酶法催化制備肌醇的方法及其產(chǎn)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及酶法催化制備肌醇的方法，包括如下步驟：以葡萄糖為單位的多糖或者寡糖酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖?1?磷酸；葡萄糖?1?磷酸酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖?6?磷酸；葡萄糖?6?磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇?1?磷酸；肌醇?1?磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇。本發(fā)明還提供按照所述方法制備的肌醇產(chǎn)品。所述方法有效提高了肌醇的轉(zhuǎn)化效率，且生產(chǎn)工藝簡單，無污染，生產(chǎn)成本低。
【專利說明】
酶法催化制備肌醇的方法及其產(chǎn)物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及酶法催化制備肌醇的方法及其產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)己六醇也被稱為肌醇，是動(dòng)物必需的生長因子，是細(xì)胞膜的組成成分之一。在醫(yī)藥領(lǐng)域，肌醇及其衍生物具有促進(jìn)細(xì)胞生長、預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化、膽固醇過高癥等疾病的作用。在食品領(lǐng)域，肌醇常作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，能促進(jìn)發(fā)育，具有抗氧化功能，與肉毒堿結(jié)合使用具有減肥功效。美國在1987年就推薦含奶嬰兒食品中應(yīng)加入一定量的肌醇。此外，肌醇還被用于飼料中以促進(jìn)動(dòng)物的生長和防止毛發(fā)脫落。
[0003]目前肌醇生產(chǎn)的主要方法是利用米糠或麩皮等底物提取植酸鈣，然后加壓水解制得。其產(chǎn)率極低，且存在生產(chǎn)設(shè)備要求高，污染環(huán)境等缺點(diǎn)。利用植酸酶等酶法水解植酸鈣，肌醇得率與化學(xué)水解得率相當(dāng)。
[0004]有文獻(xiàn)及專利報(bào)道，以葡萄糖為底物，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)肌醇。在大腸桿菌中導(dǎo)入來源于釀酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶，以及表達(dá)大腸桿菌自身的磷酸肌醇磷酸酶，從而使葡萄糖能被轉(zhuǎn)化為肌醇。但在微生物細(xì)胞中，葡萄糖同時(shí)參與多個(gè)代謝途徑以維持細(xì)胞的生長，此外，肌醇-1-磷酸合成酶催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸則由葡萄糖磷酸化得到，此過程需要消耗能量(ATP或磷酸烯醇式丙酮酸)，葡萄糖轉(zhuǎn)化為肌醇的轉(zhuǎn)化率較低。此外，由于細(xì)胞發(fā)酵液成分較復(fù)雜，從而從中純化肌醇的過程也較復(fù)雜，成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)存的化工生產(chǎn)肌醇的方法和微生物轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)肌醇存在問題，本發(fā)明提供了酶法催化制備肌醇的方法，有效提高了肌醇的轉(zhuǎn)化效率，且生產(chǎn)工藝簡單，無污染，生產(chǎn)成本低。
[0006]作為本發(fā)明實(shí)施例的一個(gè)方面，涉及酶法催化制備肌醇的方法，包括如下步驟:以葡萄糖為單位的多糖或者寡糖酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸;肌醇-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇。
[0007]作為實(shí)施例之一，以葡萄糖為單位的多糖或者寡糖酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸的過程中使用多糖磷酸化酶進(jìn)行催化;葡萄糖-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸的過程中使用己糖磷酸變位酶催化;葡萄糖-6-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸的過程中使用肌醇磷酸合成酶催化;肌醇-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇的過程中使用磷酸肌醇磷酸酶催化。
[0008]在一種實(shí)施例中，多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶同時(shí)加入反應(yīng)體系。
[0009]在一種實(shí)施例中，多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶先后加入反應(yīng)體系。
