。現(xiàn)在參考圖10,描述了單個親代血管1050生長萌發(fā)1052進入周圍基質(zhì)1054中。當將人臍帶靜脈細胞(HUVECs)接種至膠原通道中時,生成的親代血管開始形成萌芽進入膠原中。這些萌芽延伸并幵始分枝。最終這些分枝與來自另一親代血管的分枝相吻合，從而形成血管網(wǎng)絡(luò)?，F(xiàn)在參考圖11,描述了第一親代血管1102通過萌芽1106網(wǎng)絡(luò)與第二親代血管1104相接。所述萌芽1106具有內(nèi)腔并且是可灌注的。生成親代血管的方案現(xiàn)在參考圖12,描述了通過在膠原基質(zhì)的通道中接種來生成親代血管的可選方法。已經(jīng)描述了采用硅酮層的可選CPD,將描述用于生成微血管系統(tǒng)的應(yīng)用的特定實施例以促進本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。將CPD在高壓滅菌鍋中滅菌，并保存在無菌環(huán)境中備用。制備膠原溶液并在冰上保存。將膠原充入小注射器中。在注射器中固定30G的注射針，并通過注射針將膠原溶液注入膠原腔中直至腔中完全充滿了膠原1002。從該腔的對面插入第二注射針作空氣出口。然后通過將注射針插入兩個入口，將CPD與注射泵相連1004。依次將注射針與氣密管相接，形成兩個氣密注射器，充入調(diào)節(jié)好PH的生長培養(yǎng)基，并安裝注射泵。以相似的方式將兩個出口與廢液容器相接(即將注射針插入出口，該注射針帶有引導至廢液容器的管)1006。通過操作作為灌注泵的注射泵來灌注CPD,由此充進入口繼而填充入口、毛細管和出口1008。當所有空氣被排出體系時(例如以小口徑注射針充當可去除的空氣出口)，然后以鑷子夾取每個毛細管,將伸入膠原腔的端部通過膠原凝膠往回拉直至毛細管端部到達基質(zhì)腔中。按這個程序，在膠原凝膠中形成了兩個可灌注通道1010。為了將細胞接種至膠原通道中，將高度濃縮的內(nèi)皮細胞懸浮液注入到細胞懸浮液口中1012。然后關(guān)掉注射泵，其它毛細管端部被拉回至含有細胞的小儲池中，這導致大量細胞立即通過毛細管回流進入膠原通道1014。通過背壓(廢液儲池的高度)可嚴密控制細胞的流動速率。然后將所述毛細管進一步拉回進入與入口相接的儲池中。再將CPD在培養(yǎng)箱中放置45分鐘，使細胞附著到膠原通道的壁上1016。可將CPD倒轉(zhuǎn)幾次或以其它操作使細胞呈最佳分布。最后，打開注射泵并設(shè)定期望的灌注速率1020。過量的細胞被洗出。這個接種程序可獲得具有同源單細胞層的兩個親代血管1022。通過灌注如上所述的親代血管可生成一個或多個微血管網(wǎng)絡(luò)?？蛇x地，用于生成親代血管的程序也可包括將軸芯植入膠原基質(zhì)中，抽取軸芯，將細胞注入至軸芯留下的通道中，也可以如上所述參照圖1A4C和其它將細胞接種在軸芯上。兩種方法的組合可實現(xiàn)不同細胞類型形成層。激活萌發(fā)能力表型的方案在另一實施例方法中，高密度接種細胞類型激活了細胞由親代血管萌發(fā)成微血管的能力。除非另外注明，如上所述以CPD900實施該方法。下列的圖像是采用標準技術(shù)和試劑由明視野或共聚焦熒光顯微鏡拍攝的。激活萌發(fā)能力表型所特有的特征是突出的,可幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。參考圖13A，描述了形成有萌發(fā)能力的細胞和親代血管的方法。以高密度接種細胞類型(例如人臍帶內(nèi)皮細胞(HUVECs))1.300，其中在通道三維空間中大部分細胞是直接接觸或非常接近鄰近細胞的。一組細胞是與通道壁的基質(zhì)相接觸。高密度接種可激活細胞的萌發(fā)能力1304。不受特定理論的約束，認為這種表型來自于細胞間的接觸，當高密度接種細胞時,激活了由細胞之間的同型接觸1308誘導的細胞信號。還預期不同細胞類型之間的異型相互作用也有助于激活萌發(fā)能力表型。此外,細胞與通道壁的基質(zhì)成分之間的接觸有助于激活萌發(fā)能力1312。而且,與細胞接觸的可溶性生長因子對激活萌發(fā)能力有貢獻1316。例如，之前顯示了存在于灌注液培養(yǎng)基中的生長因子可以誘導萌發(fā)(例如圖7所示)。在接種和灌注細胞過程中還可能存在細胞對灌注液流動的機械感應(yīng)的貢獻1320。據(jù)對細胞的觀察,細胞信號傳導事件可能會激活萌發(fā)狀態(tài)1304。當細胞被灌注到基質(zhì)通道中時，它們會生長或由于細胞遷移而形成具有連續(xù)內(nèi)腔的親代血管1324。灌注并培育所述親代血管使其存活并萌發(fā)微血管進入基質(zhì)1328。萌發(fā)能力表型的觸發(fā)開始表現(xiàn)為與接種密度相關(guān)的一種現(xiàn)象，但目前進行的分析會揭示這種表型是否可被進一步調(diào)節(jié)。進一步生長會形成復雜的三維微血管網(wǎng)絡(luò)1332。在--些實施方式中，來自于不同親代血管的微血管網(wǎng)絡(luò)通過吻合而合為一體。不受特定理論的限制，一種假設(shè)是萌發(fā)能力表型是由介導取決于接種密度的細胞信號的接觸總和所驅(qū)動的。此外,可評估來自于高密度接種的物理力對萌發(fā)能力表型的貢獻。例如高密度接種內(nèi)皮細胞會導致物理擠壓使內(nèi)皮細胞在此過程中擠成一團。在開始接種期間不可能使內(nèi)皮細胞在血管形成中呈典型的橫向伸展，因為此時細胞被緊密地擠在一起，生長進入基質(zhì)可能更有利于觸發(fā)萌發(fā)表型?！，F(xiàn)在參考圖13B,描述了可選的細胞灌注設(shè)備CPD1350。CPD1350通過單個流通入口1354和單個流通出口1392提供長期連續(xù)灌注，以增強灌注的功能和效率。采用氧等離子體將硅酮層1366密封在第一載玻片1370和第二載玻片1374內(nèi)，并表示為封條1362。得到的封條1362在長期灌注形成的壓力下是不漏水的。所述單個流通入口1.354通過注入填充腔1378內(nèi)可以允許高密度灌注和接種細胞。在膠原基質(zhì)腔1390內(nèi)，導管1382與玻璃毛細管軸芯1384相連。膠原可被注入到基質(zhì)腔1390內(nèi)，并在膠原腔1390中的玻璃毛細管軸芯1384周圍形成基質(zhì)。通過導管1382去除玻璃毛細管軸芯1384，在膠原基質(zhì)內(nèi)部提供了通道1388。流動的灌注液培養(yǎng)基1394輸入流通入口1354,通過導管1382進入通道1388，并穿過基質(zhì)腔1390進入第二填充腔1378，到出口1392,再進入廢液儲池1396。在可選的實施例CPDs中可存在多于一個的通道。現(xiàn)在參考圖13C至圖13E，示意性地描述了CPD的接種。在圖13C中示意性地描述了可選CPD1350的頂視圖。注意方向與圖13B相反。所示的CPD1350在可填充膠原的基質(zhì)腔1390中具有軸芯1384。該CPD含有以氧等離子體密封在兩個載玻片1370/1374之間的硅酮層1366?，F(xiàn)在參考圖13D,將膠原1391或等效基質(zhì)注入到所述基質(zhì)腔1390中，并使其在軸芯1384周圍形成凝膠。通過導管1382去除所述軸芯，留下通道1388。將細胞1(例如HUVECs和其它細胞類型)以高密度接種到灌注液培養(yǎng)基1394中。可通過適宜方式(例如通過注射器)注入細胞。通過泵或等同設(shè)備維持灌注液流動，該設(shè)備將細胞1移動到通道1388中，在通道中暫時停止流動約45分鐘，以使細胞附著到通道壁上。通過培養(yǎng)箱或等同設(shè)備的方式使細胞生長，從而在通道內(nèi)形成萌發(fā)的親代血管(未畫出)?，F(xiàn)在參考圖13E，描述了CPD1350被配置為--旦恢復灌注，可以從細胞1形成親代血管。此處,描述了入口1354與出口1396都在CPD底部的同一側(cè)，這有利于該設(shè)備的操作，但如圖13C和圖13D中入口1354在右邊位置也具有相似的功能。培養(yǎng)箱使萌發(fā)的微血管進一步生長，直至微血管形成網(wǎng)絡(luò)。下面的實施例采用CPD(例如CPD1350)、等同設(shè)備進行,或為示意性描述?，F(xiàn)在共同參考圖14A、圖14B和圖14C,示意性地描述了在基質(zhì)通道中高密度接種的方法。在圖14A中，描述了膠原基質(zhì)1400與通道1404在一起的實施例。通道直徑可以制成用于血管生成研究或血管生長的任何期望的尺寸。在特定流動速率的灌注液培養(yǎng)基1412中，將細胞1408(例如人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs))單獨或與其它細胞類型(例如，SMC、外周細胞、成纖維細胞和前體細胞)混合，以高密度接種到通道中。在某些實施方式中，內(nèi)皮細胞或等同物是以每平方毫米約250個細胞的最小高密度值至每平方毫米約2000個細胞的最大高密度值而存在，測得的平均細胞大小約為18.0微米直徑，系統(tǒng)修正因子為約2.5。因而細胞是高度濃縮的,并表現(xiàn)出降低流動的特性。灌注液培養(yǎng)基1412的流動速率是由注射泵或等同設(shè)備所設(shè)定的，并可被調(diào)節(jié)以提供特定流動速率和給定通道的壓力。在特定實施方式中，采用了2毫升/分鐘的流動速率，其對應(yīng)了1.2dyn/cm2的剪應(yīng)力。在生理學和代表性附加實施方式中報道了0.75"30dyn/cm2的剪應(yīng)力值。在其它實施方式中，流動速率也可被調(diào)節(jié)以產(chǎn)生正常限度之外的剪應(yīng)力,用于形成病理狀態(tài)。在圖14B中，在某些實施方式中，濃度足夠高以使細胞在通道中的流動明顯減慢或停止，就如在給定流動速率1424F天然發(fā)生栓塞1420—樣。在許多情況中，細胞的栓塞是暫時的，不需加大流動速率或壓力即可解決。在其它情況中，可加大流動速率和壓力以消除細胞栓塞。在特定實施例中，細胞的流動在栓塞1420處停止大約1或2秒，然后無需由泵調(diào)節(jié)流動速率即恢復1425。在其它實施例中，只在形成細胞栓塞之前或之后略微增加流動速率。在代表性實施方式中，再通過切斷泵大約30-45分鐘來中斷流動，以使細胞附著到通道壁上。認為在高密度接種時細胞的濃度足夠高以使細胞流動減慢。此外,證據(jù)顯示有物理應(yīng)力(physicalstresses)作用于細胞,所述物理應(yīng)力來自灌注液的流動和壓力，以及來自細胞之間的接觸,和來自細胞與通道壁之間的接觸。這些物理力對細胞產(chǎn)生了刺激和脅迫，這在形成細胞栓塞暫時停止流動時尤其明顯。根據(jù)細胞濃度、壓力和流動速率的變化，累積的物理刺激可變化、增強或降低。盡管大家認為在體外的萌發(fā)表型是經(jīng)與高密度接種相關(guān)的機制介導的，但在某些情況中，可增加灌注液培養(yǎng)基的粘度以給予(impart)進一步的物理應(yīng)力作用。同樣地,大家認為累積剌激有助于或啟動介導激活萌發(fā)表型的細胞事件。此外，灌注壓力表現(xiàn)出隨時間影響生長速率和萌芽成熟。應(yīng)該注意的是在體內(nèi)萌發(fā)是不依賴于接種密度或呈球形的細胞。在體內(nèi)由扁平細胞發(fā)生萌發(fā)且不依賴于細胞密度。預期一組正確的血管生成因子、ECM、和灌注液會剌激正常扁平內(nèi)皮細胞或等同物在我們的體外模型中萌發(fā)，類似于在體內(nèi)所觀察到的?，F(xiàn)在參考圖14C，描述了整個通道的側(cè)視圖。在培育使細胞附著到通道壁1404上之后，灌注液培養(yǎng)基的流動速率被增加1432至大約每分鐘2毫升，以從通道1428中清除未附著到通道壁1404上的細胞。清除之后,細胞層排列在所述通道壁1404上。大部分細胞匯合并與其它細胞和基質(zhì)相接觸。用于圖示的目的，整個通道側(cè)面的示意圖描述了如灰色陰影1434所示的排列在遠側(cè)的細胞，而以黑色輪廓1436、1438示意性地描述出那些在通道頂部和底部的細胞。在某些區(qū)域,細胞可以是兩層或多層厚1436,但大部分細胞是以單層1438而存在。在某些情況中，細胞可以不與其它細胞接觸1440,起初是半?yún)R合的直至后來增殖形成親代血管?