皮膚特異表達綿羊β-catenin基因的表達盒、重組質(zhì)粒以及它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種皮膚特異表達綿羊β-catenin基因的表達盒、重組質(zhì)粒以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種DNA分子，自上游至下游依次包括人皮膚特異性啟動子K14和β-catenin基因。所述β-catenin基因編碼序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。所述人皮膚特異性啟動子K14具體可如序列表的序列1自5’末端第12至2011位核苷酸所示。本發(fā)明提供了相應(yīng)的表達盒和重組質(zhì)粒，能夠在動物皮膚中特異驅(qū)動β-catenin基因表達，促進皮膚毛囊生長，在不損害個體正常生長的前提下提高動物的產(chǎn)毛量和產(chǎn)毛品質(zhì)。
【專利說明】皮膚特異表達綿羊P-eaten in基因的表達盒、重組質(zhì)粒以及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種皮膚特異表達綿羊P-catenin基因的表達盒、重組質(zhì)粒以及它們的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]毛囊是控制毛發(fā)生長的一個復(fù)雜的皮膚附屬結(jié)構(gòu)，在胚胎期形成，主要由毛乳頭、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、隆突區(qū)和毛干等結(jié)構(gòu)組成。毛囊形態(tài)發(fā)生的信號起源于真皮，隨后一系列的信號分子穿梭于上皮細胞和真皮細胞之間，介導(dǎo)這兩個細胞群體之間的相互作用，促使上皮細胞和真皮細胞的增殖、分化、遷移及其之間相互連接的一系列活動，最終形成完整的毛囊。毛發(fā)的生長是一個周期性過程，分為生長期、退行期和靜止期。各個時期的發(fā)動和持續(xù)時間因綿羊品種而異，毛囊干細胞的分化在毛囊周期性變化過程中起了重要作用。毛囊的各性狀決定了羊毛的產(chǎn)量和品質(zhì)，毛囊的周期性變化引起了綿羊羊毛的脫落，因此了解毛囊的性狀及其周期性變化規(guī)律是提高羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)的重要基礎(chǔ)。
[0003]Catenins是與鈣黏著蛋白結(jié)合形成復(fù)合物的一種蛋白家族，分為a、0、S、Y4個亞型。其中P-catenin是一種具有雙重功能的蛋白，最早是由德國細胞生物學(xué)家WaltBirchmeier發(fā)現(xiàn)。P -catenin既可以作為一種黏附分子參與細胞之間的黏附連接，又可以經(jīng)由WNT信號通路參與調(diào)芐基因的轉(zhuǎn)錄。在沒有WNT配體存在的情況下，大部分的3 -catenin與鈣黏著蛋白結(jié)合參與細胞間的黏附連接,少部分的0 -catenin與Axin、APC、CKI和GSK-3P結(jié)合形成復(fù)合物。CKI首先引起P-catenin第45位殘基磷酸化，此反應(yīng)又進一步催化GSK-30對P _catenin33、37、41位殘基發(fā)生磷酸化作用，被磷酸化標記的3 -catenin被泛素連接酶P -Trcp蛋白識別進而泛肽化,最終進入泛素降解途徑降解，胞漿中游離的P -catenin水平極低；WNT信號傳入時，WNT蛋白與FRZ胞外結(jié)合，在LRP協(xié)同作用下，Dvl被募集至細胞膜附近，Dvl促使GSK-3P磷酸化，使其從Axin復(fù)合物上脫落，從而避免進入泛素降解途徑。脫落的3-catenin在胞漿中聚集，達到一定濃度時，通過核孔進入細胞核。在細胞核內(nèi)，P-catenin與Tcf/Lef結(jié)合,促進祀基因的激活轉(zhuǎn)錄。實驗表明3-catenin作為信號分子穿梭于上皮細胞和表皮細胞之間，介導(dǎo)二者之間的相互作用，在毛囊形成過程中扮演重要的角色。胚胎期干擾P-catenin基因的表達，將不會形成正常的毛囊結(jié)構(gòu)；在出生后干擾P-catenin基因的表達則導(dǎo)致在第一個毛發(fā)周期之后毛發(fā)脫落，不會進入下一個生長周期；敲除掉3-catenin基因之后，毛囊干細胞也不會分化形成毛囊細胞。反之，在胚胎期增加3-catenin的表達水平能夠引起毛囊數(shù)目的增加，而且會誘導(dǎo)毛發(fā)由靜止期提前進入生長期。然而，3-catenin在毛囊形成和周期性變化過程中的作用方式和作用機理還不是很明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種皮膚特異表達綿羊P -catenin基因的表達盒、重組質(zhì)粒以及它們的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供了一種DNA分子，自上游至下游依次包括人皮膚特異性啟動子K14和3 -catenin 基因。
[0006]所述0 -catenin基因編碼序列表的序列2所示的P -catenin蛋白。
[0007]所述0 -catenin基因具體可如序列表的序列I自5’末端第2226至4571位核苷酸所示。
[0008]所述人皮膚特異性啟動子K14具體可如序列表的序列I自5’末端第12至2011位核苷酸所示。
[0009]所述DNA分子具體可如序列表的序列2自5’末端第12至4728位核苷酸所示。
