專(zhuān)利名稱(chēng)：一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌(Listeria ivanovii,在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)Li)基因組的方法。
背景技術(shù)：
Li屬于李斯特菌屬，僅對(duì)綿羊等動(dòng)物致病，不對(duì)人致病，具有與李斯特菌屬內(nèi)另一種菌-單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)Lm)相似的生物學(xué)特性。Lm由于具有獨(dú)特的能在感染的宿主吞噬細(xì)胞漿內(nèi)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，成為了良好的T細(xì)胞免疫活化佐劑，已在疫苗制備上得到了廣泛應(yīng)用，部分以Lm為載體的重組活菌治療性腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如Wood LM et al.報(bào)道構(gòu)建的兩種基因重組Lm活菌疫苗(Lm-LLO-⑶105A和Lm-LLO-⑶105B)能顯著減小乳腺癌小鼠動(dòng)物模型的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤組織體積、降低乳腺癌自發(fā)小鼠模型腫瘤發(fā)生率(Wood LM, Pan ZK, Guirnalda P，et al.Targeting tumor vasculature with novel Listeria-based vaccines directedagainst CD105.Cancer Tmmunol Immunother.2011，60 (7):931_942)。雖然以 Lm 為載體的重組活菌疫苗免疫保護(hù)效果較好，但由于Lm可對(duì)人致病，故作為載體的Lm需經(jīng)嚴(yán)格地敲除致病相關(guān)基因進(jìn)行減毒，且此類(lèi)疫苗目前只能限制在特殊人群(如癌癥病人)中小范圍應(yīng)用。與Lm同屬李斯特菌屬的Li因具有與Lm相似的生物學(xué)特性(能在吞噬細(xì)胞等宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖)，決定了其也具有活化T細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng)，再加上其相對(duì)于Lm而言的低毒安全性，因此可望代替Lm在疫苗制備上發(fā)揮更廣泛的作用。要制備以Li為載體的重組活菌疫苗，需要將外源基因整合至Li基因組，但目前將外源基因整合至Li基因組 的方法尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法。本發(fā)明所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法包括以下步驟:(I)將從含有擬整合外源基因的生物基因組模板或基因克隆質(zhì)粒庫(kù)內(nèi)PCR擴(kuò)增得到的上游帶Hind III酶切位點(diǎn)、下游帶Xho I酶切位點(diǎn)的外源擬整合基因，插入第一重組質(zhì)粒(命名為PCW203)的Hind III酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到中間重組質(zhì)粒，所述第一重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1所示；(2)切下步驟(I)得到的中間重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間的片段插入第二重組質(zhì)粒(命名為PCW153)的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒，所述第二重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.2所示；或切下步驟(I)得到的中間重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間的片段插入第三重組質(zhì)粒(命名為PCW154)的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒，所述第三重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.3所示；
(3)將步驟(2)得到的第一目標(biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第一重組菌(命名為L(zhǎng)ilacZ)，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第一目標(biāo)菌，所述第一重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表達(dá)β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落，所述第一目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白；或?qū)⒉襟E(2)得到的第二目標(biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第二重組菌(命名為L(zhǎng)i AactAlacZ)，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第二目標(biāo)菌，所述第二重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)無(wú)actA基因和plcB基因，且在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表達(dá)半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落，所述第二目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)無(wú)actA基因和plcB基因，且在其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白。上述方法中，制備第一重組質(zhì)粒(pCW203)的步驟如下:(I)擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)PRRSV)包膜蛋白GP5編碼基因0RF5的基因片段(GenBank: JX105430.1)，其上游帶Hind III酶切位點(diǎn)，下游帶Xho I酶切位點(diǎn)；(2)將上述0RF5基因片段插入質(zhì)粒pHS-LV的Hind III酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第一重組質(zhì)粒。上述方法中，制備第二重組質(zhì)粒(pCW153)的步驟如下:(I)擴(kuò)增上游帶Hind III酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的Li orfXYZ基因(GenBank:AJ249805.1),并將所述Li orfXYZ基因插入質(zhì)粒pHS_LV的Hind III酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間；(2)擴(kuò)增上游帶Sal I酶切位點(diǎn)、下游帶Spe I酶切位點(diǎn)的Ery基因(序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質(zhì)粒的Sal I酶切位點(diǎn)與Spe I酶切位點(diǎn)之間；(3)擴(kuò)增上游帶Xba I酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并將所述Li orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質(zhì)粒的Xba I酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間；(4)從所述第一重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上下游分別帶Not I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF5基因片段I (序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.1中(10)..(1050))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段I插入步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)；(5)從步驟(4)所得重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上游帶Bgl II酶切位點(diǎn)、下游帶Sal I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF5基因片段2 (序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.3中(4692)..(5456))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段2插入步驟(4)所得重組質(zhì)粒BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第二重組質(zhì)粒。上述方法中，制備第三重組質(zhì)粒(pCW154)的步驟如下:
(I)擴(kuò)增上游帶Hind III酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的Li mpl基因(GenBank:AY510073.1 )，并將所述Li mpl基因插入質(zhì)粒pHS-LV的Hind III酶切位點(diǎn)與NotI酶切位點(diǎn)之間；(2)擴(kuò)增上游帶Sal I酶切位點(diǎn)、下游帶Spe I酶切位點(diǎn)的Ery基因(序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質(zhì)粒的Sal I酶切位點(diǎn)與Spe I酶切位點(diǎn)之間；(3)擴(kuò)增上游帶Xba I酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并將所述Li orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質(zhì)粒的Xba I酶切位點(diǎn)與NotI酶切位點(diǎn)之間；(4)從所述第一重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上下游分別帶Not I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF5基因片段I (序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.1中(10)..(1050))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段I插入步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)；(5)從步驟(4)所得重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上游帶Bgl II酶切位點(diǎn)、下游帶Sal I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF5基因片段2 (序列見(jiàn)序列表的SEQ ID N0.3中(4692)..(5456))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段2插入步驟(4)所得重組質(zhì)粒BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第三重組質(zhì)粒。上述方法中，制備第一重組菌(LilacZ)的步驟如下:(I)擴(kuò)增上、下游分別帶Not I酶切位點(diǎn)的IacZ基因片段，并將所述IacZ基因片段插入上述制備第二重組質(zhì)粒的步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)；(2)將步驟(I)所得重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化Li，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，即得到第一重組菌。上述方法中，制備第二重組菌(Li AactAlacZ)的步驟如下:
(I)擴(kuò)增上、下游分別帶Not I酶切位點(diǎn)的IacZ基因片段，并將所述IacZ基因片段插入上述制備第三重組質(zhì)粒的步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)之間；(2)將步驟(I)所得重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化Li，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，即得到第二重組菌。本發(fā)明具有以下有益效果:1、實(shí)施簡(jiǎn)單。利用本發(fā)明所述方法將外源基因整合至Li基因組僅需簡(jiǎn)單的幾步常規(guī)分子克隆、細(xì)菌培養(yǎng)等相關(guān)操作，對(duì)儀器設(shè)備和操作技術(shù)的要求不高，成本低廉，制備成功后，重組菌可大量繁殖，易于大規(guī)模生產(chǎn)。2、篩選容易。采用菌落顏色和抗生素耐藥情況篩選目標(biāo)菌，目標(biāo)菌為不耐紅霉素的白色菌落，篩選方法簡(jiǎn)單容易，肉眼即可判斷。3、外源擬整合基因范圍廣。本發(fā)明所述技術(shù)平臺(tái)可將任何不含Hind IILXho I和BamH I的外源基因整合入Li基因組，適用范圍廣。4、定點(diǎn)整合。利用本發(fā)明所述重組質(zhì)粒和重組菌將外源基因定點(diǎn)整合至Li基因組orfBAldh基因上游，整合后的細(xì)菌生長(zhǎng)不受影響。5、整合后的細(xì)菌能穩(wěn)定表達(dá)并分泌外源整合基因編碼蛋白。整合的基因攜帶來(lái)源于Lm溶血素LLO的啟動(dòng)子(phly)和分泌信號(hào)肽(Secret signal),故能翻譯出帶分泌信號(hào)肽的外源整合基因編碼蛋白，且由于分泌信號(hào)肽的引導(dǎo)作用，翻譯出的蛋白能分泌至細(xì)菌胞外。6、不含耐藥基因。利用本發(fā)明所述構(gòu)建的重組Li不引入外來(lái)的紅霉素等抗生素基因，也沒(méi)有攜帶抗紅霉素等抗生素耐藥性，保證了其在制備疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用性。7、敲除了致病基因actA和plcB，保證了重組菌的安全性。本發(fā)明所述重組菌LiAactAlacZ的致病基因actA和plcB已被敲除，在該菌基礎(chǔ)上得到的目標(biāo)重組菌不含actA和plcB基因，故具有應(yīng)用的安全性。8、攜帶⑶8+和⑶4+T細(xì)胞識(shí)別表位作為T(mén)細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)標(biāo)簽。外源擬整合基因的上游融合了 GP33 epitope基因，下游融合了 GP61 epitope基因，故翻譯的外源基因蛋白融合了 GP33 (⑶8+T細(xì)胞識(shí)別表位)和GP61 (⑶4+T細(xì)胞識(shí)別表位)，便于檢測(cè)針對(duì)外源擬整合基因的特異性⑶8+和⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答。9、攜帶western blot檢測(cè)標(biāo)簽。外源擬整合基因的上游融合了 HA westernblot檢測(cè)標(biāo)簽基因(HA印itope)，下游融合了 VSV-G western blot檢測(cè)標(biāo)簽基因(VSV-Gepitope),故翻譯的外源基因蛋白融合了 HA和VSV-G檢測(cè)標(biāo)簽,便于western blot檢測(cè)外源整合基因編碼的融合蛋白。


圖1 為 PCR 擴(kuò)增 PRRSV 0RF3、PRRSV 0RF4、PRRSV 0RF5、PRRSV 0RF6 和 IacZ 基因片段的電泳結(jié)果圖，圖中，I為IacZ擴(kuò)增產(chǎn)物，2為PRRSV 0RF6擴(kuò)增產(chǎn)物，3為PRRSV 0RF5擴(kuò)增產(chǎn)物，4為PRRSV 0RF4擴(kuò)增產(chǎn)物，5為PRRSV 0RF3擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA ladder。可見(jiàn)，在約4001bp、542bp、620bp、554bp和782bp處分別有特異條帶，與預(yù)期相符，表明擴(kuò)增成功。圖2為第一重組質(zhì)粒pcw203的一種結(jié)構(gòu)圖譜，含有氨芐青霉素抗性基因(Amp)、啟動(dòng)子phly、分泌信號(hào)肽(secret signal)、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、可被外源擬整合基因替換的PRRSV 0RF5基因(上下游分別帶Hind III和Xho I單酶切位點(diǎn))和BamHI單酶切位點(diǎn)。圖3為第一重組質(zhì)粒pCW203 HindIILXho I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW203Hind II1、Xho I 雙酶切反應(yīng)液，M 為 DNA ladder。圖4為PCR擴(kuò)增Li orfXYZ和Li orfBAldh基因片段的電泳結(jié)果圖，圖中，I為L(zhǎng)iorfBAldh擴(kuò)增產(chǎn)物，2 為 Li orfXYZ擴(kuò)增產(chǎn)物，M為 DNA ladder。可見(jiàn)，在約 1537bp、1159bp處分別有特異條帶，與預(yù)期相符，表明擴(kuò)增成功。圖5為PCR擴(kuò)增Li mpl基因片段的電泳結(jié)果圖，圖中，I為L(zhǎng)i mpl擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNAladder。由圖可見(jiàn),在約81 Ibp處有一條特異條帶,與預(yù)期相符,表明擴(kuò)增成功。圖6為PCR擴(kuò)增Ery基因片段的電泳結(jié)果圖，圖中，I為Ery擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNAladder?？梢?jiàn),在約1471bp處有一條特異條帶,與預(yù)期相符,表明擴(kuò)增成功。圖7為重組質(zhì)粒pCWlOl HindIILNot I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCWlOl HindII1、Not I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖8為重組質(zhì)粒pCW102 H ind IILNot I雙酶切及pCW103 Sal I,Spe I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為PCW102陰性對(duì)照Hind II1、Not I雙酶切反應(yīng)液，2、3為pCW102 Hind1、Not I雙酶切反應(yīng)液，4為pCW103 Sal1、Spe I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖9為重組質(zhì)粒pCW104 Sal1、Spe I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW104 Sal1、Spe I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖10為重組質(zhì)粒pCW105 Xba1、Not I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW105 Xba1、Not I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖11為重組質(zhì)粒pCW106 Xba1、Not I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW106 Xba1、Not I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖12為PCR擴(kuò)增PRRSV 0RF5基因片段I的電泳結(jié)果圖，圖中，I為PRRSV 0RF5基因片段I擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA ladder。可見(jiàn)，在約1069bp處有一條特異條帶，與預(yù)期相符，表明擴(kuò)增成功。圖13為重組質(zhì)粒pCW117 Not I酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW117陰性對(duì)照NotI酶切反應(yīng)液，2為pCW117 Not I酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖14為重組質(zhì)粒pCW118 Not I酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW118陰性對(duì)照NotI酶切反應(yīng)液，2為pCW118 Not I酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖15為PCR擴(kuò)增PRRSV 0RF5基因片段2的電泳結(jié)果圖，圖中，I為PRRSV 0RF5基因片段2擴(kuò)增產(chǎn)物，2-4為PRRSV 0RF5基因片段2擴(kuò)增陰性對(duì)照，M為DNA ladder?？梢?jiàn)，在約783bp處有一條特異條帶，與預(yù)期相符，表明擴(kuò)增成功。圖16為本發(fā)明所述第二重組質(zhì)粒pcwl53的一種結(jié)構(gòu)圖譜，含有兩段Li同源基因(LiorfXYZ和Li orfBAldh)、氨芐青霉素抗性基因(Amp)、紅霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette):包含啟動(dòng)子 phly、分泌信號(hào)肽(secret signal)、HA epitope 基因、VSV-G印itope基因、GP33印itope基因、GP61印itope基因、PRRSV 0RF5基因、供外源基因插入的BamH1、Xho I位點(diǎn)。圖17為本發(fā)明所述第三重組質(zhì)粒pcwl54的一種結(jié)構(gòu)圖譜,含有兩段Li同源基因(Li mpl和Li orfBAldh)、氨芐青霉素抗性基因(Amp)、紅霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette):包 含啟動(dòng)子phly、分泌信號(hào)肽(secret signal)、HA epitope基因、VSV-G印itope基因、GP33印itope基因、GP61印itope基因、PRRSV 0RF5基因、供外源基因插入的 BamH1、Xho I 位點(diǎn)。圖18為第二重組質(zhì)粒pCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154 BamH I,Xho I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW153BamH1、Xho I雙酶切反應(yīng)液，2為pCW154 BamH1、Xho I雙酶切反應(yīng)液，M為DNA ladder。圖19為重組質(zhì)粒pCW107和pCW108 Not I酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW107陰性質(zhì)粒對(duì)照Not I酶切反應(yīng)液，2為pCW107 Not I酶切反應(yīng)液，3為pCW108 Not I酶切反應(yīng)液，M 為 DNA ladder。圖20為L(zhǎng)i IacZ和Li Δ actAlacZ的PCR鑒定電泳結(jié)果圖，圖中，I為以Li IacZ基因組為模板擴(kuò)增actA,2為以Li基因組為模板擴(kuò)增actA,3為以Li AactAlacZ基因組為模板擴(kuò)增actA，4為以LilacZ基因組為模板擴(kuò)增orfBAldh，5為以Li基因組為模板擴(kuò)增orfBAldh, 6 為以 Li Λ actAlacZ 基因組為模板擴(kuò)增 orfBAldh, 7 為以 E.coli/pCW107 基因組為模板結(jié)果Ery，8為以LilacZ基因組為模板擴(kuò)增Ery，9為以E.coli/pCW108基因組為模板擴(kuò)增Ery，10為以Li AactAlacZ基因組為模板擴(kuò)增Ery，11為以Li基因組為模板擴(kuò)增lacZ，12為以LilacZ基因組為模板擴(kuò)增lacZ，13為以Li Λ actAlacZ基因組為模板擴(kuò)增IacZ, M 為 DNA ladder。圖21為pCW203_0RF6Hind III和Xho I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I為pCW203-0RF6Hind II1、Xho I 雙酶切反應(yīng)液，M 為 DNA ladder。
圖22為pCW153-0RF6和pCW154_0RF6 BamH I和Xho I雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中，I 為 PCW153-0RF6 BamH I,Xho I 雙酶切反應(yīng)液，2 為 pCW154_0RF6 BamH I,Xho I 雙酶切反應(yīng)液，M 為 DNA ladder。圖23為利用雙同源雜交培養(yǎng)將pcwl53攜帶的gene cassette整合至LilacZ基因組的示意圖。圖24為利用雙同源雜交培養(yǎng)將pcwl54攜帶的gene cassette整合至Li Δ actAlacZ基因組的不意圖。圖25為L(zhǎng)1-0RF6和Li Λ actA-0RF6的PCR鑒定電泳結(jié)果圖，圖中，I為以Li_0RF6基因組為模板擴(kuò)增0RF6，2為以L1-0RF6基因組為模板擴(kuò)增Ery，3為以Li_0RF6基因組為模板擴(kuò)增lacZ，4為以Li Λ actA_0RF6基因組為模板擴(kuò)增0RF6，5為以Li Λ actA_0RF6基因組為模板擴(kuò)增Ery，6為以Li Λ actA_0RF6基因組為模板擴(kuò)增lacZ，M為DNA ladder。擴(kuò)增結(jié)果符合預(yù)期，表明目標(biāo)重組質(zhì)粒(PCW153-0RF6或pCW154_0RF6)中兩個(gè)Not I位點(diǎn)之間包括PRRSV 0RF6在內(nèi)的基因片段已整合至基因組內(nèi)。圖26為目標(biāo)菌分泌和非分泌蛋白western blot結(jié)果圖，圖中，I為L(zhǎng)i_0RF6非分泌蛋白，2為L(zhǎng)1-0RF6分泌蛋白，3為L(zhǎng)ilacZ分泌蛋白(原始菌對(duì)照)；4為L(zhǎng)i Λ actA_0RF6非分泌蛋白，5為L(zhǎng)iAactA_0RF6分泌蛋白，6為L(zhǎng)iAactAlacZ分泌蛋白(原始菌對(duì)照)，7為L(zhǎng)1-0RF3分泌蛋白，8為L(zhǎng)i Λ actA_0RF3分泌蛋白，9為L(zhǎng)i_0RF3非分泌蛋白，10為L(zhǎng)i Δ actA-0RF3非分泌蛋白，11為L(zhǎng)i_0RF4非分泌蛋白，12為L(zhǎng)i Δ actA-0RF4非分泌蛋白，13為L(zhǎng)1-0RF4分泌蛋白，14為L(zhǎng)i Δ actA-0RF4分泌蛋白，15為L(zhǎng)1-Rv0129非分泌蛋白，16為 L1-Rv0129 分泌蛋白，17 為 Li Δ actA-Rv0129 非分泌蛋白，18 為 Li Δ actA-Rv0129 分泌蛋白?？