，F(xiàn)在參考圖15A,以頂壁1530和底壁1534描述了具有大約150um直徑的代表性通道1510的膠原基質(zhì)1500的實施例。如圖14A-C所述的,將HUVECs高密度接種到該通道1510中。形成了終濃度大約3mg/ml的膠原基質(zhì)。在可選實施方式中可使用更高或更低濃度的膠原或等同物。在一些實施例中，可使用可選或雜合基質(zhì)組合物?，F(xiàn)在參考圖15B，描述了以附著人臍靜脈內(nèi)皮細胞1520、1540、1544(HUVECs)接種的相同的基質(zhì)1500和通道1510。在這個實施例中，以每平方毫米通道大約1000-2000個細胞將細胞接種到通道內(nèi)，其中細胞看上去是極限填充的。在接種期間，灌注液停止流動大約一秒天然形成的栓塞，這無需改變流動速率繼續(xù)灌注即可解決。在此時關(guān)掉泵停止灌注大約30-45分鐘，以使細胞到通道壁上，然后進行灌注。隨后,將泵開在2毫升/分鐘的速率,用于清除未附著細胞,使細胞以一層1520或兩層或更多1540層的厚度排列在通道上。在某些情況中，如果需要促進流動和清除細胞，可采用更高的灌注液流動設(shè)置。在頂部1540或底部1520的細胞是清晰的且表現(xiàn)出更強折射性。在中心部分1544看見的細胞稍微有些模糊，表示附著在通道近側(cè)和遠側(cè)的細胞。在圖15C中，示意性地描述了圖15B中的通道1510(通道的端視圖)。這表示了清除未結(jié)合細胞之后的通道。大部分細胞1520、1540、1544直接相互接觸或與通道壁1530/1534接觸，形成匯合的細胞套筒，大多數(shù)情況中該套筒是一層厚。某些區(qū)域可含有兩層或多層細胞1540。在某些情況中，可存在細胞接近與其它細胞接觸而成半?yún)R合1550的區(qū)域。隨后在親代血管生長時的細胞增殖通常會覆蓋這些區(qū)域?，F(xiàn)在參考圖16,描述了激活細胞(HUVECs)萌發(fā)能力的實施例。上面版塊描述了膠原基質(zhì)內(nèi)的通道1610，該通道中以細胞密度梯度1630接種多個細胞1620。通過提前停止流入細胞形成細胞梯度，從而在通道1604的上游端每通道體積中的細胞較少,在下游端1608的細胞濃度較大。使細胞附著大約45分鐘,然后進行灌注。通常很快地在幾分鐘內(nèi)在完整內(nèi)腔中形成親代血管,幾乎在高密度濃度接種細胞時立即形成。然后當細胞附著并伸展時形成完整單細胞層，通常在大約30-60分鐘發(fā)生。當采用較低細胞濃度時，要更久才能形成完整單細胞層。由親代血管萌發(fā)微血管也取決于接種密度。在高密度接種的親代血管中,幾小時之后就可見第一個微小萌芽,其似乎僅僅是細胞前突。更大的萌芽通常在接種后的頭2-3天期間出現(xiàn)。細胞密度梯度的中段1600是明顯的萌發(fā)表型首先被激活并可觀察到的地方。在上面版塊可以看到在生長的第1天，在通道的三維空間內(nèi)，大部分(但不是全部)細胞1634與鄰近細胞接觸。細胞1620也與通道壁接觸。下面版塊描述了在同一通道1610中灌注生長12天之后的親代血管1640。從親代血管的中間區(qū)域1644可觀察到微血管明顯萌發(fā)的開始。這個區(qū)域?qū)?yīng)由上面版塊的線條1600所示的細胞密度。在更上游1612處觀察到更明顯的萌發(fā)，而對應(yīng)更低細胞密度的親代血管下游端未出現(xiàn)萌發(fā)1660。微血管持續(xù)萌發(fā)，且增殖隨細胞接種密度的增加1650而增加。在靜止域和萌發(fā)域1664之間的分界是清晰的，且與接種密度密切相關(guān)。在大多數(shù)情況中,低密度接種導致不會增殖和萌發(fā)微血管的靜止親代血管。這種現(xiàn)象表明接種密度的閾值觸發(fā)所述表型。在定量實驗中進一步估算了觸發(fā)細胞激活的細胞密度(例如，參見圖20A-F和圖21A-B)。在此密度之下接種細胞可能會保留減少的萌發(fā)微血管的能力。除了細胞間接觸觸發(fā),認為灌注液的組成也影響萌發(fā)的能力。灌注液培養(yǎng)基中存在的生長因子可與細胞接觸信號協(xié)同作用，以介導所述表型。此外，細胞與基質(zhì)接觸也有助于所述表型。而且，來自灌注液流動和壓力的物理力和來自栓塞形成的應(yīng)力也有助于激活細胞萌發(fā)能力。但是，細胞間接觸觸發(fā)似乎明顯有助于激活萌發(fā)能力表型。現(xiàn)在參考圖17,描述了兩組縱列(tandem)的由高密度接種經(jīng)過吻合形成復雜三維微血管網(wǎng)絡(luò)的親代血管。將單個CPD灌注培育一段時間并在最長5周結(jié)束的時間點處理。在大部分實驗中通道距離大約500微米，但也要檢測其它結(jié)構(gòu)。沒有測定微血管可交叉的通道之間的最大距離。但是,微血管應(yīng)該能夠朝距離超過500微米至約幾毫米的其它親代血管生長。描述了在一周1700和三周1740之后，由導管1704生長的親代血管1710、1720。在生長一周1700之后,觀察到第一血管1710和第二血管1720直徑膨大且它們的相關(guān)微血管1730萌發(fā)形成兩個血管之間的微血管網(wǎng)絡(luò)。在一個類似試驗1740中，三周之后微血管網(wǎng)絡(luò)1750經(jīng)吻合而合并,并保存活性且可以灌注。可以看到親代血管1760、1770，但它們幾乎完全合并到微血管網(wǎng)絡(luò)中。在一些實施例中，微血管網(wǎng)絡(luò)合并到形成洞穴的程度，但是該網(wǎng)絡(luò)仍能夠通過微血管灌注。經(jīng)吻合而使微血管網(wǎng)絡(luò)合并所需的培育時間取決于通道之間的原始布置和距離。灌注縱列的親代血管導致萌芽和復雜三維微血管網(wǎng)絡(luò)的形成。由親代血管在整個三維中生長萌發(fā)微血管。如果親代血管原來是緊鄰的，萌發(fā)的微血管網(wǎng)絡(luò)通常吻合形成較大的保持活性并具有灌注能力的合并的微血管網(wǎng)絡(luò)。對長達五周的連續(xù)灌注過程進行了檢測。以活/死熒光活性染色檢測,整個親代血管和復雜且擴展的微血管網(wǎng)絡(luò)中的大部分細胞保持活性?？捎玫娜玖侠缁?死染料是商業(yè)上可獲得的(例如CarlsbadCA的InvitrogenCorp.)。總之，萌發(fā)隨時間而減慢，這可能反映了HUVEC原代細胞培養(yǎng)物在體外培養(yǎng)受限。萌發(fā)的微血管可能生長也可能退化,這取決于營養(yǎng)物質(zhì)、細胞信號和培養(yǎng)條件(例如,存在或缺乏血清和特定生長因子)。通過本發(fā)明的方法采用內(nèi)皮細胞和其它細胞類型，可以評估新形成微血管的穩(wěn)定性和向更成熟血管的成熟。已顯示出通過培養(yǎng)條件和支持細胞的存在，會使含有內(nèi)皮細胞的復合微血管穩(wěn)定。已顯示例如無血清條件下的生長因子(如VEGF、IGF-1)會促進血管生成并增強體外毛細管狀網(wǎng)絡(luò)的短期穩(wěn)定性(French,Lindemannetal.2001)。同樣地，已顯示添加血管周細胞(例如外周細胞和平滑肌細胞)可穩(wěn)定這種新形成的毛細管并幫助它們成熟(French，Lindemannetal.2001)。添加其它細胞類型(例如內(nèi)皮(血管)祖細胞或干細胞)，并結(jié)合確定的灌注液培養(yǎng)條件，也可有助于復合微血管的穩(wěn)定和成熟。現(xiàn)在參考圖18，在幾個鄰近版塊中描述了內(nèi)腔灌注1-8天之后親代血管的生長，以圖示說明其它生長特征。對用于生長親代血管的每個CPD做類似操作，并對每個親代血管1800、1810、1820和1830在所示天數(shù)做成像處理。從在一些版塊中可見的導管1804灌注每個親代血管。第一版塊顯示灌注一天之后的僅初生萌發(fā)微血管1808的親代血管1800。在下一版塊中顯示灌注五天之后茂盛萌發(fā)微血管1840的血管1810。親代血管1814直徑的可見增長也是明顯的。下一版塊顯示灌注六天之后親代血管1820增長達到了原有150微米直徑的兩倍。顯然親代血管細胞的增殖包含生長到導管1804的端部1824。最后一個版塊顯示灌注八天之后親代血管1830繼續(xù)萌發(fā)微血管1840,并且直徑持續(xù)略微增長。血管生長至導管1804的端部也是明顯的1834。據(jù)信每個親代血管直徑的膨大是來自細胞在膠原基質(zhì)內(nèi)的侵入和生長，和來自血管對灌注液流動壓力的響應(yīng)。觀察到細胞增殖和萌發(fā)的程度隨時間而繼續(xù),但在培育幾周之后有些減慢了。生長和萌發(fā)的減慢可能是由于HUVECs在體外有限的壽命。參考圖19，描述了代表性微血管網(wǎng)絡(luò)的共聚焦三維重建圖像。采用之前描述的高密度接種方法來生長微血管網(wǎng)絡(luò)1900。以羅丹明標記的麥胚凝集素來標記萌發(fā)的微血管，使微血管中內(nèi)皮細胞的膜結(jié)構(gòu)可見,并以熒光DNA染色4‘，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI:)來顯示核。在A版塊中，可以看到基于三維管結(jié)構(gòu)和灌注，微血管1910分枝具有完整通暢的專用內(nèi)腔。在B版塊中，描述了具有完整管狀血管結(jié)構(gòu)的微血管1920的高倍放大圖。也顯示了該樣品中單個內(nèi)皮細胞的核1930。來自微血管的分枝是明顯1940具有完整通暢的專用內(nèi)腔和核。經(jīng)染色和灌注能力的評估，該微血管的結(jié)構(gòu)是有活性的。萌發(fā)的定量分析現(xiàn)在共同參考圖20A至圖20F和圖21A至圖21B,進行了一系列定量圖像分析試驗以確定觸發(fā)所述萌發(fā)能力表型以及萌芽生長方面的最小和最大接種密度。如前所述，在CPD1350中接種內(nèi)皮細胞并培育以形成萌發(fā)的親代血管。在接種后按小時(h)的時間點檢測樣品，以檢測較短期和較長期培育對萌發(fā)的影響。在長達96h的培育實驗中對接種后的0、24h、48h、72h和96小時(h)進行數(shù)據(jù)分析，以分析萌發(fā)的親代微血管的生長。測定了提供萌發(fā)的最小和最大細胞接種密度，以及沿親代微血管位置測量平均萌芽長度。通過沿血管長度分析視頻影像數(shù)據(jù)的平均灰度值(GSV)進行細胞接種密度的測量。采用具有4X0.10NA物鏡的轉(zhuǎn)換暗視野顯微鏡獲得分析的圖像。沿血管長度每100象素選擇100象素寬的目標區(qū)(R0I)，以在每個盒內(nèi)取樣平均GSV。為補償不均衡的背景照明，采用另一類似的ROIs在血管周圍取樣背景。將修正背景的平均GSV對沿血管的位置作圖。為計算細胞接種密度,在給定的R0I內(nèi)建立了細胞數(shù)量和平均灰度值之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在所測量的細胞計數(shù)范圍內(nèi)細胞接種和GSV之間的關(guān)系大約呈線性(數(shù)據(jù)未示出)。最佳擬合線的斜率用于以平均GSV計算細胞接種密度?，F(xiàn)在參考圖20A,描述了初始細胞接種密度對沿親代血管的位置的圖2000。通過以萌芽長度對細胞接種密度作圖得到最小細胞接種密度,其中在該圖的最佳擬合線中萌芽長度等于零時是真實的最小細胞接種密度。這些值是24h的每平方毫米362個細胞，48h的每平方毫米340個細胞，每平方毫米317個細胞，和96h的每平方毫米293個細胞。在細胞接種密度實驗中實際接種最小值通常比以上舉例的值(例如96h的293個細胞/平方毫米)和圖21B所作出的值更大。現(xiàn)在共同參考圖20B至圖20F，在圖20A(上方)中摘錄了短期生長實驗中萌發(fā)的親代微血管的顯微鏡圖像。在圖20B中，描述了在細胞接種密度重疊區(qū)2012的初始細胞接種2008。在圖20C中描述了接種后培育24小時之后萌發(fā)的親代微血管2016。在親代微血管2018的中間部分顯示出代表性的萌芽。通過白線2020指示最低密度區(qū)域的活性萌芽。顯示了24h2024、72h2032和96h2040之后的同一親代血管。對于每個2028(48h)、2036(72h)、2044(96h),也通過白線顯示發(fā)現(xiàn)活性萌芽的最小初始接種密度。