一種酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種環(huán)肽的合成方法，具體涉及一種酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)肽具有優(yōu)異的抗菌、抗腫瘤、抗免疫活性，并且能形成受限構(gòu)象，與相應(yīng)線性肽 相比其在生物體內(nèi)具有更好的抗酶解和抗化學(xué)降解的能力。受限構(gòu)象在藥物設(shè)計中被稱為 "特權(quán)結(jié)構(gòu)（PrivilegedStructures) "，具有受限構(gòu)象的環(huán)肽還具有更好的特異性和革巴向 親和力，因此環(huán)肽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、材料等領(lǐng)域。
[0003] 自20世紀(jì)40年代首個環(huán)肽（GramicidinS)被發(fā)現(xiàn)以來，環(huán)肽的合成通常以氨基 酸為原料，通過內(nèi)酰胺化作用、內(nèi)酯化作用、連接反應(yīng)（ligationreactions)、疏基-硫酯 交換反應(yīng)等化學(xué)方式完成肽鏈的頭尾環(huán)合，或通過模板法環(huán)化反應(yīng)、金屬離子輔助環(huán)化反 應(yīng)、靜電可控環(huán)化反應(yīng)、疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)、關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)等方法引入構(gòu)象元素進(jìn)而完 成鏈端基的連接。但是，這些方法仍然有很大的缺點(diǎn)，例如：絕大多數(shù)反應(yīng)體系為高稀溶液 (10 3~10 4mol/L)，需要篩選特定金屬離子、添加劑（催化劑、縮合劑等），后期分離純化復(fù) 雜，以及線性肽前體活性基團(tuán)保護(hù)方法繁瑣等。因此，在液相中用非氨基酸法高效構(gòu)建直鏈 肽分子，并在原位誘導(dǎo)環(huán)化實(shí)現(xiàn)環(huán)肽的合成方法具有十分重要的意義。
[0004] 1850年，Strecker發(fā)現(xiàn)胺、醛（酮）、氰化氫的三組分反應(yīng)（Strecker反應(yīng)）可以 合成氨基酸，隨后合成化學(xué)家對于多組分反應(yīng)的研究興趣日益增長。Passerini反應(yīng)，Ugi 反應(yīng)和銅催化三組分反應(yīng)已經(jīng)用于高效合成功能小分子及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可控的序列規(guī)整高分 子。雖然，很多研究者嘗試通過多組分反應(yīng)體系來合成環(huán)肽，但到目前為止只能夠通過Ugi 四組分反應(yīng)合成出模擬環(huán)肽（cyclicpeptidomimetics)，其結(jié)構(gòu)中不具備肽鍵單元。
[0005]Ostaszewski等利用新型Ugi三組分反應(yīng)體系一當(dāng)量醛、兩當(dāng)量胺和一當(dāng)量異腈 在酶的催化作用下成功制備了二肽，但是二肽的端基都是惰性基團(tuán)，無法進(jìn)一步成環(huán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中利用多組分反應(yīng)制備環(huán)肽過程中存在的 難以在分子間擴(kuò)鏈或者分子內(nèi)成環(huán)的問題，提供一種在酶的催化作用下，既易于在分子間 擴(kuò)鏈也易于在分子內(nèi)成環(huán)的環(huán)肽的合成方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法，包括在液相體系中，將二胺、異腈、醛在酶的催 化作用下發(fā)生反應(yīng)，得到環(huán)肽。
[0009] 反應(yīng)過程如下所示：
[0010]
[0011] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，所述二胺、異腈、醛按摩爾比1 :1 :1進(jìn)行反 應(yīng)。
[0012] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，所述液相體系為水、氯仿中的一種或兩種。
[0013] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，優(yōu)選的，所述液相體系為水。
[0014] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，二胺、異腈或醛在液相體系中的濃度分別為 0?06 ~0? 5mol/L〇
[0015] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，所述酶為脂肪酶。
[0016] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，優(yōu)選的，所述脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶 (Candidaantarcticalipase)〇
[0017] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，所述二胺的胺基間碳原子數(shù)為3-13,且溶于 水。優(yōu)選，2, 2-二甲基-1，3-丙二胺和1，3-丙二胺；最優(yōu)選，2, 2-二甲基-1，3-丙二胺。
[0018] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，優(yōu)選的，所述醛為異戊醛和正丁醛。
[0019] 上述多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法中，優(yōu)選的，所述異腈為異腈乙酸乙酯。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：
