一種樹脂固定鹵醇脫鹵酶催化合成(r)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種阿伐他汀中間體的制備方法，尤其設(shè)及一種樹脂固定面醇脫面酶 催化合成（時-4-氯基-3-徑基下酸乙醋的工藝，屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 科學家研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不僅具有強大的降脂作用，還具有多種功效，它能改 善血管內(nèi)屯、肌細胞重塑和抑制屯、臟電生理重塑，防止屯、肌細胞調(diào)亡和調(diào)節(jié)屯、臟植物神經(jīng)功 能等等。他汀類藥物的出現(xiàn)是屯、血管疾病治療史上一個重要的里程碑，并成為目前臨床上 用于智聯(lián)各類高脂血癥、防治動脈粥樣硬化及冠屯、病的助理血脂調(diào)劑藥物，也是全球醫(yī)藥 市場著名的"重磅炸彈"級藥物。阿托伐他汀巧是目前世界上最楊銷的降血脂藥，是HMGCoA 還原酶抑制劑。阿托伐他汀巧手性側(cè)鏈有兩個徑基，是與HMGCoA還原酶識別的藥效團，合 成側(cè)鏈設(shè)及的中間體主要有ATS-5和（3R，5S)-6-氯二徑基己酸叔下醋。其中，ATS-5是關(guān) 鍵中間體。
[0003] 目前合成ATS-5 ((時-4-氯基-3-徑基下酸乙醋）的方法主要有不對稱合成法和 微生物轉(zhuǎn)化法等。發(fā)酵法制備ATS-5還處于實驗室研究階段，并且存在效率低的問題；不對 稱合成技術(shù)是使用一種對映體催化劑，與一種底物進行反應(yīng)，使之只形成一個對映體的手 性化合物的不對稱合成方法。其中又可分為化學催化不對稱還原和生物催化不對稱還原。
[0004] 不對稱合成又稱為手性合成，它W具有手性活性中屯、的物質(zhì)作為原料，在保留活 性中屯、的前提下通過化學方法或者生物方法，合成新的手性化合物?；瘜W不對稱法合成 ATS-5需要手性底物作為原料，使用的手性催化劑大多含重金屬且合成技術(shù)復(fù)雜，重金屬也 會對環(huán)境造成污染，治理污染導(dǎo)致成本偏高，最終產(chǎn)物的光學純度也低于生產(chǎn)要求，因此不 適用于制藥行業(yè)。
[0005] 為了提高ATS-5的收率特別是其光學純度及減少污染，酶法制備ATS-5工藝得到 了廣泛的研究。常用的酶主要有面醇脫面酶巧C4. 5.X.X)、幾基還原酶巧C1. 1. 1. 184)、 臘水解酶巧C3. 5. 5. 1)和脂肪酶巧C3. 1. 1. 3)。研究表明，脂肪酶催化時，經(jīng)過化反應(yīng)，盡 管ATS-5的收率可達99 %，但手性成份只有50 %。Moen研究表明，在脂肪酶催化下，氨化率 為98 %，中間體進一步在其他催化劑下發(fā)生反應(yīng)，ATS-5收率可達95 %，然而，由于后一步 催化劑太貴，限制其工業(yè)化應(yīng)用。臘水解酶催化W3-徑基戊二臘為起始底物，合成ATS-5。 Robedson等從DNA文庫中得到137種臘水解酶，發(fā)現(xiàn)其中一種可催化3-徑基戊二臘去對 稱生成ATS-5,其收率可達98 %，然而隨著底物濃度增加，手性化合物含量則下降，因而限 制其規(guī)?；a(chǎn)。幾基還原酶催化時，需要添加NADH，而通過外部直接添加NADH無疑會增 加成本，工業(yè)上沒有實際可操作性為此，研究通過構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)來提高幾基還原酶催 化效率，如通過Leifsonia產(chǎn)生乙醇脫氨酶催化合成手性化合物進一步再生輔因子；通過 Candidama即oliae產(chǎn)生幾基還原酶及Bacillusmegaterium產(chǎn)生葡萄糖脫氨酶相偶合，催 化C0邸生成（S) -CHBE，然而，上述研究目前盡限于實驗室規(guī)模，離工業(yè)化生產(chǎn)還有一定距 離。
[0006] 與幾基還原酶、臘水解酶和脂肪酶相比，面醇脫面酶（HHDH)具有一定優(yōu)勢，在不 需任何輔酶情況下，HHDH催化底物（S)-4-氯-3-徑基下酸乙醋（ATS-4)脫去面元素，成 環(huán)氧化合物，后者受到氯基進攻，轉(zhuǎn)化為ATS-5。合成過程中，HHDH起重要催化作用（如下 式）。
[0007]
[0008]ATS-5作為高新技術(shù)認定產(chǎn)品，W(S) -4-氯-3-徑基下酸乙醋為底物，在HHDH催 化下，脫去氯，成環(huán)氧化合物，后者與氯化鋼經(jīng)過化反應(yīng)，生成ATS-5。所生成的混合液首先 通過活性碳吸附，去除HHDH殘留物及其他雜物，過濾得到含ATS-5上清液，醋酸乙醋萃取， 蒸饋及精饋，得ATS-5終產(chǎn)品。
[0009] 盡管目前該產(chǎn)品已產(chǎn)業(yè)化，整個反應(yīng)已完成小試，其中用75血(48U/mL)脫面酶催 化反應(yīng)45g(巧-4-氯-3-徑基下酸乙醋，在溫度為49°C，抑在6. 90-7. 00之間，反應(yīng)6小時 之后（S) -4-氯-3-徑基下酸乙醋轉(zhuǎn)化率為95 %，ATS-5得率為86 %，具有較高的工業(yè)應(yīng)用 價值，但該工藝仍存在W下問題：