通過每個親代微血管2026(48h)、2034(72h)、2042(96h)中間的代表性萌芽可看出整體萌芽長度隨時間增長。在圖20F中，在活性萌芽的最小密度的白線2044左邊可見到氣泡?？梢钥闯鲈诿劝l(fā)明顯的區(qū)域中萌發(fā)是相當不均勻的。由來自短期生長實驗的數(shù)據(jù)建立了萌發(fā)所需的最小接種密度,萌發(fā)的最小值是大約250個附著細胞/平方毫米。這個最小值與大約1000-2000個細胞/平方毫米的峰值相對，其中接種期間細胞看—匕去被最大程度地充滿在導管或通道內(nèi)。測得的1000-2000個細胞/平方毫米符合理論最大值?，F(xiàn)在參考圖21A和圖21B,也測定了從0-96小時親代血管生長的平均萌芽長度。在圖21A中，描述了24h2116、48h2108、72h2112和96h2116的萌芽長度2100。萌芽長度與顯微鏡圖像的直接測量值相當契合。現(xiàn)在參考圖21B,描述了平均萌芽長度對初始接種密度的圖2120。也描述了對每個分析時間點24小時2124,48小時2128,72小時2132、以及96小時2136的最佳擬合線。從最佳擬合線與X軸的交叉點可得到最小細胞密度值，即初始接種密度(每平方毫米的細胞數(shù)量)。放大圖顯示了交叉點是24小時的每平方毫米362個細胞，48小時的每平方毫米340個細胞,每平方毫米317個細胞，以及96小時的每平方毫米293個細胞的值。應(yīng)該注意到關(guān)于萌芽長度的測量可能存在誤導因子。微血管的內(nèi)直徑變大，這一點并沒有考慮到目前的分析中。因而，所述萌芽長度值包括直徑的任意變化。現(xiàn)在參考圖22，檢測了含有HUVECs和大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMCs)的復合親代血管。以熒光染料(細胞示蹤綠)標記HUVECs，并按照本發(fā)明的上述方法將該細胞高密度接種，其中增長的萌發(fā)表型是明顯的。生長大約24h之后,HUVECs形成萌發(fā)的親代血管,以生長培養(yǎng)基對該親代血管進行灌注。將RASMCs接種到HUVEC親代血管中，并觀察到該細胞附著在微血管壁上，隨后通過微血管壁遷移到血管周位置。在圖22中，描述了代表性復合IIUVEC和RASMC的萌發(fā)的親代微血管的熒光和明視野圖的疊加圖2200。以暗染色2210觀察親代微血管，而血管周RASMCs顯示清晰2220。RASMCs遷移至圍繞在HUVEC親代微血管的血管周位置，符合已知的它們在血管成熟和穩(wěn)定中的支持角色。血管生成研究的試驗和目標顯著激活HUVEC萌發(fā)能力表型的能力，增加了對灌注液、基質(zhì)內(nèi)促血管生成的或抗血管生成的產(chǎn)品，或來源于正常、病態(tài)(例如癌癥、病毒感染)、或工程化細胞和組織的產(chǎn)品的篩選能力。監(jiān)測微血管網(wǎng)絡(luò)提供了有效的測量,其中增加的萌發(fā)和微血管生長指示促血管生成效應(yīng)，而減少的萌發(fā)和微血管生長指示抗血管生成效應(yīng)。同樣，也可以對內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、外周細胞、和成纖維細胞與前體細胞和干細胞在血管形成和功能的其它方26面的貢獻進行檢測。此外,通過將癌細胞懸浮在基質(zhì)中檢測它們的血管生成潛能。以目前可用的改良的血管形成可更好地檢測復合組織的發(fā)育和生長。萌發(fā)的微血管的大幅增長提供了敏感的試驗體系。通過檢測已知的在同型內(nèi)皮細胞粘附中促進細胞信號的候選基因和它們的基因產(chǎn)品,可以檢驗細胞_細胞介導的信號主要負責激活萌發(fā)表型的假設(shè)。也可測定細胞_基質(zhì)介導的信號、生長因子-細胞介導的信號、和與灌注液流動相關(guān)的機械感應(yīng)介導的信號的貢獻，以確定在血管形成中整體細胞表型和行為。此外，對調(diào)控激活萌發(fā)表型的能力的預期為血管生成模型和研究提供了額外益處。內(nèi)皮特異性標記通過重組DNA方法可對內(nèi)皮細胞的靶基因做基因修飾，以檢測它們對細胞表型的貢獻，細胞表型包括但不限于激活萌發(fā)能力表型。內(nèi)皮細胞中表達的特異性標記基因?qū)Σ捎帽景l(fā)明方法的試驗的操作和測試是有吸引力的靶點。還可檢測內(nèi)皮衍生的細胞系(例如那些來源于大血管和微血管的細胞系)。內(nèi)皮細胞在體內(nèi)顯示出明顯異質(zhì)性(heterogeneity)(Aird2007)。已鑒定了大量在動脈內(nèi)皮或靜脈內(nèi)皮中優(yōu)先表達的基因。已顯示動脈內(nèi)皮細胞會特異性表達幾個基因，包括ephrinB2(Gale，Baluketal.2001)、6樣4(DII4)(Krebs,Xueetal.2000)、活化素(activin)受體樣激酶(Alk1)(Seki,Yunetal.2003)、內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白(EPAS1)(Tian,McKnightetal.1997)、Hevl(Nakagawa,Nakagawaetal.1999)、Hey2(Nakagawa,Nakagawaetal.1999)、神經(jīng)菌毛素(neuropilin)1(NRP1)(Mukouyama，Gerberetal.2005)禾口孕酮(progesterone)誘導的蛻膜蛋白(decidualprotein,Depp)(ShinandAnderson2005)。已顯示靜脈內(nèi)皮細胞特異性表達幾個基因，包括EphB4(Gerety,Wangetal.1999)、神經(jīng)菌毛素2(NRP2)(Yuan,Moyonetal.2002)、C0UP_TFII(You，Linetal.2005)和靜脈瓣尖端的III型0-微管蛋白(KangandLee2006)?？梢垣@得這些已知基因并對其進行基因改造,采用本發(fā)明所列的方法檢測過表達、基因劑量、突變、或功能缺失對血管生成中內(nèi)皮細胞功能的影響?？蓮腘IHGenbank基因序列數(shù)據(jù)庫獲取每個基因的序列數(shù)據(jù)，以利于這些分析。Genbank是所有公眾可獲得的DNA序列的有注釋的集合(Benson，Karsch-Mizrachietal.2008)。內(nèi)皮細胞系對來自特定來源的或已建立的內(nèi)皮衍生細胞系的內(nèi)皮細胞亞群的檢測推動了對血管生成和調(diào)節(jié)血管生長的理解。例如，可采用CPDs和本發(fā)明的方法，選擇由大動脈血管或微動脈血管來源衍生的內(nèi)皮細胞系形成微血管。具有延長壽命的或永生的候選細胞系可額外具有正常核型和非致瘤表型，以及粘附蛋白和凝結(jié)分子的表達模式的特征(Bouis,Hospersetal.2001)。具有延長壽命的由人臍靜脈制成的內(nèi)皮細胞系(HUVEC)以變化程度表征，但又不是永生的，現(xiàn)存的包括ESV233、ESVSF108、ESV2010(INS/EGF)、ESV2010-GF(Hohenwarter，Jakoubeketal.1994)?，F(xiàn)存的且被充分表征的幾種永生內(nèi)皮細胞系包括大血管衍生的細胞系EA.hy926(Edge11,McDonaldetal.1983)、大血管衍生的細胞系EV304(Takahashi,Sawasakietal.1990)和微血管衍生的細胞系HMEC-1(Ades,Candaletal.1992)。此外，也可生成現(xiàn)存的細胞系和新細胞系用于研究。可采用本發(fā)明的方法檢測具有延長壽命的或永生的內(nèi)皮細胞系在形成血管和血27管生成中的功能。使用候選內(nèi)皮細胞系的實踐優(yōu)勢是它們在體外的壽命延長、已報道的穩(wěn)定核型和相關(guān)表型。此外，這種細胞系可被進一步基因修飾或工程化以幵發(fā)它們現(xiàn)有的細胞表型。而且,可從病人中分離內(nèi)皮細胞，采用本發(fā)明的方法檢測它們在個體化用藥方式中對特定藥物如何反應(yīng)。對于癌細胞也是同樣。此外,本發(fā)明的方法中可利用淋巴組織衍生的類似細胞和細胞系。細胞附著和信號通路激活的萌發(fā)表型誘導從親代血管萌發(fā)的微血管的增殖。這種表型可能與細胞對增殖信號的響應(yīng)有關(guān)。在血管生成期間，從較大的含有接觸抑制細胞的血管生長出毛細管萌芽。來自與接觸抑制相關(guān)的附著和信號通路的基因和它們的蛋白產(chǎn)物可候選通過本發(fā)明的方法進行檢測，以探索血管形成和血管生成。以HUVECs觀察的萌發(fā)能力的激活取決于可能來自細胞-細胞接觸的接種密度。細胞_基質(zhì)接觸以及細胞_生長因子接觸,甚至接種和灌注液流動的機械信號的貢獻也可能參與激活萌發(fā)能力。所有這些刺激源參與信號，并可被整合以介導整體細胞表型和行為。在內(nèi)皮細胞之間的附著連接對細胞生長的接觸抑制和對循環(huán)溶質(zhì)和白細胞的細胞旁路(paracellular)滲透性發(fā)揮重要作用。緊密連接還參與細胞附著并負責調(diào)控屏障功能和極性(WheelockandJohnson2003；BazzoniandDejana2004)。此外，在內(nèi)皮細胞間連接中發(fā)現(xiàn)的其它附著蛋白(例如血小板內(nèi)皮細胞附著分子，PECAM-1)參與細胞附著和細胞信號。內(nèi)皮細胞形成獨特的細胞間附著連接，該附著連接含有內(nèi)皮特異性鈣粘蛋白(VE-鈣粘蛋白，VE-cadherin)。內(nèi)皮細胞也表達N-鈣粘蛋白、T-鈣粘蛋白、稱為VE-鈣粘蛋白_2的相關(guān)蛋白。在內(nèi)皮細胞中表達的VE-鈣粘蛋白和其它鈣粘蛋白通過與細胞骨架蛋白和信號分子的復雜網(wǎng)絡(luò)的作用在細胞內(nèi)傳遞信息。VE鈣粘蛋白與f3-連環(huán)蛋白(運-catenin)、斑珠蛋白(plakoglobin)、和pi20連環(huán)蛋白形成復合物，并在結(jié)構(gòu)上可能接觸到類似于附著連接的激動蛋白細胞骨架。內(nèi)皮附著連接的形成、維持和解離是血管形成和功能的重要調(diào)控點。與內(nèi)皮附著連接相關(guān)的信號通路包括wnt通路、RhoGTP酶和通過受體酪氨酸激酶的信號，它們可候選用于進一步研究萌發(fā)能力表型的激活。除了附著連接的組分VE-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、T-鈣粘蛋白和VE-鈣粘蛋白-2,以及VE-鈣粘蛋白和13-連環(huán)蛋白、斑珠蛋白、和P120連環(huán)蛋白的相互作用蛋白，以及PECAM-1以外，來自上述這些信號通路的基因和蛋白產(chǎn)物是用于本發(fā)明微血管網(wǎng)絡(luò)試驗中操作和檢測的候選物。而且,采用本發(fā)明的微血管試驗和方法可解釋未知的下游事件。緊密連接的組分也是已知的,包括跨膜附著蛋白、細胞內(nèi)分子和信號通路。密封蛋白(occludin)、封閉蛋白(claudin)(例如claudin1和2，和其它claudin家族成員)、連接附著分子(例如JAMA、JAMB、JAMC)參與了緊密連接的附著功能。緊密連接的細胞內(nèi)組分包括膜結(jié)合鳥苷酸激酶家族成員(MAGUK),包括Z0-1、和相關(guān)Z0-2、和ZCH3，還有非MAGUK蛋白AF-6/afadin、Par-3/ASIP、和MUPP-1(BazzoniandDejana2004)。對緊密連接組分的操作可產(chǎn)生有關(guān)激活萌發(fā)能力的重要信息，并有助于確定這些血管的屏障功能。此外，采用本發(fā)明的微血管試驗和方法可解釋未知的下游事件。無需過度的努力即可分離附著連接和緊密連接或相關(guān)信號組分的每個已知基因，并對它們進行基因工程化以檢測過表達、基因劑量、突變、或功能缺失在采用本發(fā)明所列方法的血管生成中對內(nèi)皮細胞功能的影響?？蓮腘IIIGenbank基因序列數(shù)據(jù)庫中獲取每個基因的序列數(shù)據(jù)，以利于這些分析。