[0010]所述多糖磷酸化酶可分為α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC2.4.1.1)，纖維糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)，纖維二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.20)，麥芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)，蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)，β-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.97 和 EC 2.4.I.30)，α-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.I.334)，β-1，2-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.333)，海藻糖磷酸化酶(EC 2.4.1.231和EC 2.4.1.64)，海帶二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.31)，曲二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.230)，黑曲寡糖磷酸化酶(EC 2.4.1.279)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)底物的不同選擇相對(duì)應(yīng)的酶，其中底物優(yōu)選為淀粉等α葡聚糖底物，因此對(duì)應(yīng)的酶優(yōu)選為α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC 2.4.1.1)。
[0011]所述己糖磷酸變位酶可以催化己糖-1-磷酸生成己糖-6-磷酸。已報(bào)道的可以催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶主要屬于兩大超家族:磷酸己糖變位酶超家族，包括葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2和EC 5.4.2.5)，甘露糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.8)，氨基葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.10);鹵代酸脫鹵酶超家族，包括β葡萄糖磷酸變位酶(EC
5.4.2.6)。其中葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)的天然底物即為葡萄糖_1_磷酸，催化活性較高，因此優(yōu)選葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶促反應(yīng)。
[0012]所述肌醇磷酸合成酶(EC5.5.1.4)催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸。其催化分為兩步:第一步，在NAD+的作用下，鏈狀的葡萄糖-6-磷酸被氧化生成5-羰基-葡萄糖-6-磷酸，同時(shí)NAD+被還原生成NADH，隨后，氧化產(chǎn)物發(fā)生烯醇化以及環(huán)化，產(chǎn)生2-肌醇單酮-1磷酸;第二步，NADH參與2-肌醇單酮-1磷酸的還原反應(yīng)，生成肌醇-1-磷酸與NAD+。金屬離子如Mg2+，Zn2+等或NH4+對(duì)酶有激活作用。該酶包含一個(gè)NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其催化需要加入NAD+作為輔酶，優(yōu)選的是肌醇-1-磷酸合成酶。
[0013]所述磷酸肌醇磷酸酶主要催化磷酸肌醇水解產(chǎn)生肌醇。能催化該反應(yīng)的酶主要是單磷酸肌醇磷酸酶(EC 3.1.3.25)，因此磷酸肌醇磷酸酶優(yōu)選為單磷酸肌醇磷酸酶(EC
3.1.3.25)。此外，部分其他的酶也能催化此反應(yīng)，包括磷酸-半乳糖磷酸酶(EC3.1.3.93),二磷酸果糖磷酸酶(EC 3.1.3.11)，糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，植酸酶(EC 3.1.3.8和EC
3.1.3.26),酸性磷酸酶(EC3.I.3.2)。
[0014]作為本發(fā)明實(shí)施例的另一個(gè)方面，涉及一種酶法催化制備肌醇的方法，以葡萄糖為單元的多糖或寡糖為原料，在反應(yīng)體系中，同時(shí)或者先后添加多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶。
[0015]所述多糖磷酸化酶可分為α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC2.4.1.1)，纖維糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)，纖維二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.20)，麥芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)，蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)，β-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.97 和 EC 2.4.I.30)，α-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.I.334)，β-1，2-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.333)，海藻糖磷酸化酶(EC 2.4.1.231和EC 2.4.1.64)，海帶二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.31)，曲二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.230)，黑曲寡糖磷酸化酶(EC 2.4.1.279)等。應(yīng)根據(jù)底物的不同選擇相對(duì)應(yīng)的酶，其中底物優(yōu)選為淀粉等α葡聚糖底物，因此對(duì)應(yīng)的酶優(yōu)選為α葡聚糖(或糖原)磷酸化酶(EC 2.4.1.1)。