[0010] ①HHDH的去除。盡管通過活性碳吸附回收ATS-5同時去除HHDH，部分酶仍有殘 留，經(jīng)過后期蒸饋及精饋工藝，HHDH分解成小分子物質(zhì)，殘留在產(chǎn)品中，對后續(xù)提純造成了 很大影響，降低了ATS-5的收率和光學純度；
[0011] ②由于酶與底物是一次性加入，所WHHDH反應(yīng)一次后就去除，一方面造成去除 HHDH時工藝繁多，同時HHDH不能重復(fù)利用，因而導(dǎo)致整個工藝生產(chǎn)成本上升；
[0012] ③由于所用HHDH為胞內(nèi)酶，粗酶液中除含有HHDH，還含有其他雜蛋白質(zhì)等，通過 活性碳吸附回收ATS-5時，部分雜蛋白會殘留ATS-5中，無疑增加整個工藝復(fù)雜程度，導(dǎo)致 終產(chǎn)品純度不高、生產(chǎn)成本卻增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種樹脂固定面醇脫面酶催化合成（時-4-氯 基-3-徑基下酸乙醋的工藝，反應(yīng)條件溫和，無酶殘留，酶可重復(fù)利用，反應(yīng)速度快，成本 低，產(chǎn)物得率高，并且沒有副反應(yīng)存在，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0014] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0015] 一種樹脂固定面醇脫面酶催化合成（時-4-氯基-3-徑基下酸乙醋的工藝，包括如 下步驟：
[0016] 1)將吸附樹脂用蒸饋水浸泡，去雜，然后在攬拌條件下用堿液和酸液交替浸泡 2-4次，最后用蒸饋水沖洗至中性，得預(yù)處理吸附樹脂，并用吸附樹脂的2倍體積W上的4Γ 的蒸饋水浸泡待用；
[0017]。配制48U/mL的面醇脫面酶溶液，在4°C的條件下放置待用；配制0.Imol/L、抑 為6. 5-8. 0憐酸氨二鋼-憐酸二氨鋼緩沖液待用；
[001引 3)將30g預(yù)處理的吸附樹脂加入到50-150mL的面醇脫面酶溶液中，用憐酸氨二 鋼-憐酸二氨鋼緩沖液調(diào)節(jié)抑至6. 8-7. 4,并在15-30°C的條件下，攬拌4-lOh，得吸附樹脂 固定面醇脫面酶；
[001引 4)稱取207g蒸饋水、1.5-2. 5g氯化鋼，逐一加入四口燒瓶中，并調(diào)節(jié)抑至 7. 5-8. 5 左右；
[0020] 5)加入40-50g底物ATS-4,并升溫，待溫度大于46°C時加入15g吸附樹脂固定面 醇脫面酶，反應(yīng)1-地，調(diào)節(jié)抑為6. 90-7. 05,用有機溶劑萃取、精饋，得（時-4-氯基-3-徑 基下酸乙醋。
[0021] 具體地，所述吸附樹脂為DH110樹脂、311樹脂或AB8樹脂（江蘇臨海樹脂科技有 限公司）。
[0022] 具體地，所述步驟1)中在攬拌條件下用堿液和酸液交替浸泡工藝為：先用3-5倍 吸附樹脂體積的3-5wt%的化0H溶液浸泡吸附樹脂至少比，然后用蒸饋水沖洗至中性，再 用2-3倍吸附樹脂體積的3-5wt%的肥1溶液浸泡吸附樹脂至少0.化，最后用蒸饋水沖洗 至中性。
[0023] 作為優(yōu)選，所述步驟3)中面醇脫面酶溶液的體積150血。
[0024] 作為優(yōu)選，所述步驟3)中攬拌溫度為25°C。
[0025] 作為優(yōu)選，所述步驟3)中攬拌時間為化。
[0026] 作為優(yōu)選，步驟5)的反應(yīng)溫度為47-52Γ。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟5)的反應(yīng)時間為地。
[002引作為優(yōu)選，步驟5)中調(diào)節(jié)抑為6. 98。
[0029] 作為優(yōu)選，步驟5)的有機溶劑為乙酸乙醋或二氯甲燒。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的一種樹脂固定面醇脫面酶催化合成 (時-4-氯基-3-徑基下酸乙醋的工藝，W(S)-4-氯-3-徑基下酸乙醋（ATS-4)為底物，采用 酶法合成ATS-5,針對酶法反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率較低的缺陷，選取樹脂為載體，吸附法皿皿， 該法能使得酶重復(fù)利用，提高底物轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物得率，從而降低生產(chǎn)成本，經(jīng)試驗，HHDH的 固定率在45%W上，第一次ATS-5產(chǎn)物生成率在75%W上，甚至高達94. 13%，固定化酶回 收利用之后第二次轉(zhuǎn)化率在35%W上，最高至50%，反應(yīng)條件溫和，無酶殘留，酶可重復(fù)利 用，反應(yīng)速度快，成本低，產(chǎn)物得率高，并且沒有副反應(yīng)存在，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
【具體實施方式】[00引]實施例1
[0032] 一種樹脂固定面醇脫面酶催化合成（時-4