[0010]所述DNA分子中，在所述P -catenin基因的下游還可具有IRES序列和熒光標記基因。
[0011]所述IRES序列具體可如序列表的序列I自5’末端第4735至5319位核苷酸所示。
[0012]所述熒光標記基因具體可為序列表的序列I自5’末端第5323至6039位核苷酸所示的EGFP基因。
[0013]所述DNA分子具體可如序列表的序列2自5’末端第12至6039位核苷酸所示。
[0014]含有以上任一所述DNA分子的質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述質(zhì)粒具體可為序列表的序列I所示的質(zhì)粒。序列 I中自5’末端第12至2011位核苷酸為人皮膚特異性啟動子K14，第2217至2225位核苷酸為Kozak序列，第2226至4571位核苷酸為P -catenin基因，第4572至4728位核苷酸為P -catenin基因的3’ UTR區(qū)域，第4735至5319位核苷酸為IRES序列，第5323至6039位核苷酸為EGFP基因。
[0015]本發(fā)明還保護以上任一所述DNA分子或所述質(zhì)粒的應(yīng)用；所述應(yīng)用為如下(a)或(b)或(C)或(d): Ca)表達3 -catenin基因；(b)制備用于促進動物皮膚毛囊進入生長期的產(chǎn)品；(C)促進動物皮膚毛囊進入生長期；(d)制備在動物皮膚中表達3 -catenin基因的產(chǎn)品。所述動物具體可為C57BL/6J小鼠或綿羊(具體可為細毛羊，如敖漢細毛羊)。所述表達P-catenin基因具體可為在動物皮膚中特異表達0-catenin基因。所述0-catenin基因編碼序列表的序列2所示的0-catenin蛋白。所述P-catenin基因具體可如序列表的序列I自5’末端第2226至4571位核苷酸所示。
[0016]啟動子是基因表達調(diào)控中最為關(guān)鍵的一個調(diào)控因子，決定了基因的轉(zhuǎn)錄與否。啟動子的種類有很多，組織特異性啟動子除了具備啟動子的基本元件之外還有一些調(diào)控特異表達的序列。在特異性表達啟動子的調(diào)控下，外源基因能夠只在特定的組織表達。本發(fā)明提供了相應(yīng)的表達盒和重組質(zhì)粒，能夠在動物皮膚中特異驅(qū)動3 -catenin基因表達,促進皮膚毛囊生長，在不損害個體正常生長的前提下提高動物的產(chǎn)毛量和產(chǎn)毛品質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為pIRES2-EGFP質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖2為實施例1的步驟一的2中PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；M為分子量標記，I至4為PCR擴增產(chǎn)物。
[0019]圖3為實施例1的步驟一的7中PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；M為分子量標記，I至5為PCR擴增產(chǎn)物。[0020]圖4為重組質(zhì)粒K14-P -catenin-1RES-EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖5為P -catenin基因的在不同組織中的相對表達量(部分結(jié)果)。
[0022]圖6為溶解曲線。
[0023]圖7為陽性鼠59-2熒光下觀察的結(jié)果。
[0024]圖8為陽性鼠59-2和非陽性鼠石蠟切片和HE染色后的照片。
【具體實施方式】
[0025]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。PIRES2-EGFP質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1):北京天恩澤基因科技有限公司，CAT#:80501-2。C57BL/6J小鼠:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。
[0026]實施例1、質(zhì)粒的構(gòu)建和應(yīng)用
[0027]—、皮膚特異表達綿羊P-catenin基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0028]1、提取人血液組織的基因組DNA。
[0029]2、以步驟I的基因組DNA為模板，用K14F和K14R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0030]K14F:5' -CATTA·ATATCCCTGCAGAAGAAGGAGAC~3/ ；
[0031]K14R:5' -ATAAGCGCTGGCTGAGTGAAGAGAAGG-3'。
[0032]PCR 反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 2min，30個循環(huán)；72°C再延伸IOmin。
[0033]PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2?？捎^察到2000bp左右的特異性條帶。
[0034]3、用限制性內(nèi)切酶AseI和AfeI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0035]4、用限制性內(nèi)切酶AseI和AfeI雙酶切pIRES2_EGFP質(zhì)粒，回收約4700bp的載體骨架。