梢?jiàn)目標(biāo)菌均表達(dá)了符合預(yù)期帶標(biāo)簽融合蛋白，且大部分表達(dá)的外源基因編碼蛋白能分泌到細(xì)菌胞外，無(wú)外源基因整合的細(xì)菌對(duì)照樣品未檢測(cè)到雜交信號(hào)。圖27為PCR擴(kuò)增RvO 129基因的電泳結(jié)果圖，圖中，I為空白對(duì)照，2為RvO 129擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA ladder?？梢?jiàn)，在約901bp處有一條特異條帶，與預(yù)期相符，表明擴(kuò)增成功。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下述實(shí)施例中:質(zhì)粒pHS-LV來(lái)源于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Dr.HaoShen 實(shí)驗(yàn)室(Shen H, Slifka MK, Matloubian M, Jensen ER, Ahmed R, MiIIerJF.Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for theinduction of protective ant1-viral cell-mediated immunity.Proc Natl AcadSci USA.1995，92(9):3987-91.);攜帶 PRRSV 0RF3、0RF4、0RF5、0RF6 基因的重組質(zhì)粒(PRK5-GP3，pRK5-GP4, pRK5_GP5，pGBKT7_GP6)和攜帶結(jié)核桿菌 Rv0129 基因的重組質(zhì)粒pET-Ag85c來(lái)自上海交通大學(xué)免疫所，大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)Top 10購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；各種分子生物學(xué)試劑盒和生化試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；各種分子生物學(xué)工具酶購(gòu)自New England Biolabs ;培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；引物合成和基因測(cè)序由Invitrogen上海公司完成。實(shí)施例1:制備第一重組質(zhì)粒pCW203(I)擴(kuò)增PRRSV包膜蛋 白GP5編碼基因0RF5基因片段(GenBank: JX105430.1)以重組質(zhì)粒pRK5-GP5為模板作PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1, 4dNTPs (1 Ommol /T,.種)0.4 μ I,上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)(0RF5-f.5’ -TATGTAAGCTTTGTT GGGGAAGTGCTTGACC-3’)0.8 μ 1，下游引物(IOymol/L) (0RF5-r5’ -ATAACTCG AGGAGACGACCCCATT GTTCC-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP5 0.75 μ I,ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件:94 °C 3min — (94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C lmin20s) X 20 個(gè)循環(huán)—(94 °C 30s, 66 °C 30s, 72 °C lmin20s) X 10 個(gè)循環(huán)—72°C IOmin — 4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在620bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2) PRRSV 0RF5基因片段插入質(zhì)粒pHS-LV Hind II1、Xho I酶切位點(diǎn)之間分別對(duì)PRRSV 0RF5基因片段和質(zhì)粒pHS-LV用Hind III和Xho I雙酶切。Hind III和Xho I雙酶切反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer23y 1，10XBSA 3 μ 1，基因樣品15 μ 1，Hind III 0.6 μ 1，Xho 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反應(yīng) lh。PRRSV 0RF5 基因片段雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒pHS-LV經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)為13054bp的片段?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段用T4連接酶連接，得到第一重組質(zhì)粒pCW203(圖2)。連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10XT4Ligase reaction buffer I μ I,基因片段酶切回收物I μ 1，質(zhì)粒酶切回收物4 μ 1，T4連接酶I μ 1，ddH203 μ I，室溫反應(yīng)2h。連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO:用預(yù)冷槍頭吸5 μ I連接反應(yīng)液于預(yù)冷50 μ I感受態(tài)E.coli ToplO中，用手指輕彈管底使液體混合均勻，置冰浴30min，42°C水浴30s，冰浴3min。加入250 μ 137°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，于37°C 200r/min培養(yǎng)lh，取150 μ I菌液于含ΙΟΟμ g/ml氨芐青霉素的LB平板(以下簡(jiǎn)稱(chēng)LB-Amp)中央，用無(wú)菌L形玻棒將菌液涂布整個(gè)平板，于37°C培養(yǎng)18 24h，陽(yáng)性菌(E.coli/pCW203)在該平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Hind III和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3，從圖3可以看出，在約620bp和大 于IOkb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符,第一重組質(zhì)粒pCW203構(gòu)建成功。

實(shí)施例2:制備第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154(I)擴(kuò)增 Li orfXYZ (GenBank:AJ249805.1)、Li mpl (GenBank:AY510073.1), LiorfBAldh (GenBank:AJ249805.1)和 Ery (序列見(jiàn) SEQ ID N0.2 中(6642)..(8092))基因片段將Li菌種從_80°C冰箱取出，37°C水浴融化后劃線BHI瓊脂平板，于37°C培養(yǎng)24h，挑菌落轉(zhuǎn)種5ml BHI液體培養(yǎng)基，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)12_18h，用通用型柱式基因組提取試劑盒抽提基因組DNA作為模板，擴(kuò)增Li orfXYZ、Li mpl和Li orfBAldh基因片段。擴(kuò)增 Li orfXYZ 的反應(yīng)體系為:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (10mmol /L.種)0.5 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (Li orfXYZ-f:5’ -ATMAGCTTGTCGACATACTAGTTTCCAGCAAAGCGATT C_3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li orfXYZ-r: 5’ -AACTCTGCGGCCGCTTATTTTGGATTC ATATACTG) 0.8 μ 1，Li 基因組 DNA 樣品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ I,ddH2017.65 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 5min —(94°C lmin，44°C 30s, 72°C lmin40s) X 20個(gè)循環(huán)—(94°C lmin,68°C 30s, 72 °C lmin40s) X 10 個(gè)循環(huán)一72 °C lOmin —4°C。擴(kuò)增Limpl 的反應(yīng)體系為:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (lOmmol/L.種)0.5,上游引物(10 μ mol/L) (Li5，-ATAAAGCTTGTC GACATACTAGTTTCGTTATG GCTTAAATTG-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li mpl-r: 5’ -TTATGCGGCCGCTCTCTAATACCTGCGT AA-3’ )0.8μ 1，Li 基因組 DNA 樣品 2.5μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 5min—(94°C lmin，44°C 30s, 72 °C lmin30s) X20 個(gè)循環(huán)—(94°C lmin,67 °C 30s, 72 °C lmin30s) X 10 個(gè)循環(huán)一72 °C IOmin — 4 °C。擴(kuò)增 Li orfBAldh 的反應(yīng)體系為:10 X ultra pfu buffer2.5 μ l，4dNTPs (IOmmoI/L.種)(λ 5 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (Li orfBAldh-f:5’ -GCACGCTCTAGAACAAAAAACGGAAATCA GTTAG-3’)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L) (Li orfBAldh_r:5，-TATGCGGCCGCACTATTTTCGTAAGCGTTCG -3，)0.8 μ 1，Li 基因組 DNA 樣品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 5min —(94 °C lmin, 48 °C 30s, 72 °C 2min) X 20 個(gè)循環(huán)—(94°C lmin, 67 °C 30s,72°C 2min) X 10個(gè)循環(huán)一72°C IOmin — 4°C。以質(zhì)粒pHS-LV為模板擴(kuò)增Ery，反應(yīng)體系為:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (10mmol/L.種)0.5 μ I,上游引物(10 μ mol/L) (Ery-f:5，-GATAAGTCGACGAT TCACAAAAAATAG-3，)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L)(Ery-r:5> -AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’)0.8 μ 1，pHS-LV 質(zhì)粒樣品1.5 μ 1，ultrapfu 0.25μ 1，ddH2018.65 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min — (94 °C 30s，57 °C 30s，72°C 2min)X 30個(gè)循環(huán)一72°C IOmin — 4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，分別在1159bp、811bp、1537bp和1471bp處可見(jiàn)一條特異條帶(見(jiàn)圖4-圖6)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2)構(gòu)建制備第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154用的中間重組質(zhì)粒pCWlOl 和 pCW102分別對(duì)步驟(1)得到的Li orfXYZ和Li mpl基因片段及質(zhì)粒pHS_LV用Hind III和Not I雙酶切，Hind III和Not I雙酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer23 μ 1，10XBSA3 μ 1，基因樣品 15 μ 1，Hind III 0.6μ I, Not 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反應(yīng) lh。LiorfXYZ和Li mpl基因片段雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收回收。質(zhì)粒pHS-LV經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)為6030bp的片段?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段按實(shí)施例1(2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，Li orfXYZ與pHS-LV連接產(chǎn)物為pCWlOl ；LimpI與pHS-LV連接產(chǎn)物為pCW102。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliToplO,陽(yáng)性菌(E.coli/pCW101、E.coli/pCW102)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Hind III和Not II雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8，從圖7可見(jiàn)，pCWlOl Hind II1、Not I雙酶切后在約1159bp和6030bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，pCWlOl構(gòu)建成功；從圖8可見(jiàn)，pCW102 Hind IILNot I雙酶切后在約811bp和6030bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW102構(gòu)建成功。(3)構(gòu)建制備第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154用的中間重組質(zhì)粒PCW103 和 pCW104分別對(duì)步驟(1)得到的Ery基因片段和步驟(2)得到pCWlOl及pCW102用Sal I和Spe I雙酶切。Sal I和Spe I雙酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer33 μ 1，10XBSA
