一種海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶催化合成(r)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種阿伐他汀中間體的制備方法，尤其涉及一種海藻酸鈉固定鹵醇脫 鹵酶催化合成（R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝，屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不僅具有強(qiáng)大的降脂作用，還具有多種功效，它能改 善血管內(nèi)心肌細(xì)胞重塑和抑制心臟電生理重塑，防止心肌細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)心臟植物神經(jīng)功 能等等。他汀類藥物的出現(xiàn)是心血管疾病治療史上一個重要的里程碑，并成為目前臨床上 用于智聯(lián)各類高脂血癥、防治動脈粥樣硬化及冠心病的助理血脂調(diào)劑藥物，也是全球醫(yī)藥 市場著名的"重鎊炸彈"級藥物。阿托伐他汀鈣是目前世界上最暢銷的降血脂藥，是HMGCoA 還原酶抑制劑。阿托伐他汀鈣手性側(cè)鏈有兩個羥基，是與HMGCoA還原酶識別的藥效團(tuán)，合 成側(cè)鏈涉及的中間體主要有ATS-5和（3R，5S)-6-氯二羥基己酸叔丁酯。其中，ATS-5是關(guān) 鍵中間體。
[0003] 目前合成ATS-5 ((R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯）的方法主要有不對稱合成法和 微生物轉(zhuǎn)化法等。發(fā)酵法制備ATS-5還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并且存在效率低的問題；不對 稱合成技術(shù)是使用一種對映體催化劑，與一種底物進(jìn)行反應(yīng)，使之只形成一個對映體的手 性化合物的不對稱合成方法。其中又可分為化學(xué)催化不對稱還原和生物催化不對稱還原。
[0004] 不對稱合成又稱為手性合成，它以具有手性活性中心的物質(zhì)作為原料，在保留活 性中心的前提下通過化學(xué)方法或者生物方法，合成新的手性化合物?；瘜W(xué)不對稱法合成 ATS-5需要手性底物作為原料，使用的手性催化劑大多含重金屬且合成技術(shù)復(fù)雜，重金屬也 會對環(huán)境造成污染，治理污染導(dǎo)致成本偏高，最終產(chǎn)物的光學(xué)純度也低于生產(chǎn)要求，因此不 適用于制藥行業(yè)。
[0005] 生物催化不對稱合成又包括傳統(tǒng)發(fā)酵、固定化細(xì)胞、固定化酶、有機(jī)溶媒以及水雙 相轉(zhuǎn)化等技術(shù)。傳統(tǒng)發(fā)酵法效率低，還需研究改進(jìn)；固定化細(xì)胞技術(shù)是用一種特定的方法 固定具有一定生理功能的生物細(xì)胞，作為固體生物催化劑而加以利用，固定化細(xì)胞內(nèi)酶的 活性保持完好無損失，但是它只能生產(chǎn)細(xì)胞外酶；固定化酶克服了傳統(tǒng)酶法穩(wěn)定性差、分 離純化困難等缺點(diǎn)，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，保留了酶的活性，使得酶能夠重復(fù)多次使用， 大大節(jié)約了成本，但是酶法催化反應(yīng)時需要嚴(yán)格控制反應(yīng)的PH、溫度等。而制備ATS-5常 用的酶有鹵醇脫鹵酶（EC 4. 5. X. X) (HHDH)、羰基還原酶（EC 1. 1. 1. 184)、腈水解酶（EC 3. 5. 5. 1)和脂肪酶（EC 3. 1. 1.3)，在這四種酶中，HHDH不需要任何輔酶就能催化底物 ATS-4 (4-氯-3-羥基丁酸乙酯）將脫去鹵元素成環(huán)氧化合物，環(huán)氧化合物受氰基進(jìn)攻后轉(zhuǎn) 化為ATS-5,如下式所示。
[0006]
[0007] 微生物轉(zhuǎn)化法是利用生物體系或其中多酶或單酶系統(tǒng)對目的底物進(jìn)行催化反應(yīng)， 將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)，其原理就是利用酶催化一類特殊反應(yīng)；自然界中廣泛存在 著各種微生物，這些微生物內(nèi)部都含有豐富的活性酶，且生命力強(qiáng)，因此對于手性物質(zhì)的制 備，微生物轉(zhuǎn)化法應(yīng)用廣泛；微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和，選擇性高，反應(yīng)速度快，成本 低、產(chǎn)物得率高的特點(diǎn)，但是影響因素多且難控制，比如有些底物是難溶性的，需要通過處 理才能進(jìn)行添加，而且微生物本身為多酶體系，轉(zhuǎn)化過程中會發(fā)生副反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶催化合成 (R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝，反應(yīng)條件溫和，無酶殘留，酶可重復(fù)利用，反應(yīng)速度 快，成本低，產(chǎn)物得率高，并且沒有副反應(yīng)存在，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0010] -種海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶催化合成（R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝，包 括如下步驟：