在血管生成和血管發(fā)生中內(nèi)皮細胞的形態(tài)發(fā)生內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生包括由現(xiàn)有血管形成血管的血管生成(angiogenesis)，以及由組織中或來自循環(huán)傳遞的內(nèi)皮細胞(EC)或EC前體和祖細胞形成血管的血管發(fā)生(vasculogenesis)。內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生也包括基于信號輸入和調(diào)節(jié)的微血管退化的情況。激活的萌發(fā)表型誘導由親代血管萌發(fā)的微血管的增殖。這種表型也可能與來自內(nèi)皮細胞之間接觸以及內(nèi)皮細胞和細胞外基質(zhì)(ECM)接觸的內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生有關(guān)。已顯示在新形成血管中內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生受基質(zhì)-整聯(lián)蛋白-細胞骨架(MIC)信號通路的影響(ReviewDavisBaylessetal.2002)。這個MIC通路由通過細胞間連接接觸的細胞之間的相互作用和細胞與細胞外基質(zhì)成分之間的相互作用啟動。整聯(lián)蛋白(例如a2毋1、a11、av|33、a5^1、a6毋1)的參與和細胞外基質(zhì)的相互作用，細胞骨架元件(例如肌動蛋白、微管、和中間絲細胞骨架)和下游信號和調(diào)節(jié)分子(例如RhoGTP酶、RhoA、Racl、Cdc42、PAK-1、側(cè)向抑制因子、ECM降解蛋白酶)的參與全都有助于內(nèi)皮細胞在形態(tài)發(fā)生期間形成管狀結(jié)構(gòu)、萌發(fā)和分枝成新的微血管的能力。降解ECM的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMPs)被假定參與內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生(Hiraoka,Allenetal.1998)；(Hotary,Allenetal.2000)。用于研究和操作的候選物是MMP-l、MMP-2、MMP-9,以及其它等同的MT-MMPs(Davis,Baylesset.al.2002)。此外，已顯示當內(nèi)皮細胞懸浮在膠原中時，阻遏MT-MMPs的抑制因子(例如蛋白TIMP-2，和化學的MMP抑制子GM6001)會阻遏內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生(未公開數(shù)據(jù)，DaVis，Baylessetal.2002)。TIMP-2抑制內(nèi)皮細胞增殖，它是天然金屬蛋白酶抑制因子的TIMP家族成員?；瘜W藥品GM6001是膠原酶的抑制劑并可由Millipore提供。側(cè)向抑制是細胞亞類產(chǎn)生抑制鄰近細胞的因子的現(xiàn)象，該現(xiàn)象會導致選擇性分化。這種抑制因子在內(nèi)皮萌發(fā)密度中發(fā)揮作用(Davis,Baylessetal.2002)。例如，調(diào)節(jié)側(cè)向抑制的分子是Notch配體Jagged和Delta(Lindsell，Boulteretal.1996；Zimrin,Pepperetal.1996；Bell,Mavilaetal.2001)。此外，已顯示在內(nèi)皮細胞中存在Notch1禾口Notch4受體(Zimrin,Pepperetal.1996；Uyttendaele,Clossonetal.2000；Lindner,Boothetal.2001)。這些因子是用于研究和操作的候選物，以確定它們對內(nèi)皮形態(tài)發(fā)生的整體作用。在本發(fā)明方法中，操作MIC組分和檢測來自MIC和下游通路的單個產(chǎn)物是可行的。已知許多與MIC信號和內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生相關(guān)的基因和基因產(chǎn)物，且可在微血管試驗中評估它們對萌發(fā)能力和血管生成的貢獻。無需過度的努力即可分離已知的MIC通路基因或相關(guān)信號和調(diào)節(jié)組分,并對它們進行基因工程化，以檢測過表達、基因劑量、突變、或功能缺失在采用本發(fā)明所列方法的血管生成中對內(nèi)皮細胞功能的影響?？蓮腘IHGenbank基因序列數(shù)據(jù)庫獲取每個基因的序列數(shù)據(jù)，以利于這些分析。影響血管生成的產(chǎn)物的篩選現(xiàn)在參考圖23，示意性地描述了篩選影響親代血管、微血管萌發(fā)和微血管網(wǎng)絡(luò)形成的細胞(C)、產(chǎn)物(P)和組織(T)的試驗。利用CPD(例如CPD1350、CPD900、或等同物)和高密度接種以激活萌發(fā)能力表型的方法,可檢測微血管萌發(fā)的響應(yīng)以及微血管網(wǎng)絡(luò)的形成。微血管網(wǎng)絡(luò)可用于通過監(jiān)測微血管網(wǎng)絡(luò)的形成而篩選基質(zhì)或灌注液培養(yǎng)基中的促血管生成和抗血管生成因子，其中該網(wǎng)絡(luò)生長的增長指示促血管生成因子，該網(wǎng)絡(luò)生長的減慢指示抗血管生成因子。檢測了分布在整個基質(zhì)中或局部集中的候選物,包括細胞(C)、產(chǎn)物(P)和組織(T)?？蛇x地,將細胞(C)和產(chǎn)物(P)加入到灌注液培養(yǎng)基中。在許多實施方式中,可檢測從不同的要檢測的候選物中釋放的生物活性產(chǎn)物。生物活性是指候選物以某些可辨別的方式影響萌發(fā)微血管的生長，例如通過提供在生長上的可測量的差異。細胞可以是內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、外周細胞、成纖維細胞、祖細胞、干細胞、肌細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、人細胞、動物細胞、植物細胞、真核細胞、基因工程化細胞、基因修飾的細胞、病態(tài)細胞、病毒感染細胞、和癌細胞。產(chǎn)物可以包括生長因子(例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、佛波酯(例如12-肉豆蔻酸-13-佛波乙酯(PMA))、血小板衍生生長因子(PDGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、肝素結(jié)合生長因子(HB-EGF)、白介素-8(IL-8)、長R3胰島素樣生長因子(R3IGF_1)、胰島素樣生長因子(例如IGF-1)、人上皮生長因子(hEGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、肝素結(jié)合EGF樣生長因子(IIB-EGF)、細胞因子、血管生成素、胎盤生長因子、多種趨化因子(例如SDF-1a)、TGF-fK可溶性有絲分裂原、細胞附著蛋白(例如纖連蛋白、玻連蛋白、纖維蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD)蛋白、RGD-肽、明膠、膠原、和不同亞型膠原)、合成肽、和等同生物活性化合物。組織可以是健康的、癌癥的、病毒感染的、或基因修飾或工程化的。通過導管2308可以將至少一種細胞類型2304高密度接種2313到在CPD2300的基質(zhì)2312內(nèi)的通道2316中。至少一種細胞類型可以是HUVECs,或細胞類型的組合(例如SMC、外周細胞、祖細胞、干細胞)，它們中的一些能夠通過細胞-細胞、細胞-基質(zhì)、細胞-生長因子和灌注液流動的物理接觸來激活由親代血管2328萌發(fā)微血管的能力?？蛇x地，所述細胞2336可以是基因修飾的或工程化的以釋放生物活性產(chǎn)物。培育經(jīng)接種的通道進一步使親代血管發(fā)育成匯合的細胞層2331。第一灌注液培養(yǎng)基2320可去除培育大約45分鐘之后未附著到通道基質(zhì)壁2316的細胞2304。依據(jù)實驗條件，可以大大縮短或省略培育時間。第一灌注液培養(yǎng)基2320或第二灌注液培養(yǎng)基2332也可以使親代血管2328的生長。在不同實施方式中，所述灌注液培養(yǎng)基可以是相同的組合物或按需要的不同配方組合物。細胞(C)、產(chǎn)物(P)、或組織(T)2311可被局部集中或分散地接種到基質(zhì)2312的不同位置上。可選地，可以將細胞(C)或產(chǎn)物(P)2314加入到灌注液培養(yǎng)基2320、2332中。產(chǎn)物(P)(例如促血管生成和抗血管生成生物活性化合物)也可由親代血管2328的細胞所分泌?，F(xiàn)在共同參考圖24A和圖24B,示意性地描述了在高密度接種細胞之后,微血管萌發(fā)和網(wǎng)絡(luò)形成對添加候選細胞(C)、候選產(chǎn)物(P)和候選組織(T)的響應(yīng)。為圖示目的僅描述了單個親代血管的一部分。在一系列CPDs中，在不同實施方式中分析了單個、倆個或復雜陣列的親代微血管。在圖24A和圖24B中，示意性地描述了兩個具有不同量的候選物的CPDs,所述候選物包括局部集中的候選細胞(C)、候選產(chǎn)物(P)或候選組織(T)。在圖24A中，顯示CPD2400包括具有較高量的候選細胞(0、候選產(chǎn)物(P)或候選組織(T)的基質(zhì)2404。類似地，可在灌注液2416中加入較高量的細胞(C)或產(chǎn)物(P)2412。以灌注液培育之后,通過測量2428新萌芽2420、2424的長度可評估加入候選細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)的作用。局部集中的候選物的促血管生成作用會導致靠近被檢測候選物的萌發(fā)增加并更茂盛2420，遠離候選物的萌芽會表現(xiàn)出生長減慢2424。預期在灌注液中加入更高量的細胞(C)或產(chǎn)物(P)2412會使親代血管向所有側(cè)面的萌芽的生長增加(未畫出)。在圖24B中，CPD2430含有局部集中的較低量的候選細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)，或類似地具有加入到灌注液2416中的較低量的候選細胞(C)或產(chǎn)物(P)2438。相對于具有較高量2400的CPD，靠近被檢測候選物的萌芽2442預期會生長較慢2450。在一些情況中，靠近2442和遠離2446候選物的萌芽的大小類似。通過檢測候選物量的寬范圍，可以根據(jù)新萌芽相對于對照的生長增長的程度來確定促血管生成作用?，F(xiàn)在共同參考圖25A和25B，示意性地描述了兩個CPDs具有不同量的局部集中的候選細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)候選物。在圖25A中，描述了CPD2500包括具有較高量的候選細胞(0、產(chǎn)物(P)或組織(T)2508的基質(zhì)2504。類似地,可在灌注液2516中加入較高量的細胞(C)或產(chǎn)物(P)2512。以灌注液培育之后，通過測量2528新萌芽2520、2524的長度可評估加入候選細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)的作用。局部集中的候選物的抗血管生成的作用會導致靠近被檢測候選物的萌發(fā)減少或甚至不萌發(fā)2520,而遠離候選物的萌芽會表現(xiàn)出一些或甚至正常的生長2524。預期在灌注液中加入較高量的細胞(C)或產(chǎn)物(P)2512會使親代血管向所有側(cè)面的萌芽的生長減慢(未畫出)。在圖25B中，CPD2530含有局部集中2534的較低量的候選細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)，或類似地具有加入到灌注液2516中的較低量的細胞(C)或產(chǎn)物(P)2538。相對于具有較高量2500的CPD，靠近被檢測候選物的萌芽2542預期會表現(xiàn)出更正常的生長2450。在一些情況中，靠近2542和遠離2546候選物的萌芽的大小類似，這表明候選物的抗血管生成作用較小或無作用。