[0016]所述己糖磷酸變位酶可以催化己糖-1-磷酸生成己糖-6-磷酸。已報(bào)道的可以催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶主要屬于兩大超家族:磷酸己糖變位酶超家族，包括葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2和EC 5.4.2.5)，甘露糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.8)，氨基葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.10);鹵代酸脫鹵酶超家族，包括β葡萄糖磷酸變位酶(EC
5.4.2.6)。其中葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)的天然底物即為葡萄糖_1_磷酸，催化活性較高，因此優(yōu)選葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)催化葡萄糖-1-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸的酶促反應(yīng)。
[0017]所述肌醇磷酸合成酶(EC5.5.1.4)催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-1-磷酸。其催化分為兩步:第一步，在NAD+的作用下，鏈狀的葡萄糖-6-磷酸被氧化生成5-羰基-葡萄糖-6-磷酸，同時(shí)NAD+被還原生成NADH，隨后，氧化產(chǎn)物發(fā)生烯醇化以及環(huán)化，產(chǎn)生2-肌醇單酮-1磷酸;第二步，NADH參與2-肌醇單酮-1磷酸的還原反應(yīng)，生成肌醇-1-磷酸與NAD+。金屬離子如Mg2+，Zn2+等或NH4+對(duì)酶有激活作用。該酶包含一個(gè)NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其催化需要加入NAD+作為輔酶，優(yōu)選的是肌醇-1-磷酸合成酶。
[0018]所述磷酸肌醇磷酸酶主要催化磷酸肌醇水解產(chǎn)生肌醇。能催化該反應(yīng)的酶主要是單磷酸肌醇磷酸酶(EC 3.1.3.25)，因此磷酸肌醇磷酸酶優(yōu)選為單磷酸肌醇磷酸酶(EC
3.1.3.25)。此外，部分其他的酶也能催化此反應(yīng)，包括磷酸-半乳糖磷酸酶(EC3.1.3.93),二磷酸果糖磷酸酶(EC 3.1.3.11)，糖磷酸酶(EC 3.1.3.23)，植酸酶(EC 3.1.3.8和EC
3.1.3.26),酸性磷酸酶(EC3.I.3.2)。
[0019]作為本發(fā)明實(shí)施例的再一方面，涉及上述方法制備的肌醇產(chǎn)品，肌醇產(chǎn)品中含有葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和/或6-磷酸葡萄糖。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明實(shí)施例至少實(shí)現(xiàn)了如下有益效果:
[0021]所述方法有效提高了肌醇的轉(zhuǎn)化效率，純度高，且生產(chǎn)工藝簡單，無污染，生產(chǎn)成本低。
【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中質(zhì)粒pET26b_IN01表達(dá)載體圖譜；
[0023]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1體外表達(dá)酶的大腸桿菌細(xì)胞超聲裂解后上清SDS-PAGE檢測結(jié)果圖；
[0024]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中INOl不同pH值對(duì)酶活性的影響；
[0025]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中INOl不同溫度對(duì)酶活性的影響；
[0026]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中MIP不同pH值對(duì)酶活性的影響；
[0027]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中MIP不同溫度對(duì)酶活性的影響；
[0028]圖7是本發(fā)明實(shí)施例1中PGM不同pH值對(duì)酶活性的影響；
[0029]圖8是本發(fā)明實(shí)施例1中PGM不同溫度對(duì)酶活性的影響；
[0030]圖9是本發(fā)明實(shí)施例1中aGP不同pH值對(duì)酶活性的影響；
[0031 ]圖10是本發(fā)明實(shí)施例1中aGP不同溫度對(duì)酶活性的影響。
[0032]圖2中所示:I為蛋白marker，2為未純化的酶，3為經(jīng)過熱處理后的酶。
【具體實(shí)施方式】
[0033]原料與酶的選擇