3μ 1，基因樣品 15 μ 1，Sal 10.6 μ I, Spe 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C水浴反應(yīng) lh。Ery 基因片段雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒pCWlOl及pCW102經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，用通用型DNA純化回收試劑盒回收。回收后的基因片段和質(zhì)粒片段按實(shí)施例1 (2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，Ery與pCWlOl連接產(chǎn)物為PCW103 ；Ery與pCW102連接產(chǎn)物為pCW104。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1 (2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coliToplO。陽(yáng)性菌(Ε.coli/pCW103 或 Ε.coli/pCW104)在 LB-Amp 平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Sal I和Spe I雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8-圖9，從圖8可見(jiàn)，pCW103Sal I ,Spe I雙酶切后在約1471bp和7172bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW103構(gòu)建成功；從圖9可見(jiàn)，pCW104Sal I ,Spe I雙酶切后在約1471bp和6826bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW104構(gòu)建成功。(4)構(gòu)建制備第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154用的中間重組質(zhì)粒PCW105 和 pCW106分別對(duì)步驟(I)得到的Li orfBAldh和步驟(3)步得到的pCW103及pCW104用Xba I和Not I雙酶切。Xba I和Not I雙酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer33 μ 1，10XBSA3y 1，基因樣品 15μ 1，Xba 10.6 μ 1，Not 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反應(yīng)lh。Li orfBAldh基因片段雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒pCW103及PCW104經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度分別為7442bp和7096bp的片段?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段按實(shí)施例1 (2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn) 行連接，Li orfBAldh與pCW103連接產(chǎn)物為PCW105 ；Li orfBAldh與pCW104連接產(chǎn)物為pCW106。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli ToplO0 陽(yáng)性菌(E.coli/pCW105 或 E.co/pCW106)在 LB-Amp 平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Xba I和Not I雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖10-圖11，從圖10可見(jiàn)，pCW105Xba I ,Not I雙酶切后在約1537bp和7442bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW105構(gòu)建成功；從圖11可見(jiàn)，pCW106Xba I ,Not I雙酶切后在約1537bp和7096bp處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，pCW106構(gòu)建成功。(5)從第一重組質(zhì)粒pCW203中擴(kuò)增PRRSV 0RF5基因片段I (序列見(jiàn)SEQ ID N0.1中(10)..(1050))以第一重組質(zhì)粒pCW203為模板作PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1, 4dNTPs (10mmol/L.種)0.4 μ I,上游引物(ΙΟμπιοΙ/L) (0RF5-l-f:5，-TATTGCGGCCGCC AGTGTG-3，)0.8μ 1，下游引物(lOymol/L)(0RF5-l-r5，-TATTGCGGCCGCCGAC TTATCATTTTCCTAATCTATTC’)0.8 μ 1，第一重組質(zhì)粒PCW203 樣品 0.8 μ 1，ultra pfu 0.25 μ I, ddH2019.45 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min —(94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin30s) X 30 個(gè)循環(huán)—72°C lOmin —4°C。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳后，在1069bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖12)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(6)構(gòu)建制備第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154用的中間重組質(zhì)粒PCW117 和 pCW118分別對(duì)步驟(5)得到的PRRSV 0RF5基因片段I和步驟(4)得到pCW105及pCW106用Not I酶切。Not I酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer32y l，10XBSA2y 1，基因樣品5 μ I, Not 10.4 μ 1，ddH2010.6 μ 1，37°C水浴反應(yīng) lh。PRRSV 0RF5 基因片段 I 酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒PCW105及pCW106經(jīng)酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，用通用型DNA純化回收試劑盒回收?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段按實(shí)施例I (2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，PRRSV 0RF5基因片段I與pCW105連接產(chǎn)物為PCW117 ；PRRSV 0RF5基因片段I與pCW106連接產(chǎn)物為pCW118。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli ToplO0 陽(yáng)性菌(E.coli/pCW117 或 E.coli/pCW118)在 LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Not I酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖13-圖14，從圖13可見(jiàn)，pCW117Not I酶切后在約1069bp和IOkb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW117構(gòu)建成功；從圖14可見(jiàn)，pCW118Not I酶切后在約1069bp和IOkb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW118構(gòu)建成功。(7)從 pCW117 中擴(kuò)增 PRRSV 0RF5 基因片段 2 (序列見(jiàn) SEQ ID N0.3 中(4692)..(5456))以重組質(zhì)粒pCW117為模板作PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:10Xultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.種)0.6μ1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (0RF5-2-f:5’ -ATAAAGATCTTAAAGCTGTT TATAATTTTGCTACTATGAAGGATCCATATCCATATGATGTTC-3’)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (5’ -ATAAGTCGACATCAAATTCAACACTTTTAAATTGATAAACTCCTTTATAA ATATCTGGTCCATTTAATCCCTCGAGGAGACGACCCC-3’)0.8 μ 1，pCW117 質(zhì)粒樣品 0.8 μ 1，ultra pfu 0.25 μ l，ddH2019.25 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min — (94°C 30s，54°C 30s,72°C 111^11)\30個(gè)循環(huán)一721: lOmin —4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在783bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖15)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(8)構(gòu)建第二重組質(zhì)粒PCW153和第三重組質(zhì)粒pCW154對(duì)步驟(7)得到的PRRSV 0RF5基因片段2用Bgl II和Sal I雙酶切，對(duì)步驟(6)得到pCW117及pCW118用BamH I和Xho I雙酶切。Bgl II和Sal I雙酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer32y 1，IOXBSA 2 μ 1，基因樣品 5 μ 1，Bgl II 0.4μ I,Sal 10.4 μ 1，ddH2010.2 μ 1，37 °C水浴反應(yīng)lh。BamH I和Xho I雙酶切體系和反應(yīng)條件為:10Xbuffer32y 1，10XBSA2y 1，基因樣品 5μ 1，BamH 10.4 μ I, Xho 10.4μ I,ddH2010.2μ 1，37°C水浴反應(yīng)Ih15PRRSV 0RF5基因片段2雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒PCW117及pCW118經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度分別為9346bp和9000bp的片段?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段按實(shí)施例1步驟(2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，PRRSV 0RF5基因片段2與pCW117連接產(chǎn)物為第二重組質(zhì)粒pCW153 (見(jiàn)圖16);PRRSV0RF5基因片段2與pCW118連接產(chǎn)物為pCW154(見(jiàn)圖17)。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli ToplO0 陽(yáng)性菌(E.coli/pCW153 或 E.coli/pCW154)在 LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用BamH1、Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖18，從圖18可見(jiàn)，pCW153和pCW154BamH1、Xho I雙酶切后在約628bp和9kb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW153和pCW154構(gòu)建成功。實(shí)施例3:制備第一重組菌Li IacZ和第二重組菌Li Δ actA IacZ(1)擴(kuò)增 IacZ 基因片段(序列見(jiàn) SEQ ID N0.1 中(8192)..(12171))以質(zhì)粒pHS-LV為模板PCR擴(kuò)增IacZ,反應(yīng)體系為:10 Xultra pfu buffer