[0036]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒K14-1RES-EGFP。重組質(zhì)粒K14-1RES-EGFP中，人皮膚特異性啟動子K14取代了 pIRES2_EGFP質(zhì)粒原有的CMV啟動子(組成型啟動子)。
[0037]6、提取敖漢細毛羊皮膚的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0038]7、以步驟6的cDNA為模板，用JDF和JDR組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR
擴增產(chǎn)物。
[0039]JDF:5' -CGGAGACGGAGCAAGGT-3'；
[0040]JDR:5' -GCAAGCAAAGTCAGTACCAT-3'。
[0041]PCR 反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 5min ;951:變性308、561:退火308、721:延伸 2min40s，33個循環(huán)；72°C再延伸lOmin。
[0042]PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3，可觀察到2700bp左右的特異性條帶。
[0043]8、以步驟7的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用F和R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。[0044]F:5, -TCCCCGCGGCGGAGACGGAGCAAGGT-3'；
[0045]R:5' -CGCGGATCCGCAAGCAAAGTCAGTACCAT~3/。
[0046]9、用限制性內(nèi)切酶SacII和BamHI雙酶切步驟8的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0047]10、用限制性內(nèi)切酶SacII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒K14_IRES_EGFP，回收約6700bp的載體骨架。
[0048]11、將步驟9的酶切產(chǎn)物和步驟10的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒K14-P -catenin-1RES-EGFP。
[0049]重組質(zhì)粒K14-0-catenin-1RES-EGFP的測序結(jié)果見序列表的序列I。序列I中自5’末端第12至2011位核苷酸為人皮膚特異性啟動子K14，第2217至2225位核苷酸為Kozak序列，第2226至4571位核苷酸為P -catenin基因，第4572至4728位核苷酸為3 -catenin基因的3’UTR區(qū)域，第4735至5319位核苷酸為IRES序列，第5323至6039位核苷酸為EGFP基因。
[0050]重組質(zhì)粒K14-0 -catenin-1RES-EGFP的結(jié)構(gòu)不意圖見圖4。
[0051]重組質(zhì)粒K14- P -catenin-1RES-EGFP導(dǎo)入動物后，在人皮膚特異性啟動子K14的驅(qū)動下，P -catenin基因在皮膚組織中特異表達，由于IRES序列的存在，EGFP基因同時表達(EGFP是一種突變型的GFP，產(chǎn)生的熒光是普通GFP的35倍，可在多種異源生物中表達且無細胞毒性)。本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，可以通過原核注射方法制備轉(zhuǎn)基因動物，能夠得到皮膚特異性高表達的動物家系。
[0052]二、應(yīng)用步驟一制備的重組質(zhì)粒在小鼠皮膚中特異表達綿羊P-catenin基因
[0053]1、用限制性內(nèi)切酶Asel酶切重組質(zhì)粒K14_ P-catenin-1RES-EGFP，得到線性化質(zhì)粒。
[0054]2、取C57BL/6J小鼠(雄)和C57BL/6J小鼠(雌)的受精卵480枚，注射步驟3得到的線性化質(zhì)粒，然后移植到24只假孕母鼠的輸卵管中(每只假孕母鼠注射20枚受精卵)，11只母鼠懷孕(受精卵的移植成功率為45.83%)，共獲得93只子代小鼠。
[0055]3、分別提取步驟2得到的各個子代小鼠的尾部組織，提取基因組DNA，用JDF和JDR組成的引物對進行PCR鑒定，然后將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。
[0056]PCR 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer2.5 U 1，Ex Taq0.3 U 1，dNTP2.5 U 1，基因組DNAl.0ii 1，JDF0.5 u 1，JDR0.5u I, ddH2017.7u I。
[0057]PCR 反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s、60°C退火 30s、72°C延伸 3min，35個循環(huán)；72°C再延伸IOmin。
[0058]如果顯示2800bp左右的特異性條帶，該小鼠為陽性小鼠。
[0059]93只子代小鼠中，10只為陽性小鼠，陽性率為10.75%。