通過檢測候選物量的寬范圍，可以根據(jù)新萌芽相對于對照的生長抑制程度來確定抗血管生成作用。在可選實施方式中，可在單個CPD中檢測局部集中候選物量的增加。此外，在微血管形成試驗以不同實施方式檢測多種組合物。例如,在示意圖中僅描述--個親代血管,但不同實施方式可具有兩個或多個親代血管，所述親代血管在基質(zhì)不同位置上具有局部集中或分散的細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)。在可選的實施方式中，也可在微血管萌發(fā)之前和之后的不同時間加入細胞(C)、產(chǎn)物(P)或組織(T)。此外,可在一個或多個親代血管之間形成復雜微血管網(wǎng)絡(luò)之前和之后加入細胞(0、產(chǎn)物(P)或組織(T)。在另外實施方式中,可在一個通道中接種內(nèi)皮細胞以形成親代血管，而在第二通道中接種用于組織模型或組織工程化的癌細胞或?qū)嵸|(zhì)細胞或基質(zhì)細胞。而且，應(yīng)當理解廣泛混合的通道可接種多種要檢測的細胞類型(例如ECs-動脈、ECs-靜脈、淋巴ECs、來自肝或其它組織的實質(zhì)細胞)。血管生成試驗現(xiàn)在共同參考圖26A和圖26B，描述了模擬細胞誘導的血管生成的實施方式。在圖26A中，描述了來自CPD2600的兩個膠原通道的明視圖，一個通道接種了已形成萌發(fā)親代血管2604的HUVECs,而第二個通道接種了BT474細胞系的乳腺癌細胞2608。HUVEC親代血管顯示了朝乳腺癌細胞生長的萌芽2610、2620、2630、2640，這代表了可能從癌細胞釋放的生物活性產(chǎn)物具有促血管生成的潛能。在圖26B中，描述了同一微血管的相應(yīng)熒光顯微鏡圖像。在接種之前,HUVECs以染料2650染色,而乳腺癌細胞是具有不同細胞染料2660的染色細胞(分別是細胞示蹤綠CMFDA和細胞示蹤橙CRMA,顏色未畫出)。因而，由HUVEC親代血管生長的萌芽2610,2620,2630和2640是內(nèi)皮來源的，可檢測促血管生成和抗血管生成效應(yīng)。本發(fā)明在這里所描述的相當多的細節(jié)是為了遵守專利法，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明的新原理而提供信息，并構(gòu)建和使用所需要的這些示例性的和專門的組分。但是，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明可以通過不同的專用設(shè)備和裝置以及構(gòu)建法則進行實施，在不偏離本發(fā)明的實質(zhì)精神和范圍的情況下，可以進行包括具體設(shè)備和操作程序在內(nèi)的多種改變。說明書中所引用的所有參考文獻的全文在此一并引入作為參考。如果發(fā)生其它方面的不可調(diào)和的沖突，以本說明書為準。參考文獻Ades,E.W.,F.J.Candal,etal.(1992).“IIMEC-1establishmentofanimmortalizedhumanmicrovascularendothelialcellline.".[InvestDermatol99(6):683-90.Aird,ff.C.(2007)."PhenotypicheterogeneityoftheendotheliumII.Representativevascularbeds.“CireRes100(2)174-90.Akhtar,N.,E.B.Dickerson,eta!.(2002).“Thesponge/Matrigelangiogenesisassay."AnRiogenesis5(1-2):7580.Algire,G.H.,H.ff.Chalkley,etal.(1945).“Vascularreactionsofnormalandmalignanttissuesinvivo.I.Vascularreactionsofmicetowoundsandtonormalandneoplastictransplants.".1Nat1CancerInst6:73-85.Andrade,S.P.,R.D.Machado,etal.(1997)."Sponge-inducedangiogenesisinmiceandthepharmacologicalreactivityoftheneovasculaturequantitatedbyafluorimetricmethod."MlcrovascRes54(3)253-61.Arthur,W.T.,R.B.Vernon,etal.(1998).“Growthfactorsreversetheimpairedsproutingofmicrovesselsfromagedmice."MicrovascRes55(3)260-70.Ausprunk,D.H.,D.R.Knighton,etal.(1974).“Differentiationofvascularendotheliuminthechickchorioallantoisastructuralandautoradiographicstudy.“DevBiol38(2)23748.Bazzoni,G.andE.Dejana(2004)."Endothelialcell-to-celljunctionsmolecularorganizationandroleinvascularhomeostasis,“PhysiolRev84(3)869-901.Bell,S.E.,A.Mavila,etal.(2001).〃Differentialgeneexpressionduringcapillarymorphogenesisin3Dcollagenmatrices:regulatedexpressionofgenesinvolvedinbasementmembranematrixassembly,cellcycleprogression,celluladifferentiationandG-proteinsignaling.“JCellSci114(Pt15):2755_73.Benson,D.A.，I.Karsch-Mizrachi，etal_(2008).“GenBank.“NuclAcidsRes.36(suppl1)D25-30.Bouis，D.，G.A.Hospers，etal.(2001)_“Endotheliuminvitro:areviewofhumanvascularendothelialcelllinesforbloodvessel-relatedresearch.“AnRioRenesis4(2):91-102.Clark，E.R,andE.L.Clark(1939).〃Microscopicobservationsonthegrowthofbloodcapillariesinthelivingmammal.“Am,TAnat64251-301.Davis,G.E.K.J.Bayless,etal.(2002).“Molecularbasisofendothelialeel1morphogenesisinthree-dimensionalextracellularmatrices.“AnatRec268(3):252-75.Davis,G.E.andC.W.Camarillo(1996).“Analpha2beta1integrin-dependentpinocyticmechanisminvolvingintracellularvacuoleformationandcoalescenceregulatescapillarylumenandtubeformationinthree-dimensionalcollagenmatrix,”ExpCellRes224(1):39-51.Edgell，C.J.，C.C.McDonald，etal.(1983)“PermanentcelllineexpressinghumanfactorVlll-relatedantigenestablishedbyhybridization.〃ProcNatlAcadSciUSA80(12):3734-7.Elsdale，T.andJ.Bard(1972)，〃Collagensubstrataforstudiesoncellbehavior.〃ICel:l_Biol54(3)626-37.Feder,J.，J.C.Marasa，etal.(1983)〃Theformationofcapillary-liketubesbycalfaorticendothelialcellsgrowninvitro.“JCellPhysiol116(1)1-6.FishmanJ.A.，G.B.Ryan，etal.(1975).“Endothelialregenerationintheratcarotidarteryandthesignificanceofendothelialdenudationinthepathogenesisofmyointimalthickening.“LabInvest32(3):339_51.Folkman,J.andC.Haudenschild(1980),“Angiogenesisinvitro.“Nature288(5791):551-6.Folkman，J.，C.C.Haudenschild,etal.(1979).“Long-termcultureofcapillaryendothelialcells.“ProcNatlAcadSciUSA76(10)5217-21.Frerich，B.，N.Lindemann，etal.(2001).“Invitromodelofavascularstromafortheengineeringofvascularizedtissues.〃IntJOralMaxi1lofacSurR30(5)414-20.Frerich,B.，K.Zuckmantel,etal.(2008)“Maturationofcapillary-likestructuresinatube-likeconstructinperfusionandrotationculture.“IntJOralMaxillofacSurR37(5):459-66.Gale，N.W，P.Baluk，etal.(2001).“Ephrin-B2selectivelymarksarterialvesselsandneovascularizationsitesintheadult,withexpressioninbothendothelialandsmooth—musclecells.“DevBiol230(2):151—60.Gerety，S.S.，H.U.Wang，etal.(1999)，“SymmetricalmutantphenotypesofthereceptorEphB4anditsspecifictransmembrane1igandephrin_B2incardiovasculardevelopment.”MolCell4⑶403-14,Gimbrone,M.A.Jr.(1976)_Cultureofvascularendothelium.ProgHemostThromb.3:1_28.Gimbrone,M.A.，Jr.，R.S.Cotran,etal.(1974)“Humanvascularendothelialcellsinculture.GrowthandDNAsynthesis."JCellBiol60(3)673-84.Gimbrone,M.A.，Jr.，R.S.Cotran,etal.(1974)〃Tumorgrowthandneovascularization:anexperimentalmodelusingtherabbitcornea."JNatlCancerInst52(2):413-27.Greenblatt，M.andP.Shubi(1968).〃Tumorangiogenesis:transfiIterdiffusionstudiesinthehamsterbythetransparentchambertechnique.〃JNatlCancerInst41(1):111-24.Hiraoka，N,，E.Allen,etal.(1998)“Matrixmetalloproteinasesregulateneovascularizationbyactingasperieellularfibrinolysins."Ce1195(3)；365-77.Hohenwarter,0.