一種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種慢病毒載體，尤其是一種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載體及 其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢病毒載體是由人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV)改造而 來，它最大限度的消除了 HIV的致病性，且不能自我復(fù)制，帶有人工合成的外源基因和人工 改良的病毒外衣。慢病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是1)可以感染多種細(xì)胞系，包括分裂與非分裂時(shí)期的 細(xì)胞；2)極小的毒性和免疫反應(yīng)；3)高效率地整合到宿主基因組內(nèi)，形成穩(wěn)定的外源基因 表達(dá)，非常適合建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠和人ES細(xì)胞系。
[0003] 常規(guī)基因研究的主要方法是將外源基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)使其過表達(dá)，或者通過基因 敲除和RNA干擾方法使其低表達(dá)，然后分析細(xì)胞以及生物體所發(fā)生的表型改變和內(nèi)在基因 表達(dá)變化，從而推斷基因的功能和作用。如今隨著人類基因組圖譜基本完成，后續(xù)研究重點(diǎn) 已經(jīng)從基因水平移到了蛋白水平，人們發(fā)現(xiàn)蛋白的后修飾和突變比基因組更加復(fù)雜，也更 重要。常規(guī)的單純過表達(dá)人工改造的基因并不能消除內(nèi)源基因的干擾，而單純RNA干擾又 不能研究具體哪一個(gè)氨基酸在該蛋白中的發(fā)揮著重要作用。如果同時(shí)進(jìn)行RNA干擾和過表 達(dá)人工改造的基因，常規(guī)方法需要用兩步法先后干擾和過表達(dá)基因，操作非常繁瑣。而且如 果該基因?qū)?xì)胞存活極其重要，往往無法得到干擾或過表達(dá)的中間產(chǎn)物，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)無法 進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種一步法高效替換細(xì)胞內(nèi)基因的慢病 毒載體及其構(gòu)建方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案：這種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載 體具有以下結(jié)構(gòu)：采用載體PLL3. 7、pUC18和Iv-Lin28-GFP (上海斯丹賽）作為原始質(zhì)粒， 在慢病毒5'和3'LTR中間插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄一段shRNA序列，shRNA插入?yún)^(qū)含有 BamHI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，可插入退火后的shRNA序列；EFla啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Flag標(biāo)簽融 合的外源基因，F(xiàn)lag標(biāo)簽融合在外源基因的N端，多克隆位點(diǎn)含有HpaI、EcoRI和NheI3種 酶切位點(diǎn)用于插入外源基因，其中HpaI為平末端酶切，保證任何基因都可以插入；IRES用 于啟動(dòng)表達(dá)EGFP報(bào)告基因；實(shí)現(xiàn)一條由EFla轉(zhuǎn)錄的RNA可以產(chǎn)生兩個(gè)蛋白，即過表達(dá)外源 蛋白和EGFP。
[0006] 這種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：
[0007] DpUC-EFla-IRES-EGFP載體的構(gòu)建：對(duì)EFla-IRES-EGFP元件進(jìn)行克隆，將克隆得 到的EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI雙酶切，選擇pUC18作為原始質(zhì)粒，用EcoRI和PstI 雙酶切，將回收得到的質(zhì)粒和酶切好的EFla-IRES-EGFP元件進(jìn)行連接；
[0008] 2)pLL3. 7-CQ載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)合成正反向引物 ENZYfl (5, -TGGATCCGCGCGGTGACC-3'）和 ENZYrl (5, -TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3'）用于 形成shRNA插入位點(diǎn)，正反向雙鏈的退火，選擇慢病毒載體pLL3. 7作為原始質(zhì)粒，用HpaI 和XhoI雙酶切，退火產(chǎn)物和酶切好的載體連接；
