一種基于聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)制備亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明所屬酶工程研究開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù) 制備亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的方法研究。
【背景技術(shù)】：
[0002] 亞油酸異構(gòu)酶（Linoleic acid isomerase，LAI)是能將亞油酸專一轉(zhuǎn)化為共軛 亞油酸的一種異構(gòu)酶。隨著具有強(qiáng)大生理功能的共軛亞油酸得到人們的廣泛關(guān)注，作為生 物轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸過(guò)程中的關(guān)鍵酶--亞油酸異構(gòu)酶也就成為了研究的熱點(diǎn)。目 前，游離的亞油酸異構(gòu)酶在工業(yè)應(yīng)用過(guò)程中存在易失活、易結(jié)塊、對(duì)環(huán)境變化的耐受性不 高、難與產(chǎn)品分離、不能重復(fù)利用等問(wèn)題，降低了酶的催化效率，同時(shí)也增加了工業(yè)生產(chǎn)成 本。如果能實(shí)現(xiàn)亞油酸異構(gòu)酶固定化，不僅能夠提高酶的穩(wěn)定性及催化效率，更重要的是在 輕松實(shí)現(xiàn)酶與產(chǎn)品的分離的同時(shí)，還能夠延長(zhǎng)酶的使用周期，極大的降低了工業(yè)生產(chǎn)成本。
[0003] 傳統(tǒng)的酶固定化技術(shù)方法主要有：吸附法、包埋法、交聯(lián)法和結(jié)合法。采用傳統(tǒng)方 法對(duì)酶進(jìn)行固定化可以提高酶的催化效率、穩(wěn)定性及半衰期等，這些方法都各具優(yōu)缺點(diǎn)，需 根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇。利用聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)可以制備中空微膠囊，用以進(jìn)行酶 的固定化，因其具有高的比表面積、載酶量和膠囊壁厚可控等優(yōu)點(diǎn)，在酶固定化領(lǐng)域具有巨 大應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 發(fā)明目的在于提供一種聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的制備方 法，采用本發(fā)明制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊具有活性高、穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明所涉及的技術(shù)方案：本發(fā)明利用聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)，以碳酸鈣和亞 油酸異構(gòu)酶共沉淀得到的無(wú)定型碳酸鈣晶體為模板，以聚烯丙胺鹽酸鹽和聚苯乙烯磺酸鈉 為包覆材料，制備出具有高活性、較好穩(wěn)定性、半衰期長(zhǎng)的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊。具體步驟 如下：
[0006] 模板的制備：將0· 33mol / L含碳酸根無(wú)機(jī)鹽、0· 33mol / L含鈣離子無(wú)機(jī)鹽和 0. 34mg/mL亞油酸異構(gòu)酶按照體積比為I : I : 1或I : 1 : 2的比例均勻混合，混合后 離心收集無(wú)定型碳酸鈣晶體，即為模板，將模板用去離子水洗滌兩次；
[0007] 亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的制備：
[0008] (1)將步驟1所得模板移入lmL5mg / mL的帶有正電性的聚電解質(zhì)溶液中，懸浮吸 附lOmin，離心棄去上清，用去離子水洗滌3次，使帶有正電性的聚電解質(zhì)被吸附在模板表 面，即得第一層包覆有帶正電性聚電解質(zhì)的微粒；
[0009] (2)向步驟2(1)所得的微粒中加入lmL5mg / mL的帶有負(fù)電性的聚電解質(zhì)溶液， 懸浮反應(yīng)5min，離心棄去上清，用去離子水洗滌3次，即得包覆兩層聚電解質(zhì)的微粒；
[0010] (3)向步驟2(2)所得的微粒中加入lmL5mg / mL的帶有正電性的聚電解質(zhì)溶液， 懸浮反應(yīng)5min，離心棄去上清，用去離子水洗滌3次，即得包覆三層聚電解質(zhì)的微粒；
[0011] (4)重復(fù)步驟2(2)和（3)，直至八層，即得含有碳酸鈣的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊，此 時(shí)微膠囊粒徑為549nm ;
[0012] (5)通過(guò)分解方法將步驟2 (4)所述的微膠囊中的碳酸鈣去除，離心洗滌即得中 空微膠囊，微膠囊中含有預(yù)先包埋的亞油酸異構(gòu)酶，此時(shí)微囊化亞油酸異構(gòu)酶的比活力為 2080. 3593U / mg，固定率為94.8416%，最適反應(yīng)溫度為501：，最適反應(yīng)？!1為5，半衰期為 29. 5833 天。