[0034]多糖原料為葡萄糖為單糖單位組成的多糖或寡糖。多糖包括(但不限于)以α糖苷鍵(主要為α-l，4_糖苷鍵)連接形成的α葡聚糖如淀粉、糖原，以及以糖苷鍵(主要為β-l，4_糖苷鍵以及β-1，3-糖苷鍵)形成的β葡聚糖如纖維素、海帶多糖、酵母β葡聚糖等。寡糖則是指聚合度相對(duì)較低的上述多糖，可由上述多糖部分水解得到，如低聚麥芽糖，纖維糊精和環(huán)糊精等。
[0035]對(duì)于常溫下溶于水的多糖原料，如水溶性淀粉和纖維二糖等，所述方法可以在低溫、中溫以及高溫中進(jìn)行，例如10°C-100°C之間。對(duì)于催化四步反應(yīng)的酶也可以選擇在低溫、中溫以及高溫中有活性的酶，例如可以選擇最適溫度在30_40°C的四種酶。而對(duì)于常溫下不溶于水的多糖原料，如玉米淀粉和紅薯淀粉等，需要高溫糊化才能溶于水，此時(shí)，所述方法必須在高溫下進(jìn)行，例如60-90 °C之間。酶的選擇也隨之變更為在高溫下有較好活性和穩(wěn)定性的酶。
[0036]由于淀粉成本最低，因此選在淀粉作為底物，淀粉溶于水時(shí)需要高溫糊化，因此選擇耐高溫的酶。如果使用其他容易在常溫下溶于水的多糖，則可以選擇常溫酶。
[0037]多糖磷酸化酶:可選擇來源于微生物、植物和動(dòng)物的多糖磷酸化酶。優(yōu)選來源于嗜熱微生物的多糖磷酸化酶，嗜熱微生物包括Aqu if ex屬、Thermus屬、Rhodothermus屬、Rumini c 1 stridium屬、Methanococcus屬、Methanocaldococcus屬、Pyrobaculum屬、Pyro coccus 屬、Su lfolo bus 屬、Thermo coccus 屬、Thermoproteus 屬、Thermo toga 屬、Thermoanaerobacter 屬、Caldi ce I Iulosiruptor 屬、Thermobifida屬。
[0038]己糖磷酸變位酶:可選擇來源于微生物、植物和動(dòng)物的己糖磷酸變位酶。優(yōu)選來源于嗜熱微生物的己糖磷酸變位酶，嗜熱微生物包括Aquifex屬、Aeropyrum屬、Desulfurococcus屬、Ignicoccus屬、Pyrobaculum屬、Pyrococcus屬、Pyro1bus屬、Rhodothermus 屬、Rumini c 1stridium屬、Sulfo 1bus 屬、Thermococcus屬、Thermoproteus屬、Thermus 屬、Vulcanisaeta 屬、Methanococcus 屬、Methanocaldococcus 屬、Thermoanaerobac ter 屬、Fervidobacteri um屬、Ca I dice I Iu 1 sirup tor 屬、Thermobifi da屬、Thermob i f i da 屬。
[0039]磷酸肌醇合成酶:可選擇來源于動(dòng)物、植物、微生物的磷酸肌醇合成酶，優(yōu)選來源于嗜熱微生物的磷酸肌醇合成酶。嗜熱微生物包括Aeropyrum屬、Archaeog 1bus屬、Desu Ifuro Co c CUs屬、Igni Co c CUs屬、Rhodothermus屬、Pyrobacul um屬、Pyro coc CUs屬、Pyro 1bus 屬、Su Ifo 1bus 屬、Thermo Co c CUs 屬、Thermoproteus 屬、Vu Icanisaeta屬、Methanocaldococcus屬、Thermobifida屬。
[0040]磷酸肌醇磷酸酶:可選擇來源于微生物、植物和動(dòng)物的磷酸肌醇磷酸酶。優(yōu)選來源于嗜熱微生物的磷酸肌醇磷酸酶。嗜熱微生物包括Aquifex屬、Archaeog I obus屬、Desulfurococcus屬、Ignicoccus屬、Methanococcus屬、Methanocaldococcus屬、Pyrobaculum屬、Pyro 1bus屬、Rhodothermus 屬、Sulfo 1bus屬、Thermo toga屬、Thermus 屬、Vulcanisaeta屬、Thermob if ida屬。
[0041 ] 實(shí)施例1
[0042]肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)在大腸桿菌中的表達(dá)
[0043]在NCBI上查找嗜熱菌的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)基因或蛋白，篩選最適生長溫度在60-90°C的微生物，購買菌株提取基因組后擴(kuò)增相關(guān)基因，或者直接人工合成相關(guān)基因，以Archaeoglobusfulgidus來源的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)為例，其蛋白序列在NCBI上的編號(hào)GeneBank:AIG98795.1，將該序列交予基因合成公司合成對(duì)應(yīng)的DNA序列，并在其兩端分別加上EcoR 1-Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)。將合成的DNA以及大腸桿菌表達(dá)載體如pET_26b ( + )分別利用Nde I以及Xho I酶切回收后，利用T4DNA連接酶16 °C連接過夜，取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒，命名為pET26b-1N01，其質(zhì)粒圖譜如圖1所示。