[0009] 3)pUC-Flag-EGFP 載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)合成正反向引物 FlagF(5' -GATCAGCCACCATGG ACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3'）和 FlagR (5' -CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATC GTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3'）用于形成帶有Flag標(biāo)簽的多克隆位點(diǎn)，正反向雙鏈的退 火，選擇PUC-EFla-IRES-EGFP作為原始質(zhì)粒，用BamHI和NheI雙酶切，退火產(chǎn)物和酶切好 的載體連接；
[0010] 4) PLenti-FlagN-ShRNA 載體的構(gòu)建：對(duì) EFla-Flag-EGFP 元件進(jìn)行克隆，前面 PCR 克隆得到的EFla-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，選擇慢病毒載體pLL3. 7-CQ作為原始質(zhì)粒， 用NsiI和PvuII雙酶切，將回收得到的質(zhì)粒和酶切好的EFla-Flag-EGFP元件進(jìn)行連接，最 終獲得插入序列和方向均正確的載體即pLenti-FlagN-shRNA。
[0011] 發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明通過shRNA干擾技術(shù)將內(nèi)源基因進(jìn)行RNA干擾，同時(shí)又 能夠過表達(dá)外源經(jīng)過改造的同一個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)用人工改造的基因替代生物體內(nèi)原有基因， 該載體為慢病毒載體，可以高效整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，長(zhǎng)期高效發(fā)揮基因替代功能，克服了以 往載體的缺點(diǎn)，提供了 一種快速、1?效的細(xì)胞內(nèi)基因改造的手段。
【附圖說明】
[0012] 圖 1 是 pLenti-FlagN-shRNA 的結(jié)構(gòu)不意圖；
[0013] 圖2是將病毒感染后的NCCIT在熒光顯微鏡下觀察和拍照示意圖；
[0014] 圖3是Western Blot檢測(cè)內(nèi)源0ct4的干擾和外源0ct4的表達(dá)情況示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0016] 如圖1所示，本發(fā)明的慢病毒載體pLenti-FlagN-shRNA具有以下結(jié)構(gòu)： 慢病毒5'和3' LTR中間插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄一段shRNA序列，shRNA插入?yún)^(qū) (ggatccgcgcggtgaccctcgag)含有BamHI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，可插入退火后的shRNA序列。 EFla啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Flag標(biāo)簽融合的外源基因，F(xiàn)lag標(biāo)簽融合在外源基因的N端，多克隆 位點(diǎn)（GTTAACGAATTCGCTAGC)含有Hpal、EcoRI和NheI3種酶切位點(diǎn)用于插入外源基因，其 中HpaI為平末端酶切，保證任何基因都可以插入。IRES(Internal ribosome entry site, IRES)又被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列，用于啟動(dòng)表達(dá)EGFP報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)一條由EFla轉(zhuǎn)錄 的RNA可以產(chǎn)生兩個(gè)蛋白--過表達(dá)外源蛋白和EGFP。
[0017] 該慢病毒載體通過以下方法構(gòu)建：
[0018] DpUC-EFla-IRES-EGFP 載體的構(gòu)建
[0019] I. I. EFla-IRES-EGFP 元件的克隆
[0020] 選擇慢病毒載體Iv-Lin28-GFP作為原始質(zhì)粒，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物IinFl (5'-G￡ AATTCACAAATGGCAGTATTCATCCACAA-3' )和 IinRl(5, -AAACTGCAG CGGCAGGCGGGGAGGC-3'）。 然后以Iv-Lin28-GFP作為PCR模板，IinFl和IinRI為引物，用高保真pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。PCR熱循環(huán)程序如下：94°C變性5min，30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94°C變性30s，64°C退火30s，72°C 延伸6min)，最后72°C保溫lOmin。
[0021] PCR產(chǎn)物跑電泳，用Axyprep DNA Gel Extraction Kit回收約3K的條帶，即 EFla-IRES-EGFP。通過測(cè)定其紫外吸收值計(jì)算濃度?；厥债a(chǎn)物保存于-20°C。
[0022] 1. 2.前面克隆得到的EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI酶切
[0023] 在一根I. 5ml離心管內(nèi)分別加入以下成分