[0013] 所述步驟中含碳酸根無(wú)機(jī)鹽為碳酸鈉，含鈣離子無(wú)機(jī)鹽為氯化鈣。
[0014] 所述步驟中帶正電性聚電解質(zhì)為聚烯丙胺鹽酸鹽，帶負(fù)電性聚電解質(zhì)為聚苯乙烯 磺酸鈉。
[0015] 所述步驟中分解碳酸鈣方法為乙二胺四乙酸分解。
[0016] 所述步驟中乙二胺四乙酸分解碳酸鈣的同時(shí)也螯合掉了亞油酸異構(gòu)酶活性中心 的鎂離子，為了恢復(fù)亞油酸異構(gòu)酶的活性，需要添加含鎂離子無(wú)機(jī)鹽。
[0017] 上述中含鎂離子的無(wú)機(jī)鹽為氯化鎂。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.與傳統(tǒng)固定化酶方法相比，采用本發(fā)明制備的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊壁厚可控， 比表面積與載酶量較高。
[0020] 2.可以通過(guò)控制模板的尺寸來(lái)控制亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的尺寸。
【附圖說(shuō)明】：
[0021] 圖1反應(yīng)溫度對(duì)微囊化亞油酸異構(gòu)酶和游離亞油酸異構(gòu)酶的影響。為溫度對(duì)采用 本發(fā)明方法制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶酶活力的影響。
[0022] 圖2微囊化亞油酸異構(gòu)酶和游離亞油酸異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性的比較。為采用本發(fā)明 方法制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的比較。
[0023] 圖3反應(yīng)pH對(duì)微囊化亞油酸異構(gòu)酶和游離亞油酸異構(gòu)酶酶活力的影響。為pH對(duì) 采用本發(fā)明方法制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊與游離亞油酸異構(gòu)酶活力的影響。
[0024] 圖4微囊化亞油酸異構(gòu)酶和游離亞油酸異構(gòu)酶酸堿穩(wěn)定性的比較。為采用本發(fā)明 方法制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶酸堿穩(wěn)定性的比較。
[0025] 圖5微囊化亞油酸異構(gòu)酶和游離亞油酸異構(gòu)酶半衰期的比較。為采用本發(fā)明方法 制備出的亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶半衰期的比較。
【具體實(shí)施方式】：
[0026] 本發(fā)明所述的設(shè)計(jì)聚電解質(zhì)層層自組裝制備亞油酸異構(gòu)酶微膠囊的方法包括以 下實(shí)例，下述實(shí)例可進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0027] 實(shí)例1 :溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響
[0028] 將亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶分別在20、30、40、50、60、70、80°〇的 溫度條件下反應(yīng)，測(cè)定其酶比活力；以最高酶比活力為1〇〇%，其它溫度下的酶比活力與最 高酶比活力的比值為相對(duì)比活力，各溫度條件下亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶 的相對(duì)比活力如表1及圖1所示。
[0029] 表1溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響
[0030] Tab. IEffect of temperature on the enzymatic reaction
[0031]
[0032] 從表1及圖I中可以看出，游離亞油酸異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度是40°C，亞油酸異構(gòu) 酶微膠囊的最適反應(yīng)溫度是50°C，亞油酸異構(gòu)酶微膠囊最適反應(yīng)溫度高于游離酶，在較高 溫度條件下經(jīng)微囊化亞油酸異構(gòu)酶的相對(duì)比活力要高于游離酶。
[0033] 實(shí)例2 :亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的比較
[0034] 將亞油酸異構(gòu)酶微膠囊和游離亞油酸異構(gòu)酶分別在20、30、40、50、60、70、80°C的 溫度條件下保溫一小時(shí)，保溫結(jié)束后在37°C條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定其酶比活力；以最 高酶比活力為100%，其它溫度下的酶比活力與最高酶比活力的比值