[0060]將陽性小鼠命名為Founder鼠，即首建鼠H)。
[0061]4、將性成熟的Founder鼠(8周齡)與8周齡的C57BL/6J小鼠交配，得到的子代鼠即為Fl代鼠。
[0062]5、將步驟4得到的Fl代鼠(2周齡)剪尾并提取基因組DNA，用JDF和JDR組成的引物對進行PCR鑒定，如果1%瓊脂糖凝膠電泳顯示2800bp左右的特異性條帶，該小鼠為陽性小鼠。Fl代小鼠中共獲得38只Fl代陽性鼠。
[0063]6、分別取步驟5得到的各個Fl代陽性鼠的皮膚、肌肉和肺臟組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量PCR檢測各個組織中綿羊P -catenin基因的表達量。
[0064]用于檢測P-catenin基因的引物對如下:
[0065]P-catenin-F:5' -AGCGTCGTACATCTATGGG-3'；
[0066]P-catenin-R:5' -ATAATCCTGTGGCTTGACC-3'。
[0067]用于檢測持家基因Actin引物如下:
[0068]Actin-F:5' -TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'；
[0069]Actin-R:5' -ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3'。
[0070]熒光定量PCR 反應(yīng)體系(20ii I):Real Master Mix(SYBR? Green I)10iU，上游引物和下游引物各I u 1，cDNAl u 1，ddH207u 10各個試劑購自加拿大新產(chǎn)業(yè)科技公司。
[0071]PCR 反應(yīng)程序:95°C 預(yù)變性 3min ;95°C 變性 10s、58°C 退火 10s、72°C 延伸 30s，Plate Read，40 個循環(huán)；95°C 10s、65°C 5s,95°C 5s, Plate Read。
[0072]38只Fl代陽性鼠的肌肉組織和肺臟組織中均未檢測到P -catenin基因的表達。38只Fl代陽性鼠的皮膚組織中均可以檢測到P -catenin基因的表達。
[0073]P-catenin基因的在不同組織中的相對表達量(部分結(jié)果)見圖5。
[0074]溶解曲線見圖6。
[0075]7、分別剪取步驟5得到的各個Fl代陽性鼠的尾部組織，放入1.5ml離心管中，置于熒光下觀察。
[0076]38只Fl代陽性鼠均可觀察到小鼠尾部發(fā)出綠色熒光。陽性鼠59-2的結(jié)果見圖7(Wt 為 C57BL/6J 小鼠)。
[0077]8、分別取陽性鼠59-2和同窩出生的非陽性鼠的背部皮膚，進行石蠟切片和HE染色，照片見圖8 (A為陽性鼠59-2，B為非陽性鼠)。陽性鼠59-2的毛囊已經(jīng)開始進入生長期，而非陽性鼠的毛囊大部分處于靜止期。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA分子，自上游至下游依次包括人皮膚特異性啟動子K14和P-catenin基因。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述P-catenin基因編碼序列表的序列2所示的0-catenin蛋白。
3.如權(quán)利要2所述的DNA分子，其特征在于:所述@-catenin基因如序列表的序列I自5’末端第2226至4571位核苷酸所示。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的DNA分子，其特征在于:所述人皮膚特異性啟動子K14如序列表的序列I自5’末端第12至2011位核苷酸所示。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子如序列表的序列2自5’末端第12至4728位核苷酸所示。
6.如權(quán)利要求1至4中任一所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子中，在所述& -catenin基因的下游還具有IRES序列和突光標記基因。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA分子，其特征在于:所述IRES序列如序列表的序列I自5’末端第4735至5319位核苷酸所示。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子如序列表的序列2自5’末端第12至6039位核苷酸所示。
9.含有權(quán)利要求1至8中任一所述DNA分子的質(zhì)粒?！?br> 10.權(quán)利要求1至8中任一所述DNA分子或權(quán)利要求9所述質(zhì)粒的應(yīng)用；所述應(yīng)用為如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)表達0-catenin基因；(b)制備用于促進動物皮膚毛囊進入生長期的產(chǎn)品；(C)促進動物皮膚毛囊進入生長期；(d)制備在動物皮膚中表達3-catenin基因的廣品。
【文檔編號】C12N15/12GK103589733SQ201310552488
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】鄧學(xué)梅, 崔凱, 楊祖, 張媛媛, 葛雅瓊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)