一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將葡萄糖氧化酶524位點的甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115中，經(jīng)篩選鑒定得到一株較原有菌株催化效率提高的菌株。該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在50mL搖瓶上酶活64.6U/mL，比野生型提高了近10%。催化效率Kcat/Km為76.98mM-1·s-1，比野生型（16.73mM-1·s-1）提高了近4.5倍。
【專利說明】一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應(yīng)用于血糖測定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品飼料醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。
[0003]在食品工業(yè)中，由于氧的存在引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長創(chuàng)造了條件。目前許多國家已將GOD作為公認(rèn)的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于將葡萄糖氧化形成過氧化氫和葡萄糖酸。利用其專一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準(zhǔn)確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中GOD作為試劑盒酶電極等用于血清(漿)尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑牙垢和齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境調(diào)節(jié)飼料消化促進(jìn)動物生長。含葡萄糖氧化酶乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染腹瀉并有促進(jìn)動物生長作用。
[0004]從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國及美國均采用點青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D,日本常用尼奇青霉,俄羅斯用生機(jī)青霉。近年報道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產(chǎn) G0D。
[0005]產(chǎn)量低、酶活低、檢測方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國內(nèi)外為此做了大量工作并取得了明顯進(jìn)展。目前國外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO0規(guī)?；a(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時產(chǎn)生大量雜蛋白分離提取復(fù)雜成本高。同時，葡萄糖氧化酶在生物傳感器方面一直有著很廣泛和重要的應(yīng)用前景。繼人們采用葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧電極而檢測血糖水平之后，第二代傳感器采用人工電子受體(又被稱為電子介質(zhì)或氧化還原染料)以代替氧作為電子受體。然而這一應(yīng)用仍存在一些問題，譬如:采用氧化酶(GOD)的電子介質(zhì)型生物傳感器很容易受到樣品中的溶解氧影響，因此采用對氧低敏感度的氧化酶相對來說具有很大的優(yōu)勢。本發(fā)明旨在提供一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將第524位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟 ;所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L。
[0007]編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0008]所述突變體M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發(fā)明還提供了一株產(chǎn)所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
[0010]所述基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟:PCR或化學(xué)合成得到編碼突變體M524L的基因，連接表達(dá)載體pPIC9K，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115，獲得基因工程菌。
[0011]利用所述基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培養(yǎng)至OD6tltl=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)；(3)當(dāng)在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5時，收集菌體，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
[0012]所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油IOmL, YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0013]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0014]本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶突變體M524L在搖瓶中的酶活比對照菌株的酶活提高了近10%，催化效率Kcat/Km為76.98^ ? s'比野生型(16.73mM_1 ? s’提高了近4.5倍。降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)上具有重大應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:各株突變菌株`的葡萄糖氧化酶的酶活比較。
[0016]圖2:各株突變菌株的葡萄糖氧化酶的比酶活比較。
[0017]圖3:催化效率提高型葡萄糖氧化酶蛋白電泳(SDS-PAGE) ；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:突變株M524L純化后；3:突變株M524L純化前。
[0018]圖4:各株突變葡萄糖氧化酶的pH穩(wěn)定性比較。
[0019]圖5:各株突變葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性比較。
【具體實施方式】
[0020]葡萄糖氧化酶酶活測定方法:G0D活性測定采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。在有氧的條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果計算葡萄糖氧化酶活力單位。I個葡萄糖氧化酶活力(IU)定義為:在30°C、pH6.0的條件下，Imin將I mo I的P -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位。
[0021]實施例1重組菌的構(gòu)建及鑒定
[0022]以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，分別將第524位的甲硫氨酸M、第305位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟。所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L、M305L。
[0023]以 Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D (CCTCC NO:M2012266)中的重組質(zhì)粒PPIC9K-G0D為模板，定點突變獲得含有不同突變GOD基因的載體pPIC9K_G0D，或分別化學(xué)合成突變后的基因、連接表達(dá)載體PPIC9K。
[0024]所用定點突變引物為:
[0025]M305L-F:5’GAATATTCCGGTATCGGACTGAAGTCCATCCTGGAG3’ ；
[0026]M305L-R:5’CTCCAGGATGGACTTCAGTCCGATACCGGAATATTC3’ ；
[0027]M524L-F:5’GTACTTGCTCCATGCTGCCGAAGGAGATG3’ ；