[0021] 1、本發(fā)明的酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法，將二胺引入多組分反應(yīng)，在酶的 催化下通過分子間擴(kuò)鏈和分子內(nèi)成環(huán)制備含有不同數(shù)量的肽鍵單元的環(huán)肽；不需要其他的 催化劑或者縮合劑，高效構(gòu)建直鏈肽分子，并在原位誘導(dǎo)環(huán)化實(shí)現(xiàn)環(huán)肽的合成。
[0022] 2、本發(fā)明的酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法，在水、氯仿或水與氯仿混合的液 相體系中，反應(yīng)物二胺、異腈、醛在脂肪酶的作用下，反應(yīng)得到環(huán)肽；尤其在有水的作用下， 線性肽分子間的氫鍵作用力降低了其在水中的溶解度，導(dǎo)致受限的空間構(gòu)象，另外水分子 促進(jìn)了線性肽分子的折疊，上述因素協(xié)同促進(jìn)了水相中環(huán)肽的形成，生成的環(huán)肽純度高大 于 95%。
[0023] 3、本發(fā)明的酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法，可以在反應(yīng)物的高濃度（0. 5mol/ U下進(jìn)行，和現(xiàn)有的在液相體系進(jìn)行的成環(huán)反應(yīng)方法相比，反應(yīng)物濃度（在極稀溶液，一般 為10 4~10 3mol/L)提高了幾個數(shù)量級。
[0024] 4、本發(fā)明的酶催化多組分反應(yīng)合成環(huán)肽的方法，工藝簡單、生成的環(huán)肽純度高，分 離純化簡單。
【附圖說明】
[0025] 圖1為氯仿相酶催化三組分反應(yīng)的原液質(zhì)譜圖（正丁醛、2, 2-二甲基-1，3-丙二 胺）。
[0026] 圖2為水相酶催化三組分反應(yīng)的原液質(zhì)譜圖（正丁醛、2, 2-二甲基-1，3-丙二 胺）。
[0027] 圖3為氯仿/水混合相酶催化三組分反應(yīng)的原液質(zhì)譜圖（正丁醛、2, 2-二甲 基-1，3-丙二胺）。
[0028] 圖4為水相酶催化三組分反應(yīng)的質(zhì)譜圖（異戊醛、2, 2-二甲基-1，3-丙二胺）。
[0029] 圖5為水相酶催化三組分反應(yīng)純化后的MALDI-T0F譜圖（異戊醛、2, 2-二甲 基-1，3-丙二胺）。
[0030] 圖6為水相酶催化三組分反應(yīng)的原液質(zhì)譜圖（正丁醛、1，3-丙二胺）。
[0031] 圖7為水相酶催化三組分反應(yīng)的原液質(zhì)譜圖（正丁醛、4, 7, 10-三氧-1，13-十三 烷二胺等二胺）。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明的所有實(shí)施例中的原料、試劑如無特殊說明均為市售商品。下面結(jié)合附圖 和具體實(shí)例對本發(fā)明的實(shí)施進(jìn)一步進(jìn)行說明，但是本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 氯仿相：在20毫升的小瓶中加入5毫升氯仿，通氬氣十分鐘除去氯仿中的氧。然 后往溶液中加入反應(yīng)物（二胺、異腈、醛）總質(zhì)量的20%的南極假絲酵母脂肪酶，1毫摩爾 的正丁醛和1毫摩爾的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室溫下攪拌15分鐘。待反應(yīng)液完全澄 清后，往反應(yīng)液中加入1毫摩爾的異腈乙酸乙酯，反應(yīng)液室溫下攪拌48小時。反應(yīng)結(jié)束后， 反應(yīng)液為亮黃色澄清液，將反應(yīng)液和脂肪酶分離，直接用質(zhì)譜分析反應(yīng)液組成。氯仿相不做 HPLC純化。
[0035] 對反應(yīng)液進(jìn)行了質(zhì)譜表征。在眾多的離子信號峰中，發(fā)現(xiàn)了 242. 2, 483. 4和724. 5 三個特殊的信號峰，它們分別對應(yīng)與不同分子量的環(huán)肽，如圖1所示。
[0036] 形成的環(huán)肽結(jié)構(gòu)和得率見表1，用質(zhì)譜定量分析，氯仿中環(huán)肽和直鏈肽共存，其中 環(huán)肽相對含量為40%。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 水相：在20毫升的小瓶中加入5毫升水，通氬氣十分鐘除去水中的氧。然后往溶 液中加入然后往溶液中加入反應(yīng)物（二胺、異腈、醛）總質(zhì)量的20%的南極假絲酵母脂肪 酶，1毫摩爾的正丁醛和1毫摩爾的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室溫下攪拌15分鐘。待反 應(yīng)液完全澄清后，往反應(yīng)液中加入1毫摩爾的異腈乙酸乙酯，反應(yīng)液室溫下攪拌48小時。
[0039] 對反應(yīng)液進(jìn)行了質(zhì)譜表征，如圖2所示，四個規(guī)整的信號峰242. 2, 483. 4, 724. 5和 965. 7,分別對應(yīng)相應(yīng)分子量的環(huán)肽，雜質(zhì)離子峰非常少。
[0040] 形成的環(huán)肽結(jié)構(gòu)和得率見表1，用質(zhì)譜定量分析，水中產(chǎn)物幾乎為環(huán)肽，其中環(huán)肽 相對含量為95%。
[0041] 實(shí)施例3
[0042] 氯仿/水混合相：在20毫升的小瓶中加入5毫升氯仿/水（體積比1:1)，通氬氣 十分鐘除去溶液中的氧。然后往溶液中加入反應(yīng)物（二胺、異腈、醛）總質(zhì)量的20%的南 極假絲酵母脂肪酶，1毫摩爾的正丁醛和1毫摩爾的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室溫下攪 拌15分鐘。待反應(yīng)液完全澄清后，往反應(yīng)