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載體，其特征是：這種慢病毒載體具有以下結(jié) 構(gòu)：在慢病毒5'和3' LTR中間插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄一段shRNA序列，shRNA插入?yún)^(qū)含有 BamHI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，可插入退火后的shRNA序列；EFla啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Flag標(biāo)簽融 合的外源基因，F(xiàn)lag標(biāo)簽融合在外源基因的N端，多克隆位點(diǎn)含有HpaI、EcoRI和NheI3種 酶切位點(diǎn)用于插入外源基因，其中HpaI為平末端酶切，保證任何基因都可以插入；IRES用 于啟動(dòng)表達(dá)EGFP報(bào)告基因；實(shí)現(xiàn)一條由EFla轉(zhuǎn)錄的RNA可以產(chǎn)生兩個(gè)蛋白，即過表達(dá)外源 蛋白和EGFP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟是： 1. pUC-EF I a-1RES-EGFP載體的構(gòu)建：對(duì)EFI a-1RES-EGFP元件進(jìn)行克隆，將克隆得到的 EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI雙酶切，選擇pUC18作為原始質(zhì)粒，用EcoRI和PstI雙酶 切，將回收得到的質(zhì)粒和酶切好的EFla-IRES-EGFP元件進(jìn)行連接； 2. pLL3. 7-CQ載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)合成正反向引物ENZYfl，其序列為 5' -TGGATCCGCGCGGTGACC-3'，和 ENZYrl，其序列為 5' -TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3'，用于 形成shRNA插入位點(diǎn)，正反向雙鏈的退火，選擇慢病毒載體pLL3. 7作為原始質(zhì)粒，用HpaI 和XhoI雙酶切，退火產(chǎn)物和酶切好的載體連接； 3. pUC-Flag-EGFP 載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)合成正反向引物 FlagF(5' -GATCAGCCACCATGGACTA CAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3'）和 FlagR(5'-CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATCGTC GTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3'）用于形成帶有Flag標(biāo)簽的多克隆位點(diǎn)，正反向雙鏈的退火， 選擇pUC-EFla-IRES-EGFP作為原始質(zhì)粒，用BamHI和NheI雙酶切，退火產(chǎn)物和酶切好的載 體連接； 4. pLenti-FlagN-shRNA載體的構(gòu)建：對(duì)EFla-Flag-EGFP元件進(jìn)行克隆，前面PCR克隆 得到的EFla-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，選擇慢病毒載體pLL3. 7-CQ作為原始質(zhì)粒，用 NsiI和PvuII雙酶切，將回收得到的質(zhì)粒和酶切好的EFla-Flag-EGFP元件進(jìn)行連接，最終 獲得插入序列和方向均正確的載體即PLenti-FlagN-shRNA。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型替代內(nèi)源基因表達(dá)的慢病毒載體，在慢病毒5’和3'LTR中間插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄一段shRNA序列，shRNA插入?yún)^(qū)含有BamHI和XhoI雙酶切位點(diǎn)，可插入退火后的shRNA序列；EFla啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)Flag標(biāo)簽融合的外源基因，F(xiàn)lag標(biāo)簽融合在外源基因的N端，多克隆位點(diǎn)含有HpaI、EcoRI和NheI3種酶切位點(diǎn)用于插入外源基因，其中HpaI為平末端酶切，保證任何基因都可以插入；IRES用于啟動(dòng)表達(dá)EGFP報(bào)告基因；實(shí)現(xiàn)一條由EFla轉(zhuǎn)錄的RNA可以產(chǎn)生兩個(gè)蛋白，即過表達(dá)外源蛋白和EGFP。本發(fā)明克服了以往載體的缺點(diǎn)，提供了一種快速、高效的細(xì)胞內(nèi)基因改造的手段。
【IPC分類】C12N15-66, C12N15-867
【公開號(hào)】CN104805119
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410034811
【發(fā)明人】陳齊, 劉軍, 謝丹
【申請(qǐng)人】杭州紐貝生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2014年1月23日