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑選轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證正確后-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0044]肌醇-1-磷酸合成酶的體外表達(dá)和檢測:將上述驗(yàn)證正確的BL21(DE3)轉(zhuǎn)化子加入5-1OmL LB培養(yǎng)基(I%蛋白胨，0.5%酵母提取物，I %氯化鈉)中37°C，250rpm培養(yǎng)過夜，然后按照I %接種量接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中37°C，250rpm活化10小時(shí)，按照I %-10%的接種量接種到發(fā)酵罐(TB培養(yǎng)基:1.2 %蛋白胨，2.4%酵母提取物，0.23 %磷酸二氫鉀，1.25 %磷酸氫二鉀，0.4% (v/v)甘油)中，37°C培養(yǎng)到OD6QQ達(dá)到8-10時(shí)，接入0.2-lmM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，約24小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束。取少量細(xì)胞進(jìn)行超聲裂解后取上清SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖2所示，INOl在大腸桿菌細(xì)胞裂解的上清中較亮的條帶，證明其有大量的可溶性表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶產(chǎn)生，其分子量約為44kD。
[0045]肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)在畢赤酵母中的表達(dá)
[0046]以Archaeoglobusfulgidus來源的肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)為例，將實(shí)施例1中合成的基因和以及畢赤酵母表達(dá)載體如PPICZaA分別用EcoR I和Xho I酶切回收后，利用T4DNA連接酶16°C連接過夜，取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒。利用Pme I酶切質(zhì)粒，將得到的線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，挑選轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證正確后-80°C保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鏊胁僮骶凑誴PICZa載體說明書進(jìn)行。
[0047]肌醇-1-磷酸合成酶的體外表達(dá):將轉(zhuǎn)化子接入Yro培養(yǎng)基(2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖)中30°C，250rpm活化過夜，然后再次轉(zhuǎn)接到新鮮的Yro培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-24小時(shí)，然后按照5%-10%的接種量接入發(fā)酵罐(FM21培養(yǎng)基:二水硫酸鈣1.5g/L，氫氧化鉀
6.5g/L，七水硫酸鎂19.5g/L，硫酸鉀23.8g/L，85%磷酸溶液35mL/L)中，控制溫度30°C，轉(zhuǎn)速500rpm，溶氧大于20%，培養(yǎng)至溶氧顯著上升時(shí)補(bǔ)加5%的甘油，繼續(xù)培養(yǎng)至溶氧顯著上升至接近100%后，維持30分鐘，流加0.5%甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵周期約72小時(shí)。
[0048]磷酸肌醇磷酸酶(MIP)在大腸桿菌中的表達(dá)
[0049]先在NCBI上查找磷酸肌醇磷酸酶(MIP)基因和蛋白，篩選最適生長溫度與整個(gè)酶催化體系溫度一致的微生物，購買菌株提取基因組后擴(kuò)增相關(guān)基因，或者直接人工合成相關(guān)基因。以Archaeoglobusf uIgidus來源的MIP進(jìn)行人工合成為例，查找其蛋白序列為GeneBank:WP_010879859.1，送DNA合成公司合成對(duì)應(yīng)的DNA(根據(jù)大腸桿菌密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化)，在其序列兩端分別加入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，利用Nde I和Xho I對(duì)合成的基因以及表達(dá)載體如pET-26b( + )進(jìn)行酶切回收后，利用T4DNA連接酶16°C連接過夜，取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑選轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證正確后-80°C保存?zhèn)溆?。酶的表達(dá)與肌醇-1-磷酸合成酶(IN01)的相同。
[0050]α-葡聚糖磷酸化酶(aGP)在大腸桿菌中的表達(dá)
[0051]先在NCBI上查找α-葡聚糖磷酸化酶(aGP)基因和蛋白，篩選最適生長溫度與整個(gè)酶催化體系溫度一致的微生物，購買菌株提取基因組后擴(kuò)增相關(guān)基因，或者直接人工合成相關(guān)基因。以Aquif ex aeolicus來源的aGP進(jìn)行人工合成為例，查找其蛋白序列GenBank:AAC06896.1，送DNA合成公司合成對(duì)應(yīng)的DNA(根據(jù)大腸桿菌密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化)，在其序列兩端分別加入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，利用Nde I和Xho I對(duì)合成的基因以及表達(dá)載體如pET-26b( + )進(jìn)行酶切回收后，利用T4DNA連接酶16°C連接過夜，取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑選轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證正確后-80 °C保存?zhèn)溆谩Ｃ傅谋磉_(dá)與肌醇-1-磷酸合成酶(INOl)的相同。