，A.Jakoubek,etal.(1994)，"ExpressionofSV40tumourantigensenableshumanendothelialcellstogrowindependentlyfromfoetalcalfserumandexogenousgrowthfactors."JBiotechno!34(2)205-11.Hotarv,K.，E.Allen,etal.(2000).“Regulationofcellinvasionandmorphogenesisinathree-dimensionaltypeIcollagenmatrixbymembrane-typematrixmetalloproteinasesL2,and3.”JCellBiol149(6)1309-23.HoyingJ.B.C.A.Boswelhetal.(1996).“Angiogenicpotentialofmicrovesselfragmentsestablishedinthree-dimensionalcollagengels.〃InVitroCellDevBiolAnim32(7):409_19.Jaffe，E,A.，R,L.Nachman,etal.(1973)，〃CultureofhumanendothelialeelIsderivedfromumbilicalveins.Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.“JClinInvest52(11):2745_56.Jozaki，K.，P.T.Marucha，etal.(1990).“Aninvitromodelofcellmigration:evalu&itionofvascularendothelialcellmigration."AnalBlochem.190(1):39-47.Kang，J.andI.Lee(2006)“TuJI(classIIIbeta-tubulin)asphenotypicmarkeroflymphaticandvenousvalves.“CardiovascPathol15(4):218_21.Koike，T.，R.B.Vernon,etal.(2003).“InhibitedangiogenesisinagingaroleforTIMP~2.丨’.]GerontolABiolSciMedSci58(9):B798~805.Krebs，L.T.，Y.Xue，etal.(2000).“Notchsignalingisessentialforvascularmorphogenesisinmice."GenesDev14(11)1343-52.Kubota，Y.,H.K,Kleinman，etal.(1988).”Roleoflamininandbasementmembraneinthemorphologicaldifferentiationofhumanendothelialcellsintocapillary-likestructures.“JCellBiol107(4)1589-98.Kuzuya，M.andJ.L.Kinsella(1994).〃Inductionofendothelialcelldifferentiationinvitrobyfibroblast-derivedsolublefactors."ExpCellRes215(2):310-8.Lindner，V.，C.Booth，etal.(2001)."MembersoftheJagged/Notchgenefamiliesareexpressedininjuredarteriesandregulatecellphenotypeviaalterationsineel1matrixandeel1-eel1interaction.〃Am,TPathol159(3)；Lindsell,C.E.,J.Boulter,etal.(1996)〃ExpressionpatternsofJagged.Deltal,NotchLNotch2,andNotch3genesidentifyligand—receptorpairsthatmayfunctioninneuraldevelopment.“MolCellNeurosci8(1)14-27.Maciag，T.，J.Kadish,etal.(1982)“Organizationalbehaviorofhumanumbilicalveinendothelialcells.“JCellBiol94(3):511_20.Maciri,J.A.(1982).“Endothelialcell-matrixinteractionsinhemostasis.“ProgHemostThromb6:1-24.Madri，J.A.andB.M.Pratt(1986).“Endothelialcell-matrixinteractionsinvitromodelsofangiogenesis.“.1HistochemCytochem34(1):85_91.Madri,J.A.,B.M.Pr&itt,ettil.(1988).“Phenotypicmodulationofendothelialcel.1sbytransforminggrowthfactor—betadependsuponthecompositionandorganizationoftheextracellularmatrix.“JCellBiol106(4)1375-84.M&idri,J.A.andK.S.Stenn(1982).Aorticendothelialcellmigration.I.Matrixrequirementsandcomposition.〃Am.1Pathol106(2)180-6.Manoussaki,D.，S.R.Lubkin,etal.(1996)“Amechanicalmodelfortheformationofvascularnetworksinvitro.〃ActaBiotheor44(34):271_82.Marx,M.,R.A,Perlmutter，etal.(1994).“Modulationofplatelet-derivedgrowthfactorreceptorexpressioninmicrovascularendothelialcellsduringinvitroangiogenesis.“JClinInvest93(1)131-9.Merwin,J.R.，,J_M.Anderson,etal.(1990)“TransforminggrowthfactorbetaImodulatesextracellularmatrixorganizationandcell-celljunctionalcomp1exformationduringinvitroangiogenesis.〃.]CellPhysiol142(1)117~28.Montesano,R.andL.Orci(1985)〃Tumor-promotingphorbolestersinduceangiogenesisinvitro.〃Cell42(2):469_77.Montesano，R.，L.Orci,etal.(1983).〃Invitrorapidorganizationofendothe1ialeel1sintocapi11ary—1ikenetworksispromotedbycollagenmatrices.“JCellBiol97(5Pt1)1648-52.Montesano,R.，M.S.Pepper,etal.(1993)“ParacrineinductionofangiogenesisinvitrobySwiss3T3fibroblasts.“JCellScl105(Pt4):1013—24.Mori，M.，Y.Sadahira，etal.(1988).“Capillarygrowthfromreversedrataorticsegmentsculturedincollagengel.“ActaPatholJpn38(12)1503-12.Mukouyama，Y.S,,II.P.Gerber，etal.(2005).“Peripheralnerve—derivedVEGFpromotesarterialdifferentiationvianeuropi1in1—mediatedpositivefeedback.“Development132(5)941-52.Nakagawa,0.，M.Nakagawa,etal.(1999).“HRT1，HRT2,andHRT3anewsubclassofbHLHtranscriptionfactorsmarkingspecificcardiac，somitic,andpharyngealarchsegments.〃DevBiol216(1)72-84.Nehls，V.andD.Drenckhahn(1995).“Anovel，microcarrier-basedinvitroassayforrapidandreliablequantificationofthree-dimensionalcellmigrationandangiogenesis.“MicrovascRes50(3):311-22.Nehls，V.andR.Herrmann(1996)〃Theconfigurationoffibrinclotsdeterminescapillarymorphogenesisandendothelialcellmigration.“MicrovascRes51(3):347-64.Nicosia，R.F.，E,Bonarmo，etal,(1994).“Modulationofangiogenesisinvitroby1aminin-entactincomplex.〃DevBiol164(1):197-206.Nicosia，R.F.，E.Bonanno，etal.(1992).“Large-vesselendotheliumswitchestoamicrovascularphenotypeduringangiogenesisincollagengelcultureofrataorta,〃Atherosclerosis95(2-3):191-9.Nicosia,R.F.S.V.Nicosia,etal.(1994).〃Vascularendothelialgrowthfactor,platelet-derivedgrowthfactor，andinsulin-likegrowthfactor-1promoterataorticangiogenesisinvitro.“AmJPathol145(5)1023-9.Nicosia,R.F.andA.Ottinetti(1990).“Modulationofmicrovasculargrowthandmorphogenesisbyreconstitutedbasementmembranegelinthree-dimensionalculturesofrataorta:acomparativestudyofangiogenesisinmatrigelcollagen,fibrin,andplasmaclot.“InVitroCellDevBiol26(2)119-28.Nicosia,R.F.，R.Tchao，etal.(1982).“Histotypicangiogenesisinvitro1ightmicroscopicultrastructuralandradioautographicstudies.〃InVitro18(6):538-49.Nicosia,R.F..，R.Tchao,etal.(1983)"Angiogenesis—dependenttumorspreadinreinforcedfibrinclotculture.〃CancerRes43(5):2159-66,Nicosia，R.F.andG.P.Tuszynski(1994).〃Matrix-boundthrorabosponclinpromotesangiogenesisinvitro.“JCellBiol124(1-2)183-93.Passaniti,A..，R.M.Taylor,etal.