一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的普魯蘭酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的普魯蘭酶突變體，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 普魯蘭酶是解支酶的一種，能水解的最小底物只需兩條由α-1，6糖巧鍵連接的 含有兩個(gè)由α-1,4糖巧鍵連接的葡萄糖鏈段。由于淀粉結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在淀粉解聚為低 聚糖或小分子單糖的過(guò)程中必須由多種酶協(xié)同作用。在淀粉糖化過(guò)程中，由于糖化酶對(duì) α-1，6糖巧鍵的作用有限，因此目前雙酶法生產(chǎn)淀粉糖制品的最高轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到96%。 如果在糖化過(guò)程中添加普魯蘭酶與糖化酶協(xié)同作用，則可將轉(zhuǎn)化率提高到97%W上，并提 高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
[0003] 對(duì)普魯蘭酶的首次報(bào)道是在1943年，而普魯蘭酶的研究熱潮始于1966年，Bender 和Wallenfels首次通過(guò)產(chǎn)氣桿菌Klebsiellaaerogenes發(fā)酵獲得普魯蘭酶。到目前為止， 已經(jīng)從芽抱桿菌、產(chǎn)氣氣桿菌、放線菌，鏈球菌、鏈霉及一些嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶，不同來(lái) 源的普魯蘭酶，酶學(xué)性質(zhì)也各有不同。由于糖化酶的作用條件具有高溫（55°C-65°C)和 弱酸性（pH4. 5-5. 5)的特點(diǎn)，所W大多數(shù)天然的普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)限制了其在工業(yè)生 產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0004]I型普魯蘭酶是糖巧水解酶13家族的成員之一，該家族成員的主要的催化部位 由四個(gè)結(jié)構(gòu)域A、B、C、F構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域A是由8個(gè)β-折疊、8個(gè)α-螺旋構(gòu)成的中央催化 的（β/α)8折疊桶結(jié)構(gòu)，該區(qū)域包含了催化Ξ聯(lián)體（Asp,Asp,Glu)。較小的結(jié)構(gòu)域Β插入 (0/α)8折疊桶的第Ξ個(gè)β-折疊和第Ξ個(gè)α-螺旋的中間，活性口袋正位于該結(jié)構(gòu)域， 且（β/α)8折疊桶桶壁也由該結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。由8個(gè)β-折疊形成希臘鑰匙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是結(jié) 構(gòu)域C的特征性結(jié)構(gòu)。而F結(jié)構(gòu)域由一個(gè)小的a螺旋和6個(gè)β-折疊，折疊形成的βΞ明 治基序的β-反平行片層。結(jié)構(gòu)域A的C端和Ν端分別連接著結(jié)構(gòu)域C和結(jié)構(gòu)域F。 W05]GH13家族的酶蛋白的氨基酸序列中幾乎都含有四段高度保守的序列 巧egionl-IV)。所有I型普魯蘭酶幾乎都含有一段保守序列ReginA燈NWGYD巧。運(yùn)段序列 位于酶的中部，只與底物中的α-1,6糖巧鍵相結(jié)合。
[0006]對(duì)來(lái)源于Κ.aerogenes的I型普魯蘭酶中的HiS-607、Asp-677、HiS-682 和 His-833進(jìn)行突變后，His-607、Asp-677和His-833氨基酸改變后的酶蛋白活性完全喪失， 而化S-682的替換并不影響酶活性，對(duì)運(yùn)些突變株進(jìn)行α-或β-環(huán)糊精的結(jié)合親和力分 析，發(fā)現(xiàn)化S-607,Asp-677的改變對(duì)普魯蘭酶與底物普魯蘭多糖的結(jié)合力產(chǎn)生負(fù)面影響， 但是化S-833的改變并沒(méi)有對(duì)普魯蘭酶與底物的結(jié)合產(chǎn)生影響，表明化S-607,Asp-677是 與普魯蘭酶結(jié)合底物相關(guān)的位點(diǎn)，而His-833影響著普魯蘭酶的催化功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明利用定點(diǎn)突變獲得耐熱性和催化效率提高的普魯蘭酶 突變體。本發(fā)明采用全質(zhì)粒PCR的方法對(duì)581位苯丙氨酸進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得了熱穩(wěn) 定性和催化活性同時(shí)提高的突變酶F581L和巧81V，解決了普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性不能滿足 糖化反應(yīng)條件的問(wèn)題，為拓寬普魯蘭酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種普魯蘭酶突變體，所述突變體的氨基酸序列是