[0052 ]己糖磷酸變位酶(PGM)在大腸桿菌中的表達(dá)
[0053]先在NCBI上查找己糖磷酸變位酶(PGM)基因和蛋白，篩選最適生長溫度與整個(gè)酶催化體系溫度一致的微生物，購買菌株提取基因組后擴(kuò)增相關(guān)基因，或者直接人工合成相關(guān)基因。以Thermococcus kodakaraensis來源的PGM進(jìn)行人工合成為例，查找其蛋白序列GeneBank:BAD85297.1，送DNA合成公司合成對(duì)應(yīng)的DNA(根據(jù)大腸桿菌密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化)，在其序列兩端分別加入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，利用Nde I和Xho I對(duì)合成的基因以及表達(dá)載體如pET-26b ( +)進(jìn)行酶切回收后，利用T4DNA連接酶16 °C連接過夜，取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑選轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證正確后-80°C保存?zhèn)溆?。酶的表達(dá)與肌醇-1-磷酸合成酶(IN01)的相同。
[0054]體外表達(dá)酶的純化
[0055]將體外表達(dá)的肌醇-1-磷酸合成酶的大腸桿菌發(fā)酵液SOOOrpm離心20分鐘收集菌體，加入水或磷酸緩沖液使其濃度達(dá)到100g/L，導(dǎo)入高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行破碎，破碎后的酶液置于80°C水浴5分鐘，離心去除雜蛋白后，可以去除大部分的雜蛋白，SDS-PAGE檢測如圖2所示，此時(shí)可以通過噴霧干燥得到粗酶粉，也可以進(jìn)一步用Q柱純化，用0.5M氯化銨進(jìn)行梯度洗脫，得到較純的肌醇-1-磷酸合成酶。
[0056]所述磷酸肌醇磷酸酶，所述α-葡聚糖磷酸化酶和所述己糖磷酸變位酶的純化方法同肌醇-1-磷酸合成酶。
[0057]多糖磷酸化酶活性的測定
[0058]配置如下反應(yīng)溶液:50mM HEPES緩沖液，5mM磷酸二氫納，1mM氯化鎂，0.5_5mM底物如淀粉和纖維糊精等。取上述溶液5mL加入10yL酶液，在最適溫度反應(yīng)5分鐘后，迅速置于冰上終止反應(yīng)。生成的葡萄糖-1-磷酸可以通過葡萄糖磷酸變位酶生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸則可以在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與NAD+的作用下產(chǎn)生6-磷酸葡萄糖酸與NADH JADH在340nm處有吸收峰。因此可以通過測量NADH的量來間接測定葡萄糖-1-磷酸的量。具體反應(yīng)條件如下:取500yL上述反應(yīng)液，加入200U葡萄糖磷酸變位酶后，再加入500yL下述溶液:5μΜ葡萄糖-1，6-二磷酸，5mM NAD+，6U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。25-35°C反應(yīng)5分鐘后，340nm處測吸光值。
[0059]己糖磷酸變位酶活性的測定
[0060]配置如下反應(yīng)體系:50mM HEPES緩沖液，1mM氯化鎂，50μΜ葡萄糖-1，6-二磷酸，5mM葡萄糖-1-磷酸。加入酶液后在最適溫度下反應(yīng)5分鐘，最終100°C煮5分鐘或冰上放置5分鐘以終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)液200yL中加入800yL下述水溶液:0.5mM NAD+，2U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。25-35 °C反應(yīng)5分鐘后，340nm處測吸光值。[0061 ]磷酸肌醇磷酸酶活性的測定
[0062]采用鉬藍(lán)法，鉬酸銨與磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，磷鉬酸在還原試劑的作用下，生成藍(lán)色的鉬藍(lán)，在700nm處有吸光值。配置如下溶液:顯色液:試劑A:試劑B = 4:1。試劑A: 7.5g鉬酸銨溶于400mL水中，緩慢加入22mL濃硫酸，定容至500mL，冰箱儲(chǔ)存。試劑B:2.7%硫酸亞鐵溶液，冰箱儲(chǔ)存。底物溶液:50-100mM Tris-HCl，5_10mM氯化鎂，ImM肌醇-1-磷酸。終止液:
5%三氯乙酸溶液。
[0063]酶活測定方法如下:1、取250yL酶液，加入ImL底物溶液，在最適溫度下水浴10分鐘，加入1.25mL終止液。2、加入2.5mL顯色液。3、700nm處測吸光值。
[0064]肌醇磷酸合成酶活性的測定
[0065]配置如下溶液:50mM Tris-HCl，5mM葡萄糖_6_磷酸，1mM銨鹽或二價(jià)金屬鹽，加入200yL酶液，加入50yL 2-10U肌醇單磷酸磷酸酶，5mM NAD+，在最適溫度下反應(yīng)10分鐘，按照上述的鉬藍(lán)法測定磷酸的含量。
[0066]酶學(xué)性質(zhì)的測定