[0011] 1)配制7. 5-30U/mL的鹵醇脫鹵酶溶液待用；配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2. 5-4. Owt %的海藻 酸鈉水溶液待用；配制體積分?jǐn)?shù)為〇. 75-1. 5 %的戊二醛水溶液待用；
[0012] 2)將戊二醛水溶液滴入海藻酸鈉水溶液和鹵醇脫鹵酶溶液的均勻混合的溶液中， 并在攪拌的條件下反應(yīng)5h，得固定液，所述戊二醛水溶液、海藻酸鈉水溶液和齒醇脫齒酶溶 液的體積比為1:20:20 ;
[0013] 3)將固定液逐滴滴入過量的l_4wt%的氯化|丐水溶液中，形成凝珠小球，固化lh 后過濾，得海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶；
[0014] 4)稱取207g蒸餾水、1.5-2. 5g氰化鈉，逐一加入四口燒瓶中，并調(diào)節(jié)pH至 7. 5-8. 5 左右；
[0015] 5)加入40-50g底物ATS-4,并升溫，待溫度大于46°C時加入15g海藻酸鈉固定鹵 醇脫鹵酶，反應(yīng)l_4h，調(diào)節(jié)pH為6. 90-7. 05,用有機(jī)溶劑萃取、精餾，得（R)-4-氰基-3-羥 基丁酸乙酯。
[0016] 為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，所述鹵醇脫鹵酶溶液為從粗鹵醇脫鹵酶液中提取的鹵 醇脫鹵酶溶液。
[0017] 作為優(yōu)選，所述鹵醇脫鹵酶溶液的濃度為15U/mL。
[0018] 作為優(yōu)選，所述海藻酸鈉水溶液濃度為3. 5wt %。
[0019] 作為優(yōu)選，所述戊二醛水溶液體積分?jǐn)?shù)為1 %。
[0020] 作為優(yōu)選，所述步驟2)中戊二醛水溶液為逐滴滴入海藻酸鈉水溶液和鹵醇脫鹵 酶溶液的均勻混合的溶液。
[0021] 作為優(yōu)選，所述凝珠小球?yàn)槿榘咨樾∏颉?br>[0022] 作為優(yōu)選，步驟5)的反應(yīng)溫度為47_52°C。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟5)的反應(yīng)時間為4h。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟5)的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或二氯甲烷。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶的方法，海藻酸 鈉對鹵醇脫鹵酶的固定速率快，在1小時即可完成海藻酸鈉對鹵醇脫鹵酶的固定，并且海 藻酸鈉對鹵醇脫鹵酶的固定率高，海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶在第一次催化合成（R)-4_氰 基-3-羥基丁酸乙酯后，進(jìn)行回收，依然能夠保持較高的催化效率，固定效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1
[0027] -種海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶催化合成（R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的工藝，包 括如下步驟：
[0028] 1)從粗鹵醇脫鹵酶液中提取15U/mL的鹵醇脫鹵酶溶液待用；配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3. 5wt %的海藻酸鈉水溶液待用；配制體積分?jǐn)?shù)為1 %的戊二醛水溶液待用；
[0029] 2)將2mL的戊二醛水溶液滴入40mL的海藻酸鈉水溶液和40mL的鹵醇脫鹵酶溶液 的均勻混合的溶液中，并在攪拌的條件下反應(yīng)5h，得固定液；
[0030] 3)將固定液逐滴滴入100mL的2wt %的氯化鈣水溶液中，形成凝珠小球，固化lh 后過濾，得海藻酸鈉固定鹵醇脫鹵酶；
[0031] 4)稱取207g蒸餾水、2g氰化鈉，逐一加入四口燒瓶中，并調(diào)節(jié)pH至8.0左右；
[0032] 5)加入45g底物ATS-4,并升溫，50°C時加入15g海藻酸鈉固定齒醇脫齒酶，反應(yīng) 4h，調(diào)節(jié)pH為7,用乙酸乙酯萃取、精餾，得（R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。
[0033] 在步驟2)中，在加入戊二醛時，最好是逐滴加入，這樣可以保證戊二醛能夠快速 分散，防止局部交