[0009] (1)沈QIDNO: 1或沈QIDNO: 2所示的序列；
[0010] 似在嚴(yán)格條件下與（1)限定的氨基酸序列雜交且編碼具有普魯蘭酶活性的氨基 酸序列。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體是對(duì)K.variicola來(lái)源的普魯蘭酶進(jìn)行 氨基酸突變得到的。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體是將K.variicolaSHN-1來(lái)源的普魯蘭 酶（NCBI上GenBankaccessionno.JX087429)的第581位氨基酸突變成疏水性氨基酸。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變，是突變成鄉(xiāng)氨酸或亮氨酸。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體的核巧酸序列是SEQIDNO:3或SEQID NO:4所示的序列。
[0015] 本發(fā)明還要求保護(hù)編碼所述突變體的核巧酸片段、含有編碼權(quán)利要求1所述突 變體的基因的載體、表達(dá)所述突變體的基因工程菌（尤其是大腸桿菌、酵母或枯草芽抱桿 菌），W及所述突變體在食品、化工或紡織領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0016] 突變體命名方式：
[0017] 采用"原始氨基酸位置替換的氨基酸"來(lái)表示突變體。如S234F，表示位置234的 氨基酸由親本普魯蘭酶的Ser替換成化e，位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于親本普魯蘭酶的氨基酸序列。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過(guò)K.variicolaSHN-1普魯蘭酶化vPul)的地e581進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變， 獲得熱穩(wěn)定性和催化活性同時(shí)提高的突變酶巧81L和巧81V。F581L和巧81V的最適溫度 由53°C提高到56°C，在55°C下的半衰期分別比野生型提高了 4. 20min、3.Olmin。同時(shí)，與野 生型相比，F(xiàn)581L和巧81V的VmJ直分別提高至2. 78倍、2. 85倍，k。。,/枯值提高至1. 6倍， 表明本發(fā)明的突變體擁有更高的催化效率。同時(shí)，本發(fā)明的突變體的最適抑沒(méi)有變化，具 有更高熱穩(wěn)定性、更高催化效率、未改變最適抑的普魯蘭酶更適合糖化中應(yīng)用。
[0020] 普魯蘭酶測(cè)定方法： 陽(yáng)02U 取100μL用lOOmM、pH5. 0的醋酸緩沖適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于lOOmM、 pH5.0醋酸緩沖中的lOg/L普魯蘭多糖相混合于50°C水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑 300μL搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出W流動(dòng)水迅速冷卻后，于540nm波長(zhǎng)處，測(cè)定反 應(yīng)液的吸光度值。
[0022] 酶活單位定義：在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于 1μmol葡萄糖的還原糖所需的酶為1個(gè)酶活單位扣)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1:突變質(zhì)粒構(gòu)建
[0024] 利用質(zhì)粒提取試劑盒PlasmidMiniKit(購(gòu)于OMEGABI0-T邸公司）從實(shí)驗(yàn) 室保藏的E.coliBL21(DE3)/pET-28a-kvpul(Wen-BoQien,Yao化e,YanXu.Si即al Peptide-Independent Secretory Expression曰nd Ch曰r曰cteriz曰tion of Pullul曰n曰se from a Newly Isolated Klebsiella variicola SHN-1 in Escherichia coli.Appl Biochem Biotechnol (2013) 169:41-54.)中提取質(zhì)粒作為飽和定點(diǎn)突變的模板，所用的簡(jiǎn) 并引物序列為5' -3' GGC TAC GAT CCG NNK CAC TACACG GTG CC(序列如SEQ ID N0:5所 示）。 陽(yáng)0巧]利用PrinKSTAR"服PCR酶（購(gòu)于TaKaRa公司）采用全質(zhì)粒PCR的方法對(duì)地e581 進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。PCR反應(yīng)體系為：10μ1SXPrimestarbuffe;r，4iildNTPmixture, 0.