[0067]測定不同溫度，pH值對(duì)酶活性的影響，以體外表達(dá)的Archaeoglobusfulgidus的INOl為例，分別設(shè)置酶活測定體系的pH值為6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，利用上述酶活測定方法測酶活，結(jié)果如圖3所示，分別設(shè)置酶活測定體系的溫度為60°C，70°C，80°C，90°C，100°C，利用上述酶活測定方法測定酶活，結(jié)果如圖3和圖4所示，其最適反應(yīng)條件為pH8.0，90°C，此時(shí)比酶活為10.5U/mg。同樣方法測定其余三種體外表達(dá)酶的最適反應(yīng)條件，如圖5和圖6所示，實(shí)施例3中體外表達(dá)的Archaeoglobusfulgidus來源的MIP最適反應(yīng)條件pH8.0，90°C，最高比酶活為5.4U/mg;如圖7和圖8所不，實(shí)施例5中體外表達(dá)的Thermococcus kodakaraensis來源的PGM最適反應(yīng)條件為pH7.0，90 °C，最高比酶活為620U/mg;如圖9和圖1O所示，實(shí)施例4中體外表達(dá)的Aquifex aeolicus來源的aGP的最適反應(yīng)條件為pH 6.5，100°C，其最高比酶活為 7.5U/mg。
[0068]實(shí)施例2
[0069]使用實(shí)施例1所制備的酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將淀粉底物用水調(diào)制成干物質(zhì)含量為10%的淀粉乳，加入0.2M磷酸二氫鈉，調(diào)節(jié)pH6.5，在65°C進(jìn)行糊化。加入噴霧干燥得到的酶粉，其中<^?、？61、1勵(lì)1、11?按照酶活力單位等比例混合，加入量為10001]-100001]/1，以每升反應(yīng)體系加入<^、?61、1勵(lì)1、11?四種酶均為100001]為例，按照活力測定的數(shù)據(jù)，在?!1 7.0，70°C條件下，其酶活分別為3U/mg、275U/mg、1.7U/mg、1.7U/mg。即混合酶中四種酶的酶量分別為3333mg、36mg、5882mg、5882mg。將混合酶加入淀粉乳中，維持溫度不變，反應(yīng)72小時(shí)后，肌醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到62%。
[0070]實(shí)施例3
[0071 ]將淀粉原料用水調(diào)制成干物質(zhì)含量為10%的淀粉乳，加入0.1M磷酸二氫鈉，調(diào)節(jié)pH7.0，在750C進(jìn)行糊化。加入噴霧干燥得到的酶粉，其中aGP(來源于Aquifex aeolicus)、PGM(來源于Thermococcus kodakaraensis)、INOl (來源于Archaeoglobusfulgidus)、MIP(來源于Archaeoglobusfulgidus)的加入量均為10000U，維持溫度不變，反應(yīng)72小時(shí)后，肌醇含量為67g/L，按照淀粉分子式(C6H1Q05)n，100g/L的淀粉如果完全轉(zhuǎn)化為肌醇可以得到111g/L的肌醇，可以計(jì)算出肌醇轉(zhuǎn)化率為62 + 111X100%=60%。
[0072]aGP和PGM來源于Thermus thermophilus，INOl來源于Archaeoglobusfulgidus，MIP 來源于 Thermo toga maritima，轉(zhuǎn)化率62%。將 MIP替換為Thermus thermophilus 來源，轉(zhuǎn)化率基本不變。
[0073]實(shí)施例4
[0074]將淀粉原料用水調(diào)制成干物質(zhì)含量為10%的淀粉乳，加入0.5M磷酸二氫鈉，調(diào)節(jié)ρΗ7.0。在90°C進(jìn)行糊化。加入1000U/L的aGP(來源于Aquifex aeolicus)，反應(yīng)24小時(shí)后，加入1000U/L的PGM (來源于Thermo Co ccus kodakaraensis)，反應(yīng)24小時(shí)后，加喊調(diào)節(jié)pH為
8.0。加入 1000U/L 的 INOl (來源于 Archaeoglobusfulgidus)，反應(yīng) 24 小時(shí)后，加入 1000U/L 的MIP(來源于Archaeoglobusfulgidus)，反應(yīng)24小時(shí)。最終肌醇轉(zhuǎn)化率為50%。
[0075]實(shí)施例5
[0076]選擇其他在60_80°C有催化活性的酶，也可以催化淀粉底物產(chǎn)肌醇，如將淀粉原料用水調(diào)制成干物質(zhì)含量為10 %的淀粉乳，加入0.IM磷酸二氫鈉，調(diào)節(jié)pH 7.5，在75°C進(jìn)行糊化后加入aGP(來源于Pyrococcusfur1sus，GeneBank: AFN04317.1)、PGM (來源于Pyrococcus horikoshii ,GeneBank:WP_010885014.1)、INOl(來源于Aeropyrumpernix，GenBank:BAA80516.1)、MIP(來源于Methanococcus jannaschii ,GenBank: Q57573.1)，加入量均為10000U，催化48小時(shí)后，肌醇產(chǎn)量為47g/L，肌醇轉(zhuǎn)化率為42%，催化72小時(shí)后，肌醇含量產(chǎn)量為66g/L，轉(zhuǎn)化率為59%。
[0077]實(shí)施例6
[0078]肌醇的純化