2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.種)0.6 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (LacZ-f:5，-ATAAGCGGCCGCTAGCTTTAAGGCTAAATGCCG-3’)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L) (lacZ-r: 5’ -ATAAG CGGCCGCCTAGAGTGACTTTTATGTTGAG-3，)0.8 μ 1，pHS-LV 質(zhì)粒樣品 I μ I, ultra pfu 0.25 μ I,ddH2019.05 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min —(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 4min20s) X 20個(gè)循環(huán)—(94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 4min20s) XlO 個(gè)循環(huán)一72°C IOmin — 4°C。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在4001bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2)構(gòu)建制備Li 1&。2和1^八&(^4 1302用的中間重組質(zhì)?？?1107和口(^108分別對(duì)步驟(I)得到的IacZ和實(shí)施例2步驟(4)得到pCW105及pCW106用NotI酶切。Not I酶切體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例2中步驟(6)。IacZ基因片段酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒PCW105及pCW106經(jīng)酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，用通用型DNA純化回收試劑盒回收?；厥蘸蟮幕蚱魏唾|(zhì)粒片段按實(shí)施例1步驟(2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，IacZ與pCW105連接產(chǎn)物為pCW107 ；lacZ與pCW106連接產(chǎn)物為pCW108。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliToplO0陽(yáng)性菌(E.col/pCW107或E.col/pCW108)在表面涂有X-Gal的LB-Amp平板上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Not I酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖19，從圖19可見(jiàn)，pCW107和pCW108Not I酶切后在約4001bp和IOkb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，PCW107和pCW108構(gòu)建成功。(3)電轉(zhuǎn)化用Li感受態(tài)細(xì)胞的制備接種Li于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)12 16h。吸取12.5ml菌液至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至A_為0.4左右(約4h)，加入penicillin G (終濃度:12.5 μ g/ml )，繼續(xù)培養(yǎng)至A_為0.7左右(約2.5h)。轉(zhuǎn)移菌液于潔凈、無(wú)菌、預(yù)冷的250ml聚丙烯離心管中，置冰浴20min。4°C離心IOOOOr/min5min,棄上清。加入IOOml冰冷0.5mol/L鹿糖液重懸菌沉淀，于4°C離心10000r/min5min,棄上清，再用IOOml冰冷0.5mol/L蔗糖液洗2次。加入2ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重懸菌沉淀，分裝預(yù)冷無(wú)菌EP管(50 μ I/管)，立即于_70°C保存?zhèn)溆谩?br>
(4)質(zhì)粒 PCW107 和 PCW108 電轉(zhuǎn)化 Li從-70°C冰箱取出I支(3)步制備的Li細(xì)胞放于冰上融化，用預(yù)冷槍頭吸入在冰上預(yù)冷的重組質(zhì)粒PCW107或pCW1085 μ 1，用手指輕彈管底使液體混合均勻，置冰浴5min。用預(yù)冷槍頭將EP管內(nèi)全部液體吸入放冰浴預(yù)冷的電擊杯(間距0.1cm)樣品槽中，放冰上5min。取出電擊杯置于電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)電擊I次(電擊參數(shù)為2KV, 5ms),立即取出電擊杯放冰浴5min。加入750μ I于37°C預(yù)溫的0.5mol/L蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基于電擊杯中，輕輕用槍頭吹出樣品槽內(nèi)菌液并混勻，將電擊杯內(nèi)全部液體吸至無(wú)菌EP管中，于30°C 140rpm振蕩培養(yǎng)2h。將全部菌液滴于含紅霉素3 μ g/ml, X-gal 40 μ g/ml的BHI瓊脂平板(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BH1-Ery-X-gal平板)中央，用無(wú)菌L形玻棒將菌液涂布整個(gè)平板，于30°C培養(yǎng)48 72h，陽(yáng)性菌(Li/pCW107或Li/pCW108)生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。(5) Li/pCW107和Li/pCW108雙同源重組雜交培養(yǎng)Li/pCW107 或 Li/pCW108 劃線接種 BH1-Ery-X-gal 平板 42°C 培養(yǎng) 48h，長(zhǎng)出的藍(lán)色菌落再劃線接種BH1-Ery-X-gal平板，于42°C培養(yǎng)48h。挑取藍(lán)色菌落于2ml BHI液體培養(yǎng)基中，30°C 220rpm振蕩培養(yǎng)24h，吸取10 μ I菌液再轉(zhuǎn)種2ml BHI液體培養(yǎng)基中，300C 220rpm振蕩培養(yǎng)24h，重復(fù)上步(轉(zhuǎn)種)4次。取100 μ I菌液用PBS作10倍稀釋?zhuān)ˇ│?稀釋菌液涂布BH1-X-gal平板(含X-gal 40 μ g/ml的BHI瓊脂平板)和BH1-Ery-X-gal平板，每個(gè)平板上涂布稀釋菌液100 μ I。陽(yáng)性菌落LilacZ和Li Δ actA IacZ在BHI_X_gal平板上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生長(zhǎng)。(6) PCR 鑒定 Li IacZ 和 Li Λ actA IacZ用通用型柱式基因組提取試劑盒抽提Li IacZ和Li Λ actA IacZ基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增鑒定其中有無(wú)actA、orfBAldh、Ery和IacZ基因片段，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)Li IacZ和Li Δ actAlacZ的基因重組情況進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增actA反應(yīng)體系為:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (lOmmol/L.種)0.5 μ I,上游引物(10 μ mol/L) (Li actA-f:5，-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTC CC-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li actA-r: 5，-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’ ) 0.8 μ 1，Li/pCW107 或 Li/pCW108 基因組 DNA 樣品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 5min — (94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s)X 30個(gè)循環(huán)一72°C IOmin — 4°C。擴(kuò)增orfBAldh和Ery的反應(yīng)體系和反應(yīng)循環(huán)條件同實(shí)施例2(1)。擴(kuò)增IacZ的引物和反應(yīng)體系和反應(yīng)循環(huán)條件同實(shí)施例3中步驟(I)。Li IacZ和Li Λ actA IacZ的PCR鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖20。由圖可見(jiàn)，經(jīng)雙同源雜交培養(yǎng)，IacZ已整合入Li基因組，Li IacZ和Li Λ actA IacZ均不攜帶Ery基因，且Li Λ actA IacZ中的actA基因被剔除。鑒定結(jié)果符合預(yù)期，Li IacZ和Li AactA IacZ制備成功。實(shí)施例4:利用上述制備的重組質(zhì)粒和重組菌，將外源基因定點(diǎn)整合至Li基因組一、以 PRRSV 0RF6 基因(GenBank:AY885248.1)為外源擬整合基因(I)PCR擴(kuò)增上下游分別帶Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF6基因以質(zhì)粒pGBKT7-GP6為模板擴(kuò)增PRRSV 0RF6基因。反應(yīng)體系為:10Xultrapfu buffer 2.5 μ l,4dNTPs (10mmol/L.種)0.4μ1，上游引物(10 μ mol/L) (0RF6-f:5，-TATGTAAGCTTTGG GGTCGTCTTTAGATGAC-3，)0.8 μ 1，下游引物(10 μmol/L)(0RF6-r:5，-ATAACTCGAGCTT GGCATATTTGACAAGGTTTAC-3，)0.8 μ 1，pGBKT7_GP6 質(zhì)粒樣品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94 °C 3min —(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)父20個(gè)循環(huán)—(941: 30s, 66°C 30s, 72°C lmin) X 10 個(gè)循環(huán)一72°C IOmin — 4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在542bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2) PRRSV 0RF6基因插入第一重組質(zhì)粒PCW203 Hind IILXho I酶切位點(diǎn)之間分別對(duì)(1)步得到的PRRSV 0RF6基因片段和質(zhì)粒pCW203用Hind III和Xho I雙酶切。Hind III和Xho I雙酶切反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1步驟(2)。PRRSV 0RF6基因片段雙酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收。質(zhì)粒PCW203經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度為13053bp的片段。回收后的基因片段和質(zhì)粒片段按實(shí)施例1步驟(2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，得到中間重組質(zhì)粒(PCW203-0RF6)。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/pCW203-0RF6)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Hind III和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果如圖21，從圖21可見(jiàn)，在約542bp和大于IOkb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，中間重組質(zhì)粒PCW203-0RF6構(gòu)建成功。 (3) pCW203-0RF6的BamH1、Xho I片段替換第二重組質(zhì)粒pCW153或第三重組質(zhì)粒 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段
