本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到青霉生物催化制備醫(yī)藥中間體2-氨基-3-羥基-苯蟻酸的技術。
背景技術：
生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點,是可持續(xù)發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的應用領域之一,在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。
芳烴的羧化反應是一類重要的反應，其產物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成起始原料。但是，現在的生產采用傳統(tǒng)的化學合成，用芳烴與CO2反應，反應壓力高達10MPa，溫度高達140-380℃，反應選擇性差，副產物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應生產芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應少，產率高。
本發(fā)明將采用微生物催化反應，生產芳烴羥基羧酸：2-氨基-3-羥基-苯蟻酸。
技術實現要素：
本發(fā)明采用青霉催化制備2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應式如下：
底物2-氨基酚 （1）經青霉催化反應，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸（2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用青霉作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，副產物極少，反應收率高。
許多霉菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本發(fā)明選用青霉菌株為CBS 209.28 ，其催化反應效果最佳。
由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應，底物、產物的相間傳質為反應的限制環(huán)節(jié)，所以，還需采取措施，以提高反應速度。增加非均相反應的反應界面，是提高非均相反應的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強烈攪拌下，反應液成為乳液，使得催化反應界面大幅度增加，從而大幅度提高反應速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大量實驗表明，對于本反應，加入直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L是最佳的。
反應結束后，用有機溶劑萃取產物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法：加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂；凝聚法：加入聚合氯化鋁、明礬等；或者將上述2類混合加入；加熱等。不同產物，所用的方法不同，實驗表明，對于本反應，加入1.5%的硫酸鈣+0.06%的聚合氯化鋁是最佳的。
羧化反應中，采用NaHCO3提供CO2,實際上，有多種物質可以提供CO2,但是，通過大量實驗，結果表明，對于本發(fā)明，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3會使反應液的pH升高，而適宜的pH，對微生物催化反應致關重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反應液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應液處于適宜的pH，使微生物能夠正常發(fā)揮生物催化作用。通過大量實驗表明，流加鹽酸水溶液是適宜的方法，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物催化反應正常進行。
可以明顯看出，本發(fā)明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、CO2供體選擇，還有反應溫度，反應時間，反應pH，底物濃度，生物催化反應液成分確定等，眾多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實驗室小試、中試，直到工業(yè)規(guī)模反應，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實驗設計至管重要，如此多的因素，生物催化反應動力學理論分析和實驗工作量巨大。
培養(yǎng)介質：
1、種子培養(yǎng)基成份為: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0.5-0.7g/L;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
2、培養(yǎng)液成份：玉米漿( 以干物質計)含量為27-31g/L， 酵母浸膏9-11 g/L，葡萄糖20-24 g/L，麥芽浸膏15-18g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 6.4。
2、固體培養(yǎng)基成份： 在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
微生物發(fā)酵液制備。青霉CBS 209.28經斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至30-31℃，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V30-31℃培養(yǎng)42-46小時，發(fā)酵液中濕酵母細胞濃度為95-98g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應催化劑。
用HPLC測產品收率及純度，C18柱，紫外檢測器，波長254nm，流動相為pH3的磷酸緩沖液：甲醇=90:10。
生物催化反應：發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物2-氨基酚，使?jié)舛葹?0-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹椋褐辨湹?0碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。
具體實施方式
實施例1
培養(yǎng)液成份：玉米漿( 以干物質計)含量為27-31g/L， 酵母浸膏9-11 g/L，葡萄糖20-24 g/L，麥芽浸膏15-18g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 6.4。
微生物發(fā)酵液制備。青霉CBS 209.28經斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至30-31℃，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V30-31℃培養(yǎng)42-46小時，發(fā)酵液中濕酵母細胞濃度為95-98g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應催化劑。
生物催化反應：15L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 2-氨基酚，使?jié)舛葹?0-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹椋褐辨湹?0碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。
實施例2
培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
生物催化反應：150L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物2-氨基酚，使?jié)舛葹?0-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22 g/L、麥芽糖12-15g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為44-48小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應液體積，反應結束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合并有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。
實施例 3
培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
生物催化反應：1000L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物2-氨基酚，使?jié)舛葹?0-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹椋褐辨湹?0碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合并有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。
實施例 4
培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
生物催化反應：15000L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物2-氨基酚，使?jié)舛葹?0-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹椋褐辨湹?0碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用逆流萃取機萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。