[0079]以游離酶催化為例，催化完成后升溫至100°C處理30分鐘，待溫度降至室溫后，I升反應(yīng)液中加入400mL乙醇沉淀蛋白以及未充分水解的多糖，3000g離心I小時(shí)后，在上清中加入5g活性炭(DACR0 G-60)，攪拌30分鐘后，使用0.45μπι的過濾器，通過減壓過濾由該濾液中濾出活性炭，同樣的方法依次加入陽離子交換樹脂(Amberlite IR120BH+型)和陰離子交換樹脂(Amberlite IRA96SB 0Η—型)，最后經(jīng)過乙醇沉淀、濃縮結(jié)晶即可得到純的肌醇，其純度達(dá)到95%以上。粗肌醇產(chǎn)物中特有的雜質(zhì)為四種酶、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、單磷酸肌醇、葡萄糖和葡萄糖組成的寡糖。經(jīng)純化后，含有少量葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖。而利用傳統(tǒng)方法利用六磷酸肌醇水解制備肌醇，雜質(zhì)為肌醇上帶不同數(shù)量的磷酸集團(tuán)(如單磷酸肌醇、二磷酸肌醇等)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，包括如下步驟:以葡萄糖為單位的多糖或者寡糖酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸;肌醇-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇。2.權(quán)利要求1所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，以葡萄糖為單位的多糖或者寡糖酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸的過程中使用多糖磷酸化酶進(jìn)行催化;葡萄糖-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸的過程中使用己糖磷酸變位酶催化；葡萄糖-6-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸的過程中使用肌醇磷酸合成酶催化;肌醇-1-磷酸酶促轉(zhuǎn)化為肌醇的過程中使用磷酸肌醇磷酸酶催化。3.權(quán)利要求1所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶同時(shí)加入反應(yīng)體系。4.權(quán)利要求1所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶先后加入反應(yīng)體系。5.權(quán)利要求2-4任一所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶為α葡聚糖磷酸化酶，糖原磷酸化酶，纖維糊精磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，麥芽糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶，β_1，3-葡聚糖磷酸化酶，α-l，3-葡聚糖磷酸化酶，β_1，2-葡聚糖磷酸化酶，海藻糖磷酸化酶，海帶二糖磷酸化酶，曲二糖磷酸化酶，黑曲寡糖磷酸化酶中的一種，所述己糖磷酸變位酶為葡萄糖磷酸變位酶，甘露糖磷酸變位酶，氨基葡萄糖磷酸變位酶和β葡萄糖磷酸變位酶中的一種，所述肌醇磷酸合成酶為肌醇-1-磷酸合成酶，所述磷酸肌醇磷酸酶為單磷酸肌醇磷酸酶，磷酸-半乳糖磷酸酶，二磷酸果糖磷酸酶，糖磷酸酶，植酸酶和酸性磷酸酶中的一種。6.權(quán)利要求5所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶為α-葡聚糖磷酸化酶;所述己糖磷酸變位酶為葡萄糖磷酸變位酶;所述肌醇磷酸合成酶為肌醇-1-磷酸合成酶;所述磷酸肌醇磷酸酶為單磷酸肌醇磷酸酶。7.酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，以葡萄糖為單元的多糖或寡糖為原料，在反應(yīng)體系中，同時(shí)或者先后添加多糖磷酸化酶、己糖磷酸變位酶、肌醇磷酸合成酶和磷酸肌醇磷酸酶。8.權(quán)利要求7所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶為α葡聚糖磷酸化酶，糖原磷酸化酶，纖維糊精磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，麥芽糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶，β-l，3-葡聚糖磷酸化酶，α-l，3-葡聚糖磷酸化酶，β_1，2-葡聚糖磷酸化酶，海藻糖磷酸化酶，海帶二糖磷酸化酶，曲二糖磷酸化酶，黑曲寡糖磷酸化酶中的一種，所述己糖磷酸變位酶為葡萄糖磷酸變位酶，甘露糖磷酸變位酶，氨基葡萄糖磷酸變位酶和β葡萄糖磷酸變位酶中的一種，所述肌醇磷酸合成酶為肌醇-1-磷酸合成酶，所述磷酸肌醇磷酸酶為單磷酸肌醇磷酸酶，磷酸-半乳糖磷酸酶，二磷酸果糖磷酸酶，糖磷酸酶，植酸酶和酸性磷酸酶中的一種。9.權(quán)利要求8所述酶法催化制備肌醇的方法，其特征在于，所述多糖磷酸化酶為α-葡聚糖磷酸化酶;所述己糖磷酸變位酶為葡萄糖磷酸變位酶;所述肌醇磷酸合成酶為肌醇-1-磷酸合成酶;所述磷酸肌醇磷酸酶為單磷酸肌醇磷酸酶。10.權(quán)利要求1-9任一方法所制備的肌醇產(chǎn)品，其特征在于，所述肌醇產(chǎn)品中含有葡萄糖、1-磷酸葡萄糖和/或6-磷酸葡萄糖。
【文檔編號(hào)】C12P19/24GK105925643SQ201610398699
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】劉文山, 汪小鋒, 汪衛(wèi)
【申請(qǐng)人】武漢康復(fù)得生物科技股份有限公司