分別對(duì)(2)步得到的中間重組質(zhì)粒pCW203-0RF6和質(zhì)粒pCW153或pCW154用BamHI和Xho I雙酶切，酶切體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例2步驟(8)。pCW203-0RF6雙酶切產(chǎn)物作
0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度為592bp的片段。pCW153或pCW154經(jīng)雙酶切，并用堿性磷酸酶作去磷酸化處理后，作0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度分別為8945bp和8599bp的片段。pCW203_0RF6酶切回收片段與PCW153酶切回收片段按實(shí)施例1步驟(2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒(PCW153-0RF6);與pCW154酶切回收片段按實(shí)施例1 (2)中連接反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行連接，得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒(PCW154-0RF6)。目標(biāo)重組質(zhì)粒兩個(gè)Not I位點(diǎn)之間的gene cassette基因序列結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)。連接反應(yīng)液按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli ToplOo 陽(yáng)性菌(E.coli/pCW153_0RF6 或 E.coli/pCW154_0RF6)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用BamH I和Xho雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖22，從圖22可見(jiàn)，pCW153-0RF6和pCW154_0RF6酶切后均在約592bp和大于Skb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期相符，目標(biāo)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。(4)目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153-0RF6 或 pCW154-0RF6)電轉(zhuǎn)化 Li IacZ 或 LiAactAIacZ按實(shí)施例3步驟(3)方法制備電轉(zhuǎn)化用LilacZ或Li AactAlacZ感受態(tài)細(xì)胞。目標(biāo)重組質(zhì)粒按實(shí)施例3步驟(4)方法電轉(zhuǎn)化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,陽(yáng)性菌(LilacZ/PCW153-0RF6 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF6)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C培養(yǎng) 48 72h 后，生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF6 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF6 單、雙同源重組雜交培
養(yǎng)按實(shí)施例3步驟(5)方法進(jìn)行雙同源重組雜交培養(yǎng)。LilacZ/pCW153_0RF6經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第一目標(biāo)菌(L1-0RF6:0RF6基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)(見(jiàn)圖23) ；Li AactA lacZ/pCW154_0RF6經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF6:0RF6基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)(見(jiàn)圖24)。目標(biāo)菌在BH1-X-gal平板上長(zhǎng)成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生長(zhǎng)。(6) PCR鑒定目標(biāo)菌基因整合效果用通用型柱式基因組提取試劑盒抽提目標(biāo)菌(L1-0RF6和Li Δ actA_0RF6)基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增鑒定其中有無(wú)EryUacZ和PRRSV 0RF6基因片段，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)目標(biāo)菌基因整合情況進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增Ery的引物和反應(yīng)體系同實(shí)施例2步驟(1)，擴(kuò)增IacZ的引物和反應(yīng)體系同實(shí)施例3步驟(1)，擴(kuò)增PRRSV 0RF6的引物和反應(yīng)體系同本實(shí)施例“一”中的步驟(I)。L1-0RF6和LiAactA-0RF6的PCR鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖25。從圖中可見(jiàn)，Li_0RF6和Li Λ actA-0RF6基因組內(nèi)均不含Ery基因，表明目標(biāo)重組質(zhì)粒中兩個(gè)Not I位點(diǎn)以外的基因片段不能經(jīng)雙同源重組雜交整合至基因組；L1-0RF6和Li AactA-0RF6基因組內(nèi)均不含IacZ基因，表明經(jīng)雙同源重組 雜交培養(yǎng)后，LilacZ或Li AactA IacZ基因組內(nèi)原有的IacZ已被替換掉；LilacZ或Li Λ actA IacZ基因組內(nèi)均含有PRRSV 0RF6基因，表明經(jīng)雙同源重組雜交培養(yǎng)后，目標(biāo)重組質(zhì)粒中兩個(gè)Not I位點(diǎn)之間包括PRRSV 0RF6在內(nèi)的基因片段已整合至基因組內(nèi)。(7)western blot鑒定目標(biāo)菌外源整合基因在目標(biāo)菌中的蛋白表達(dá)和蛋白分泌效果①目標(biāo)囷蛋白樣品的制備分泌蛋白樣品的制備:接種目標(biāo)菌于2ml BHI液體培養(yǎng)基，于37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)12-16h。吸取100 μ I菌液至2ml BHI液體培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)至A600約為1.0左右(約5h)。將菌液轉(zhuǎn)至一干凈EP管，加入預(yù)冷的100%三氯醋酸(TCA) 200 μ 1，混勻后置冰浴30min。4°C離心10000rpm30min,棄上清,加入lml-20°C預(yù)冷丙酮洗漆沉淀，置冰浴IOmin0 4°C離心lOOOOrpmlOmin,棄上清，室溫干燥沉淀。加入100 μ I含4%SDS的0.5mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，瞬時(shí)離心，將上清液吸至另一干凈EP管，加入等倍體積的2XSDSPAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴煮沸5min，立即上樣20-30 μ I。非分泌蛋白樣品的制備:吸取1.5ml生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目標(biāo)重組菌于一干凈EP管中，離心13000rpmlmin,棄上清,加入Iml PBS重懸菌沉淀，離心13000rpmlmin,棄上清，加入150 μ I裂解緩沖液1(配方:0.5ml 0.lmol/L ρΗ7.0,磷酸鹽緩沖液，Ig蔗糖，IOmg溶菌酶，3.7ml ddH20)，于 37°C孵育 2h。加入1.35ml 裂解緩沖液 2 (配方:40 μ I lmol/L ρΗ8.0Tris-HCl 緩沖液，8 μ I 0.5mol/L ρΗ8.0 EDTA 緩沖液，800 μ I 10%SDS, 200 μ I lOmg/ml 鏈霉蛋白酶，3.2ml ddH20),于37°C孵育30min。加入155 μ I預(yù)冷的100%TCA,置冰浴30min。4°C離心10000rpm30min,棄上清,加入lml_20°C預(yù)冷丙酮洗漆沉淀,置冰浴lOmin。4°C離心IOOOOrpm lOmin,棄上清 ,室溫干燥沉淀。加入150 μ I PBS緩沖液重懸菌沉淀,再加入等體積的2XSDS PAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴煮沸5min，立即上樣20-30 μ I。②western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)和分泌效果按常規(guī)進(jìn)行western blot檢測(cè)，分離膠濃度:15%，一抗:抗HA標(biāo)簽小鼠單克隆(1:2000稀釋)或抗VSV-G標(biāo)簽小鼠單克隆抗體(1:2000稀釋)，二抗:山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP (1:5000稀釋)。結(jié)果見(jiàn)圖26。從圖可見(jiàn)，第一目標(biāo)菌(Li_0RF6)和第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF6)均表達(dá)了外源整合基因編碼蛋白，且表達(dá)的蛋白大部分能分泌到胞外。二、以 PRRSV 0RF3 基因(GenBank:AY885248.1)為外源擬整合基因(I) PCR擴(kuò)增上下游分別帶Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF3基因以質(zhì)粒pRK5-GP3為模板擴(kuò)增PRRSV 0RF3基因。反應(yīng)體系為:10 Xultrapfu buffer 2.5 μ l,4dNTPs (10mmol/L.種)0.4μ1，上游引物(10 μ mol/L) (0RF3-f:5，-CGCGTAAGCTTTGGTTAA TAGCTGTACATTCCTC-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L)(0RF3-r:5，-ATAACTCGAGTCGC CGTACGGCACTGAG-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP3 質(zhì)粒樣品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ l,ddH20 19.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min — (94°C 30s, 55°C 30s,72°C 111^11)\20個(gè)循環(huán)—(941: 30s, 68°C 30s, 72°C lmin) X 10 個(gè)循環(huán)—72°C lOmin —4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在782bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖1 )。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2) PRRSV 0RF3基因插入第一重組質(zhì)粒pCW203 Hind II1、Xho I酶切位點(diǎn)之間按本實(shí)施例“一”中的步驟(2)方法進(jìn)行，得到中間重組質(zhì)粒(pCW203-0RF3)。按實(shí)施例I步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/pCW203_0RF3)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用HindIII和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定。
(3) pCW203-0RF3 的 BamH1、Xho I 片段替換或 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段按本實(shí)施例“一”中的步驟(3)方法進(jìn)行。pCW203-0RF3的BamH1、Xho I片段與pCW153BamH1、Xho I片段替換后得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153_0RF3)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段與pCW154BamH1、Xho I片段替換后得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒(PCW154-0RF3)。按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/PCW153-0RF3或E.coli/pCW154_0RF3)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用BamH I和Xho雙酶切進(jìn)行鑒定。(4)目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153-0RF3 或 pCW154-0RF3)電轉(zhuǎn)化 Li IacZ 或 Li AactAIacZ按實(shí)施例3步驟(3)方法制備電轉(zhuǎn)化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受態(tài)細(xì)胞。目標(biāo)重組質(zhì)粒按實(shí)施例3步驟(4)方法電轉(zhuǎn)化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,陽(yáng)性菌(LilacZ/pCW153 - 0RF3 或 Li Λ actA lacZ/pCW154-0RF3)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C 培養(yǎng) 48 72h后，生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF3 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF3 單、雙同源重組雜交培