[0028]M524L-R:5’ATCTCCTTCGGCAGCATGGAGCAAGTAC3’ ； [0029]PCR反應(yīng)體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5XFD PCR buffer5 u I;DNTPMixture2 u I;模板DNAl u I ;上游引物各Iu I ；phusion酶0.5 y I ;加雙蒸水至終體積為 25iil。5XFD PCR buf f er5 u I; DNTP Mixture2 y I;模板 DNAl y I ;下游引物各 I y I ;phusion酶0.5 ill ； DMSO 1.5 u I加雙蒸水至終體積為25 yl。反應(yīng)5個循環(huán)后，將對應(yīng)PCR反應(yīng)液混合，繼續(xù)反應(yīng)25個循環(huán)。PCR擴(kuò)增條件:98°C預(yù)變性3min ;98°C變性15s ;53°C退火30s ;72°C延伸llmin (5個循環(huán))；72°C延伸IOmin0混合后擴(kuò)增條件:98°C變預(yù)變性3min ；98°C變性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin (25 個循環(huán))；72°C延伸 IOmin0
[0030]限制性內(nèi)切酶DpnI消化后，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。最終獲得分別含有突變氨基酸GOD基因的載體PPIC9K-G0D。GOD突變體M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，GOD突變體M305L的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。將測序正確的pPIC9K-G0D分別電擊轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，得到基因工程菌。
[0031]畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)法:GS115于50mL YPD中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5離心收集細(xì)胞；依次用400mL冰冷的無菌水洗兩次細(xì)胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗一次細(xì)胞，重懸細(xì)胞于lmLlmol/L的山梨醇中。100 u L原生質(zhì)體與5-10 u g線性化質(zhì)粒DNA(MSSI切)混合轉(zhuǎn)入冰冷的lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。30°C培養(yǎng)4_6天后挑取單克隆。
[0032]實施例2高表達(dá)菌株的篩選。
[0033]分別制備含lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL遺傳霉素的YPD平板,將MD培養(yǎng)基上的單克隆依次點板到不同濃度的YPD平板上培養(yǎng)48小時后，挑取形態(tài)較大的菌落進(jìn)行下一步的發(fā)酵培養(yǎng)。
[0034]實施例3重組菌的酶活測定和蛋白電泳
[0035]采用實施例2中獲得的分別表達(dá)突變體M524L、M305L的酵母工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后將在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)到OD6tltl=L 6-1.7的種子以2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量為50mL/500mL)，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_=1.2-1.5時，離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，重懸后菌體全部轉(zhuǎn)入50mL(500mL三角瓶)液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于30°C、200r/min搖床培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加l%(v/v)的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以表達(dá)野生型(即，未經(jīng)突變的出發(fā)G0D)葡萄糖氧化酶的P.pastorisGSl 15為對照菌株。
[0036]培養(yǎng)基:種子和斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g。
[0037]基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。[0038]誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0039]發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵上清，對酶進(jìn)行純化，純化方法是陰離子層析，采用梯度洗脫的方法，最終獲得較純的葡萄糖氧化酶。
[0040]如附圖所示，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶。同時在搖瓶過程中，M524L在發(fā)酵第6天達(dá)到最高酶活64.6U/mL,比對照菌株的酶活(58.7U/ml)提高了近10%。同時，相比野生型，突變株M524L的pH穩(wěn)定性有所提高，在pH4-7內(nèi)基本保持50%以上的活力，溫度穩(wěn)定性基本不變。
[0041]純化后的葡萄糖氧化酶M524L經(jīng)計算Km值為10mM，Kcat為767.98s—1。催化效率Kcat/Km為76.98mM_1.s'比野生型(16.73mM_1 *8^)提高了近4.5倍。對過氧化氫的耐受能力也有所提聞。
[0042]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定 的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將催化活性中心的甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，是將第524位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟，突變后的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.編碼權(quán)利要求2所述葡萄糖氧化酶突變體的核苷酸。
4.攜帶權(quán)利要求3所述核苷酸的載體、基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，是以畢赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
6.構(gòu)建權(quán)利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，是通過PCR或化學(xué)合成得到編碼突變體的核苷酸序列，連接表達(dá)載體pPIC9K獲得重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，獲得基因工程菌。
7.應(yīng)用權(quán)利要求5所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培養(yǎng)至OD600=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)；(3)當(dāng)在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5時，收集菌體，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，甘油10mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0的磷酸緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物 10g/L，甲醇 8mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0 的磷酸緩沖液。
10.權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶突變體的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/81GK103614350SQ201310699636
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】陳堅, 聞一凡, 張娟, 堵國成, 顧磊, 劉曉筱 申請人:江南大學(xué)