(1992)“Asimple,quantitativemethodforassessingangiogenesisandantiangiogenicagentsusingreconstitutedbasementmembraneheparin，andfibroblastgrowthfactor.“LabInvest67(4)519-28.Pepper,M.S.，R.Montesano,etal.(1991)"Chondrocytesinhibitendothelialsproutformationinvitro,evidenceforinvolvementofatransforminggrowthfactor-beta.“JCellPhysiol146(1)170-9.Rosen,E.M.，L.Meromsky，etal.(1990)“Quantitationofcytokine—stimulatedmigrationofendotheliumandepitheliumbyanewassayusingmicrocarrierbeads.〃ExpCellRes186(1)；22-3LSage,E.H.andR.B.Vernon(1994)“Regulationofangiogenesisbyextracellularmatrix:thegrowthandtheglue.“JHypertensSuppl12(10)S145-52.Seki，T.，J.Yim，etal.(2003)“Arterialendothelium-specificactivinreceptpr-likekinase1expressionsuggestsitsroleinarterializationandvascularremodeling.〃CircRes93(7):682_9_Shin,D.andD.J.Anderson(2005).〃Isolationofarterial-specificgenesbysubtractivehybridizationrevealsmolecularheterogeneityamongarterialendothelialcells.“DevDyn233(4)1589-604.Takahashi,K.，Y_Sawasaki，etal.(1990)〃Spontaneoustransformationandimmortalizationofhumanendothelialcells.“InVitroCellDevBiol26(3Ptl)265-74.Tian，H.，S.L.McKnight，etal.(1997)."EndothelialPASdomainproteinI(EPASI)，atranscriptionfactorselectivelyexpressedinendothelialcells.“GenesDev11(1):72-82.Torres-Vdzquez，J.，M.Kamei，etal.(2003)_“Moleculardistinctionbetweenarteriesandveins.“CellandTissueResearch314(1):43_59.Uyttendaele,H.，V.Closson,etal.(2000).“Notch4andJagged-Iinducemicrovesseldifferentiationofratbrainendothelialcells.“MicrovascRes60(2):91-103.Vernon，R.B.，J.C.Angello，etal.(1992).“Reorganizationofbasementmembranematricesbycellulartractionpromotestheformationofcellularnetworksinvitro.“LabInvest66(5)536-47.Vernon，R.B.andM.I).Gooden(2002)〃Newtechnologiesinvitroforanalysisofcellmovementonorwithincollagengels.”MatrixBiol21(8)661-9.Vernon,R.B.，S,L.Lara,etal.(1995).“OrganizedtypeIcollageninfluencesendothelialpatternsduring〃spontaneousangiogenesisinvitro"planarculturesasmodelsofvasculardevelopment.”InVitroCellDevBiolAnim31(2):120-31.Vernon，R,B.andE.ILSage(1999)”Anovel，quantitativemodelforstudyofendothelialcel.1migrationandsproutformationwithinthree-dimensionalcollagenmatrices.“MicrovascRes57(2)118-33.Villaschi,S.andR.F.Nicosia(1993)“Angiogenicroleofendogenousbasicfibroblastgrowthfactorreleasedbyrataortaafterinjury.〃AmJPathol143(1)181-90.ffheelock,M.J.andK.R.Johnson(2003).“CADHERINSASMODULATORSOFCELLULARPHENOTYPE."AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology19(1)207-235.You,L.R.，F(xiàn).J.Lin,etal.(2005)"SuppressionofNotchsignallingbytheC0UP-TFIItranscriptionfactorregulatesveinidentity."Nature435(7038)98-104.Yuan,L.,1).Moyon,etal.(2002)."Abnormallymphaticvesseldevelopmentinneuropilin2mutantmice."Development129(20):4797_806.Zimrin,A.B.，M.S.Pepper,etal.(1996)."Anantisenseoligonucleotidetothenotchligandjaggedenhancesfibroblastgrowthfactor—inducedangiogenesisinvitro.“TBiolChem271(51):32499-502.權(quán)利要求一種在體外形成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的方法，其中，該方法包括以下步驟將至少一種能夠萌發(fā)的細胞類型的細胞接種到基質(zhì)內(nèi)的至少一個通道由(1300)；激活至少一種細胞類型由親代血管萌發(fā)微血管的能力，其中，所述萌發(fā)的能力是由接種密度觸發(fā)的(1304)；使用至少一種培養(yǎng)基灌注所述至少一個通道，使所述至少一種細胞類型形成至少一個親代血管(1324)；培育并灌注所述至少一個親代血管以維持活力并從所述至少一個親代血管向周圍基質(zhì)萌發(fā)微血管(1328)；使萌發(fā)的微血管生長，直至所述微血管形成了網(wǎng)絡(luò)(1332)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述至少一種細胞類型的萌發(fā)能力來自由細胞之間的接觸(1308)所激活的細胞信號。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中,所述至少一種細胞類型的萌發(fā)能力來自由細胞之間的接觸(1308)和由細胞與基質(zhì)之間的接觸(1312)所激活的細胞信號。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述至少--種細胞類型的萌發(fā)能力來自選自由細胞_細胞介導的接觸(1308)、細胞-基質(zhì)介導的接觸(1312)、以及生長因子-細胞介導的接觸(1316)所組成的組中的細胞信號。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，大部分細胞處于相互的細胞與細胞之間的接觸(1308)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，大部分細胞幾乎處于相互的細胞與細胞之間的接觸(1308)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細胞(1)是以每平方毫米的通道至少250個細胞的方式存在。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細胞(1)是以每平方毫米的通道250-2000個細胞的方式存在。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，由所述親代血管萌發(fā)的微血管吻合以形成微血管網(wǎng)絡(luò)(1332)。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述親代血管支持植入在所述基質(zhì)(2312)內(nèi)的組織(2311)的至少一種細胞類型的生長。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中,所述親代血管是三維的親代血管陣列。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述至少一種細胞類型選自由內(nèi)皮細胞(1)、平滑肌細胞、成纖維細胞、外周細胞、祖細胞、千細胞、實質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞、肌細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、人細胞、動物細胞、真核細胞、基因工程化細胞、基因修飾的細胞、病態(tài)細胞、病毒感染的細胞和癌細胞所組成的組中。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中,所述內(nèi)皮細胞(1)來自內(nèi)皮細胞系。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述內(nèi)皮細胞系選自由微血管內(nèi)皮細胞系、大血管內(nèi)皮細胞系、以及個體衍生的內(nèi)皮細胞系所組成的組中。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中，所述細胞釋放生物活性產(chǎn)物進入所述灌注液培養(yǎng)基(2332)。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述細胞釋放生物活性產(chǎn)物進入所述基質(zhì)(2312)。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述細胞釋放基因工程化生物活性產(chǎn)物進入所述灌注液培養(yǎng)基(2332)。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，監(jiān)測所述微血管網(wǎng)絡(luò)(2428)以用于篩選所述基質(zhì)(2404)中的促血管生成因子和抗血管生成因子,其中，所述網(wǎng)絡(luò)生長的增加用以指示促血管生成因子，所述網(wǎng)絡(luò)生長的減慢用以指示抗血管生成因子。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，監(jiān)測所述微血管網(wǎng)絡(luò)(2428)以用于篩選所述灌注液培養(yǎng)基(2416)中的促血管生成因子和抗血管生成因子,其中，所述網(wǎng)絡(luò)生長的增加用以指示促血管生成因子，所述網(wǎng)絡(luò)生長的減慢用以指示抗血管生成因子。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種細胞類型包括動脈內(nèi)皮組織的含有基因工程化分子標記的內(nèi)皮細胞(1)。