養(yǎng)按實(shí)施例3步驟(5)方法進(jìn)行雙同源重組雜交培養(yǎng)。LilacZ/pCW153_0RF3經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第一目標(biāo)菌(L1-0RF3:0RF3基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)；Li Δ actAlacZ/pCW154-0RF3經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF3:0RF3基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)。目標(biāo)菌在BH1-X-gal平板上長(zhǎng)成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生長(zhǎng)。

(6) PCR鑒定目標(biāo)菌基因整合效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(6)方法進(jìn)行。擴(kuò)增PRRSV 0RF3的引物和反應(yīng)體系同本實(shí)施例“二”中的步驟(I)。(7)western blot鑒定目標(biāo)菌外源整合基因在目標(biāo)菌中的蛋白表達(dá)和蛋白分泌效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(7)方法進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)圖26。從圖可見(jiàn)，第一目標(biāo)菌(L1-0RF3)和第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF3)均表達(dá)了外源整合基因編碼蛋白，且表達(dá)的蛋白大部分能分泌到胞外。三、以PRRSV 0RF4基因(GenBank:AY885248.1)為外源擬整合基因(I)PCR擴(kuò)增上下游分別帶Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)的PRRSV 0RF4基因以質(zhì)粒pRK5-GP4為模板擴(kuò)增PRRSV 0RF4基因，反應(yīng)體系為:10 X ultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (lOmmol/L.種)0.4μ1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (0RF4_f:5，-TATGTAAGCTTTGGCTT CGTCCCTTCTTTT (Χ-3，)0.8μ1，下游引物(10 μ mol/L)(0RF4-r:5，-ATAACTCGAG AATTGCCAACAGAATGGCAAAAAG-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP4 質(zhì)粒樣品0.75 μ I, ultra pfu 0.25 μ I，ddH2019.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min — (94°C 30s，55 °C 30s, 72 °C lmin) X 20 個(gè)循環(huán)一(94 °C 30s, 66 °C 30s, 72 °C lmin) X 10 個(gè)循環(huán)—72°C IOmin — 4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在554bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。
(2) PRRSV 0RF4基因插入第一重組質(zhì)粒pCW203 Hind II1、Xho I酶切位點(diǎn)之間按本實(shí)施例“一”中的步驟(2)步方法進(jìn)行，得到中間重組質(zhì)粒(PCW203-0RF4)。按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.col/pCW203_0RF4)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Hind III和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定。(3) pCW203-0RF4 的 BamH1、Xho I 片段替換或 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段按本實(shí)施例“一”中的步驟(3)步方法進(jìn)行。PCW203-0RF4的BamH1、Xho I片段與pCW153BamH1、Xho I片段替換后得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153_0RF4)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段與pCW154BamH1、Xho I片段替換后得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒(PCW154-0RF4)。按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/PCW153-0RF4或E.coli/pCW154_0RF4)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用BamH I和Xho雙酶切進(jìn)行鑒定。(4)目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153-0RF4 或 pCW154-0RF4)電轉(zhuǎn)化 Li IacZ 或 Li AactAIacZ按實(shí)施例3步驟(3)方法制備電轉(zhuǎn)化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受態(tài)細(xì)胞。目標(biāo)重組質(zhì)粒按實(shí)施例3步驟(4)方法電轉(zhuǎn)化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,陽(yáng)性菌(LilacZ/PCW153-0RF4 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF4)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C培養(yǎng) 48 72h 后，生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF4 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF4 單、雙同源重組雜交培
養(yǎng)

按實(shí)施例3步驟(5)步方法進(jìn)行雙同源重組雜交培養(yǎng)。LilacZ/pCW153_0RF4經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第一目標(biāo)菌(L1-0RF4:0RF4基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)；Li Δ actAlacZ/pCW154-0RF4經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF4:0RF4基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)。目標(biāo)重組菌在BH1-X-gal平板上長(zhǎng)成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生長(zhǎng)。(6) PCR鑒定目標(biāo)重組菌基因整合效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(6)方法進(jìn)行。擴(kuò)增PRRSV 0RF4的引物和反應(yīng)體系同實(shí)施例4、三、(I)。(7) westernblot鑒定目標(biāo)菌外源整合基因在目標(biāo)菌中的蛋白表達(dá)和蛋白分泌效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(7)方法進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)圖26。從圖可見(jiàn)，第一目標(biāo)菌(L1-0RF4)和第二目標(biāo)菌(LiAactA-0RF4)均表達(dá)了外源整合基因編碼蛋白，且表達(dá)的蛋白大部分能分泌到胞外。四、以結(jié)核桿菌Rv0129基因(GenBank:AL123456.2)為外源擬整合基因(I)PCR擴(kuò)增上下游分別帶Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)的Rv0129基因以質(zhì)粒pET_Ag85c為模板擴(kuò)增Rv0129基因，反應(yīng)體系為:10Xultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.種)0.4 μ 1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (Rv0129-f:5，-GCTCAAGCTTTCTCTAGGCC CGGTCTTCC-3，)0.8 μ I，下游引物(lOymol/L)(Rv0129-r:5，-AATACTCGAGGGCGGCCG GAGCAGCAG-3，)0.8 μ l，pET_Ag85c質(zhì)粒樣品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)條件為:94°C 3min — (94°C 30s, 56°C 30s,72°C 111^11)\20個(gè)循環(huán)—(941: 30s, 70°C 30s, 72°C lmin) X 10 個(gè)循環(huán)—72°C lOmin —4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在901bp處可見(jiàn)一條特異條帶，與預(yù)期相符(見(jiàn)圖27)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定合格。(2)Rv0129基因插入第一重組質(zhì)粒pCW203 HindII1、Xho I酶切位點(diǎn)之間按本實(shí)施例“一”中的步驟(2)方法進(jìn)行，得到中間重組質(zhì)粒(pCW203-Rv0129)。按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/pCW203_Rv0129)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用Hind III和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定。(3)pCW203-Rv0129 的 BamH I, Xho I 片段替換或 pCW154 的 BamH I, Xho I 片段按本實(shí)施例“一”中的步驟(3)方法進(jìn)行。pCW203_Rv0129的BamH1、Xho I片段與pCW153BamH I,Xho I片段替換后得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153_Rv0129)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段與pCW154BamH1、Xho I片段替換后得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW154-Rv0129)o按實(shí)施例1步驟(2)中方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli ToplO0陽(yáng)性菌(E.coli/pCW153-Rv0129或E.coli/pCW154_Rv0129)在LB-Amp平板上長(zhǎng)成白色菌落。提取陽(yáng)性菌中含有的重組質(zhì)粒，用BamH I和Xho雙酶切進(jìn)行鑒定。(4)目標(biāo)重組質(zhì)粒(pCW153-RvO 129 或 pCW154_RvO 129 )電轉(zhuǎn)化 Li IacZ 或 Li Λ actAIacZ按實(shí)施例3(3)步方法制備電轉(zhuǎn)化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受態(tài)細(xì)胞。目標(biāo)重組質(zhì)粒按實(shí)施例3步驟(4)中方法電轉(zhuǎn)化LilacZ或Li Λ actA IacZ菌，陽(yáng)性菌(LilacZ/pCW153-Rv0129 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_RvO 129 )于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C 培養(yǎng) 48 72h后，生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。 (5) LilacZ/pCW153-Rv0129 或 Li Λ actA lacZ/pCW154-Rv0129 單、雙同源重組雜
交培養(yǎng)按實(shí)施例3步驟(5)中方法進(jìn)行雙同源重組雜交培養(yǎng)。LilacZ/pCW153_Rv0129經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第一目標(biāo)菌(L1-Rv0129:Rv0129基因替換了 IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)；Li AactA lacZ/pCW154-Rv0129經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)的結(jié)果為得到第二目標(biāo)菌(LiAactA-RV0129:Rv0129基因替換了IacZ基因，且定點(diǎn)整合至細(xì)菌基因組內(nèi)orfBAldh基因上游)。目標(biāo)菌在BH1-X-gal平板上長(zhǎng)成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生長(zhǎng)。(6) PCR鑒定目標(biāo)重組菌基因整合效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(6)方法進(jìn)行。擴(kuò)增Rv0129的引物和反應(yīng)體系同本實(shí)施例“四”中的步驟(I)。(7)western blot鑒定目標(biāo)菌外源整合基因在目標(biāo)菌中的蛋白表達(dá)和蛋白分泌效果按本實(shí)施例“一”中的步驟(7)方法進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)圖26。從圖可見(jiàn)，第一目標(biāo)菌(L1-Rv0129)和第二目標(biāo)菌(LiAactA-Rv0129)均表達(dá)了外源整合基因編碼蛋白，且表達(dá)的蛋白大部分能分泌到胞外。
權(quán)利要求
1.一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于包括以下步驟: (I)將從含有擬整合外源基因的生物基因組模板或基因克隆質(zhì)粒庫(kù)內(nèi)PCR擴(kuò)增得到的上游帶Hind III酶切位點(diǎn)、下游帶Xho I酶切位點(diǎn)的外源擬整合基因，插入第一重組質(zhì)粒的Hind III酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到中間重組質(zhì)粒，所述第一重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1所示； (2 )切下步驟(I)得到的中間重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間的片段插入第二重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到第一目標(biāo)重組質(zhì)粒，所述第二重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.2所示； 或切下步驟(I)得到的中間重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間的片段插入第三重組質(zhì)粒的BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到第二目標(biāo)重組質(zhì)粒，所述第三重組質(zhì)粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)將步驟(2)得到的第一 目標(biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第一重組菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第一目標(biāo)菌，所述第一重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表達(dá)半乳糖苷酶，在含5-溴_4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落，所述第一目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白； 或?qū)⒉襟E(2)得到的第二目標(biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第二重組菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第二目標(biāo)菌，所述第二重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)無(wú)actA基因和plcB基因，且在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表達(dá)β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上長(zhǎng)成藍(lán)色菌落，所述第二目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)無(wú)actA基因和plcB基因，且在其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第一重組質(zhì)粒的步驟如下: (1)擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒包膜蛋白GP5編碼基因0RF5的基因片段，其上游帶Hind III酶切位點(diǎn)，下游帶Xho I酶切位點(diǎn)； (2)將步驟(I)所述0RF5基因片段插入質(zhì)粒pHS-LV的HindIII酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第一重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第二重組質(zhì)粒的步驟如下: (1)擴(kuò)增上游帶HindIII酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的綿羊李斯特菌orfXYZ基因，并將所述orfXYZ基因插入質(zhì)粒pHS-LV的Hind III酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間； (2)擴(kuò)增上游帶SalI酶切位點(diǎn)、下游帶SpeI酶切位點(diǎn)的Ery基因，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質(zhì)粒的Sal I酶切位點(diǎn)與Spe I酶切位點(diǎn)之間； (3)擴(kuò)增上游帶XbaI酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的綿羊李斯特菌orfBAldh基因，并將所述orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質(zhì)粒的Xba I酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間；(4)從權(quán)利要求1所述第一重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上下游分別帶NotI酶切位點(diǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因片段1，并將所述0RF5基因片段I插入步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)； (5)從步驟(4)所得重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上游帶BglII酶切位點(diǎn)、下游帶Sal I酶切位點(diǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因片段2，并將所述0RF5基因片段2插入步驟(4)所得重組質(zhì)粒BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第二重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第三重組質(zhì)粒的步驟如下: (1)擴(kuò)增上游帶HindIII酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的綿羊李斯特菌mpl基因，并將所述mpl基因插入質(zhì)粒pHS-LV的Hind III酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間； (2)擴(kuò)增上游帶SalI酶切位點(diǎn)、下游帶SpeI酶切位點(diǎn)的Ery基因，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質(zhì)粒的Sal I酶切位點(diǎn)與Spe I酶切位點(diǎn)之間； (3)擴(kuò)增上游帶XbaI酶切位點(diǎn)、下游帶Not I酶切位點(diǎn)的綿羊李斯特菌orfBAldh基因，并將所述orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質(zhì)粒的Xba I酶切位點(diǎn)與Not I酶切位點(diǎn)之間； (4)從權(quán)利要求1所述第一重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上下游分別帶NotI酶切位點(diǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因片段1，并將所述0RF5基因片段I插入步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)； (5)從步驟(4)所得重組質(zhì)粒中擴(kuò)增上游帶BglII酶切位點(diǎn)、下游帶Sal I酶切位點(diǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因片段2，并將所述0RF5基因片段2插入步驟(4)所得重組質(zhì)粒BamH I酶切位點(diǎn)與Xho I酶切位點(diǎn)之間，即得第三重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第一重組菌的步驟如下: (1)擴(kuò)增上、下游分別帶NotI酶切位點(diǎn)的IacZ基因片段，并將所述IacZ基因片段插入權(quán)利要求3中制備第二重組質(zhì)粒的步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)； (2)將步驟(I)所得重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化綿羊李斯特菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，即得到第一重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第二重組菌的步驟如下: (1)擴(kuò)增上、下游分別帶NotI酶切位點(diǎn)的IacZ基因片段，并將所述IacZ基因片段插入權(quán)利要求4中制備第三重組質(zhì)粒的步驟(3)所得重組質(zhì)粒的Not I酶切位點(diǎn)； (2)將步驟(I)所得重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化綿羊李斯特菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，即得到第二重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于所述外源基因?yàn)椴缓琀ind II1、Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于所述外源基因?yàn)樨i繁殖與呼吸綜合征病毒0RF6基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF3基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF4基因、結(jié)核桿菌Rv0129基因中的一種。
9.權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述方法得到的第一目標(biāo)菌，或權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述方法得到 的第二目標(biāo)菌。
全文摘要
一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，將第一目標(biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第一重組菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第一目標(biāo)菌，所述第一目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白；或?qū)⒌诙繕?biāo)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化第二重組菌，然后將轉(zhuǎn)化得到的菌經(jīng)單、雙同源重組雜交培養(yǎng)，得到第二目標(biāo)菌，所述第二目標(biāo)菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內(nèi)無(wú)actA基因和plcB基因，且在其基因組內(nèi)orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩(wěn)定表達(dá)和分泌外源基因編碼蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/74GK103074361SQ201310044170
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
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