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述至少一種細胞類型包括淋巴內(nèi)皮組織的含有基因工程化分子標記的內(nèi)皮細胞(1)。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種細胞類型包括靜脈內(nèi)皮組織的含有基因工程化分子標記的內(nèi)皮細胞。23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述至少一個通道的接種是使用選自由內(nèi)皮細胞(1)、平滑肌細胞、外周細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮祖細胞、以及干細胞所組成的組中的細胞進行的。24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一個通道的接種是使用內(nèi)皮細胞(1)進行的。25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述至少一個通道的接種是使用內(nèi)皮細胞(1)和平滑肌細胞進行的。26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一個通道的接種是使用內(nèi)皮細胞(1)、平滑肌細胞和外周細胞進行的。27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述至少一個通道的接種是使用內(nèi)皮細胞(1)、平滑肌細胞、外周細胞和成纖維細胞進行的。28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，至少一個通道中生長有內(nèi)皮細胞(1)，而至少一個通道中生長有至少一種非內(nèi)皮細胞類型。29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述基質(zhì)中的至少一個通道是由軸芯(2)形成的。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法,其中，通過抽取而去除所述軸芯(2)。31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法,其中,通過降解而去除所述軸芯(2)。32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述至少--個通道的接種(1300)是通過選自由以下方法所組成的組中的方法進行的向所述基質(zhì)通道中注入細胞、將細胞預先附著到所述軸芯上、以及將細胞預先附著到所述軸芯上和向所述基質(zhì)通道中注入細胞的組合。33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述基質(zhì)中的至少一個通道的直徑是20微米-500微米。34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基質(zhì)中的至少一個通道的直徑是500微米-5.5毫米。35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述基質(zhì)(1391)含有選自由纖維蛋白、膠原、亞型膠原、明膠、凝膠的基底膜、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、基底膜蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、硅膠和細胞所組成的組中的物質(zhì)。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中，所述基底膜蛋白選自由IV型膠原、基底膜蛋白多糖、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白、巢蛋白、營養(yǎng)不良蛋白聚糖、VII型膠原纖維和VII型膠原微原纖維所組成的組中。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中,所述細胞外基質(zhì)蛋白選自由蛋白聚糖、糖胺聚糖、硫酸肝素蛋白聚糖、硫酸軟骨蛋白聚糖、硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖、透明質(zhì)酸、膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、彈性蛋白和層粘連蛋白所組成的組中。38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基質(zhì)還含有生長因子。39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述基質(zhì)(1391)中生長有選自由內(nèi)皮細胞(1)、平滑肌細胞、外周細胞、成纖維細胞、祖細胞、干細胞、肌細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、人細胞、動物細胞、植物細胞、真核細胞、實質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞、基因工程化細胞、基因修飾的細胞、病態(tài)細胞、病毒感染的細胞和癌細胞所組成的組中的細胞。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，微血管網(wǎng)絡(luò)(2428)生長的增加用以指示所述細胞正在分泌促血管生成因子(2412),而微血管網(wǎng)絡(luò)(2528)生長的減慢用以指示所述細胞正在分泌抗血管生成因子(2512)。41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，至少一種組織(2311)被植入到所述基質(zhì)中。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述至少一種組織(2311)選自由健康組織、病態(tài)組織、癌癥組織、以及基因工程化組織所組成的組中。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法,其中，微血管網(wǎng)絡(luò)(2428)生長的增加用以指示所述組織正在分泌促血管生成因子，微血管網(wǎng)絡(luò)(2528)生長的減慢用以指示所述組織正在分泌抗血管生成因子。44.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，所述至少一種灌注液培養(yǎng)基的流動與體內(nèi)的毛細管的流動相似。45.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過減少向一個親代血管(202)的流入并增加在另一親代血管(200)上的阻力，使所述至少一種灌注液培養(yǎng)基(204)優(yōu)先流經(jīng)連接親代血管的所述微血管網(wǎng)絡(luò)。46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述至少一種灌注液培養(yǎng)基含有細胞生長培養(yǎng)基，該細胞生長培養(yǎng)基中補充了選自由促血管生成因子、抗血管生成因子、血清、佛波酯、以及生長因子所組成的組中的成分。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法,其中，所述至少一種灌注液培養(yǎng)基的充氧基本上是通過所述基質(zhì)(1391)的擴散完成的。48.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種培養(yǎng)基含有生長因子。49.一種在培養(yǎng)灌注設(shè)備(1350)中在體外形成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的方法，其中，該方法包括以下步驟在所述培養(yǎng)灌注設(shè)備(1350)的腔(1390)內(nèi)的軸芯(1384)周圍注入基質(zhì)(1391)；去除所述軸芯(1384)，在所述基質(zhì)(1391)內(nèi)形成通道(1388)；將導管(1381)連接在至少一個入口(1354)和出口(1392)上；通過所述導管(1382)將至少一種細胞類型接種到所述通道(1384)中；使所述細胞在所述通道(1388)內(nèi)分布；通過充入所述入口(1354)并充滿至少一個入口(1354)和出口(1392)來灌注所述培養(yǎng)灌注設(shè)備(1350)；培育所述培養(yǎng)灌注設(shè)備(1350)以形成親代血管(1393),其中，當接種密度足以觸發(fā)萌發(fā)時，由所述親代血管萌發(fā)微血管；以及通過培育所述培養(yǎng)灌注設(shè)備(1350)，形成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)。50.—種篩選促血管生成產(chǎn)物和抗血管生成產(chǎn)物的方法，其中，該方法包括以下步驟由激活的具有萌發(fā)能力的親代血管(2328)生成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò),其中，在灌注設(shè)備(2300)的基質(zhì)(2312)內(nèi)植入所述微血管網(wǎng)絡(luò)；將候選物(2311)加到所述基質(zhì)內(nèi)；灌注并培育所述灌注設(shè)備；檢測與所加候選物(2311)相關(guān)的微血管網(wǎng)絡(luò)(2428)的三維生長。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述候選物選自由細胞、產(chǎn)物、以及組織(2311)所組成的組中。52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法,其中,將所述候選物加到所述灌注液培養(yǎng)基(2332)中，而不是所述基質(zhì)(2312)中。53.一種用于在體外生成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的培養(yǎng)灌注設(shè)備，其中，該設(shè)備包括用于將至少一種能夠萌發(fā)的細胞類型接種到基質(zhì)內(nèi)的至少一個通道中的裝置，其中，所述至少一個通道與灌注裝置是流通的；用于激活所述至少一種細胞類型由親代血管萌發(fā)微血管的能力的裝置,其中，所述萌發(fā)的能力是由接種的密度觸發(fā)的；灌注裝置,該灌注裝置用于將至少一種培養(yǎng)基灌注至所述至少一個通道以使所述至少一種細胞類型形成至少一個親代血管，其中，所述灌注裝置位于培育裝置中；用于培育并灌注至少一個親代血管以維持活力并使所述至少一個親代血管向周圍基質(zhì)萌發(fā)微血管的裝置；以及用于通過所述培育裝置使萌發(fā)的微血管生長直至所述微血管形成網(wǎng)絡(luò)的裝置。全文摘要一種在體外生成可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的方法。將包括能夠萌發(fā)的細胞類型的細胞接種(1300)到基質(zhì)的通道中，以根據(jù)接種密度激活細胞萌發(fā)形成微血管的能力(1304)。所述基質(zhì)通道被灌注培養(yǎng)基，以形成并活化親代血管(1324)。培育并灌注所述親代血管和基質(zhì)以使微血管形成萌芽進入周圍基質(zhì)(1328)。萌發(fā)的親代血管生長直至形成網(wǎng)絡(luò)(1332)。文檔編號C12M1/00GK101855341SQ200880108494公開日2010年10月6日申請日期2008年9月24日優(yōu)先權(quán)日2007年9月24日發(fā)明者A·圖魯烏斯卡咿亞,J·O·Y·余,M·E·福弗,T·諾伊曼申請人:諾荑思公司