專利名稱：一種高催化效率木聚糖酶xyn10b及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高催化效率木聚糖酶XYNlOB及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞壁主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，三者通過共價鍵和非共價鍵結(jié)合形成一個緊密的結(jié)構(gòu)。半纖維素主要存在于細(xì)胞壁的表面，約占細(xì)胞干重的30% 35%。其中木聚糖是植物半纖維素的主要組成成分之一，也是自然界中除纖維素之外重要的可再生資源。木聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其完全降解需要多種酶協(xié)同作用來進(jìn)行。其中木聚糖酶是木聚糖降解中的最關(guān)鍵酶，它能夠有效地降解木聚糖主鏈的連接批喃木糖的 β _1，4 糖苷鍵(Saha B.Hemicellulose bioconversion.J Ind MicrobiolBiotechnol, 2003, 30:279-291.)。NCBI中數(shù)據(jù)庫中收錄的木聚糖酶基因的分布來看，來源于微生物的木聚糖酶最多，占所有序列的80%以上。而微生物來源的序列中，細(xì)菌和真菌來源的序列又占大多數(shù)。這可能因?yàn)槟揪厶堑慕到饨K產(chǎn)物木糖可以作為微生物的碳源和能源，而微生物要利用木聚糖，就得合成能夠降解木聚糖的酶。根據(jù)氨基酸序列同源性，木聚糖酶歸類于糖苷水解酶家族 10、11、39、43、52、62 和 67 (Henrissat B, Bairoch A.Newfamilies in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acidsequence similarities.Biochem J，1993，293:781-788.)。木聚糖酶在多個領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。木聚糖酶用于紙漿漂白過程，并發(fā)現(xiàn)木聚糖處理后的紙漿需要的化學(xué)漂白劑的用量要比不用木聚糖酶處理少20% 40%。隨后木聚糖酶在造紙工業(yè)上的研究越來越多。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用木聚糖酶預(yù)處理能夠提高漂白效果、增強(qiáng)紙張的強(qiáng)度、優(yōu)化和調(diào)整紙張的性能；木聚糖經(jīng)木聚糖酶作用后的水解產(chǎn)物(低聚木糖)可用作增稠劑、脂肪替代物和抗凍食品添加劑等；飼料里添加酸性木聚糖酶可以有效地降低消化道中食糜的黏度、提高干物質(zhì)的消化率和營養(yǎng)吸收，從而提高飼料的利用率和動物體的抗病性；木聚糖酶在工業(yè)中有著廣闊的應(yīng)用前景。近幾年，在啤酒釀造過程中添加含有木聚糖酶等的復(fù)合酶制劑，可以有效分解麥芽汁中的木聚糖和戊聚糖，降低麥芽汁中的粘度，改善其過濾性能。處理過程中需要溫度在50 80°C，pH在5.0 6.0,因此，需要添加的外源木聚糖酶應(yīng)該在此條件下酶活力最好。本發(fā)明的木聚糖酶最適PH5.5，最適溫度75°C，能很好的滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。此外，其與現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)所用的木聚糖酶相比，具有更高的催化效率，能有效發(fā)揮催化作用，從而降低能耗，提高底物利用率，具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高催化效率木聚糖酶XYN10B。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高催化效率木聚糖酶的基因xynlOB。本發(fā)明 的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重組載體。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述高催化效率木聚糖酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述高催化效率木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述高催化效率木聚糖酶XYNlOB的毛殼菌C8。本發(fā)明提供了一種高催化效率木聚糖酶XYN10B，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:mhlassllflaslpmgmankgkpckkglniIakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadeIrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapIlwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa其中，該酶包括371個氨基酸，N端18個氨基酸為信號肽序列(mhlassllflaslpmgma),因此，成熟的高催化效率木聚糖酶XYNlOB的理論分子量為38.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示:nkgkpckkglnilakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadeIrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapIlwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa本發(fā)明的木聚糖酶XYNlOB在堿性范圍內(nèi)具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性，而且具有很高的催化效率。本發(fā)明的木聚糖酶，其最適PH值為5.5，最適溫度為751:，在551:具有良好的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了編碼上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB。具體地，該基因的序列如 SEQ ID N0.3 所示:ATGCATCTCGCCTCCTCGCTGCTCTTCCTGGCCTCCCTGCCCATGGGGATGGCCAACAAGGGCAAGCCGTGCAAGAAGGGTCTCAACATCCTCGCTAAGCAGGCCGGTCTCAAGTACTTCGGCGCGGCCACCGACTCGCCCGGTCAGCGGGAGCGTGCCGGCTACGAGGCTGCCTACGCGCAGTATGACCAGATCATGTGGAAGTCGGGCGAGTTTGGCCAGACGACGCCCACCAACGGCCAGAAGTGGCTATTCAGCGAGCCCACGCGCGGCGGGTATAACTTCACCGAGGGCGAGATCGTAACGTCCCTGGCCAAGAAGCACGGCTACTACCTGCGGTGCCACGCGCTGGTGTGGCACAGCCAGCTTGCTCCCTGGGTCGAGACGACCGAGTGGACGGCCGACGAGCTGCGGCAGGTGATCGTCGACCACATCACACACGTGATGGGCCACTGGAAGGGCCAGTGCTACGCCTGGGACGTGGTCAACGAGGCGCTCAACGAGGATGGGACCTACCGCGAGTCTGTCTTCTACAAGGTGCTGGGCGAGGAGTACATCAAGCTGGCCTTCAAGACGGCCTCCGAGGTCGACCCGCACGCCAAGCTGTACTACAACGACTACAACCTCGAGTCGCCCAGCGGAAAGACGGCGGGGGCCGCCAATATCGTCAAGATGCTGCGCAAGGAGGGGATCCGCATCGACGGCGTCGGCCTGCAGGCGCATCTGACGGCGGAGCGCCACCCAACCCTCGACCAGCACATCGACGCCATCTCGAGCTTCACCGAGCTCGGCGTCGAGGTCGCCCTCACCGAGCTGGACGTGCGCATCACCATGCCCGCCACGGCCGAGAACCTGGCTCTGCAGAAGGAATCCTACAAGAATGCGGTCGGCGCATGCGTGCAGGTCCGCGGCTGCATCGGCGTGACCATCTGGGACTTCTACGACCCCTTCAGCTGGGTGCCCTACACCTTCCCCGGCCAGGGCGCCCCGCTGCTGTGGTTCGACAA TTTCACGACCCACCCGGCGTATGACGGTGTGGTCGAGGCGTTGACTAACAAGACGAGTCGCGGCAAGGGCAAGGGCAATAGCCGGCGCGCGCAGTTGTGGTCTGCTTGA
本發(fā)明通過RT-PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因xynlOB，cDNA全序列分析結(jié)果表明，木聚糖酶XYNlOB基因xynlOB全長1116bp。其中，信號肽的堿基序列=Atgcatctcgcctcctcgctgctcttcctggcctccctgcccatggggatggcc
因此，成熟的木聚糖酶XYNlOB的基因序列如SEQ ID N0.4所不:aacaagggcaagccgtgcaagaagggtctcaacatcctcgctaagcaggccggtctcaagtacttcggcgcggccaccgactcgcccggtcagcgggagcgtgccggctacgaggctgcctacgcgcagtatgaccagatcatgtggaagtcgggcgagtttggccagacgacgcccaccaacggccagaagtggctattcagcgagcccacgcgcggcgggtataacttcaccgagggcgagatcgtaacgtccctggccaagaagcacggctactacctgcggtgccacgcgctggtgtggcacagccagcttgetccctgggtcgagacgaccgagtggacggccgacgagctgcggcaggtgatcgtcgaccacatcacacacgtgatgggccactggaagggccagtgctacgcctgggacgtggtcaacgaggcgctcaacgaggatgggacctaccgcgagtctgtcttctacaaggtgctgggcgaggagtacatcaagctggccttcaagacggcctccgaggtcgacccgcacgccaagctgtactacaacgactacaacctcgagtcgcccagcggaaagacggcgggggccgccaatatcgtcaagatgctgcgcaaggaggggatccgcatcgacggcgtcggcctgcaggcgcatctgacggcggagcgccacccaaccctcgaccagcacatcgacgccatctcgagcttcaccgagctcggcgtcgaggtcgccctcaccgagctggacgtgcgcatcaccatgcccgccacggccgagaacctggctctgcagaaggaatcctacaagaatgcggtcggcgcatgcgtgcaggtccgcggctgcatcggcgtgaccatctgggacttctacgaccccttcagctgggtgccctacaccttccccggccagggcgccccgctgctgtggttcgacaatttcacgacccacccggcgtatgacggtgtggtcgaggcgttgactaacaagacgagtcgcggcaagggcaagggcaatagccggcgcgcgcagttgtggtctgcttga成熟蛋白理論分子量為39.5kDa，將木聚糖酶基因xynlOB序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLBST比對，證明所述木聚糖酶基因xynlOB是一種新的木聚糖酶基因。本發(fā)明還提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重組載體，優(yōu)選為pPIC9-xynl0Bo將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-xynlOBo本發(fā)明還提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組畢赤酵母菌株GS115/XynlOB。本發(fā)明還提供了一種制備上述高催化效率木聚糖酶XYNlOB的方法，包括以下步驟:I)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶XYN10B的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYN10B。其中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichia pastoris)GS115,得到重組菌株GS115/xynlOB。本發(fā)明還提供了上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的應(yīng)用，優(yōu)選其在水解木聚糖及其在啤酒工業(yè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在啤酒、飼料工業(yè)中應(yīng)用的新的木聚糖酶。本發(fā)明的木聚糖酶最適PH5.5，并在PH5.0 10.0范圍內(nèi)具有很好的pH穩(wěn)定性；最適溫度75°C，在高溫下具有很高的活性。此夕卜，木聚糖酶XYNlOB可有效降解各種不同類型的木聚糖。因此,本木聚糖酶將在啤酒工業(yè)的應(yīng)用中顯示出其巨大的潛力。


圖1重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)對照；1:純化的XYNlOB; 2:脫糖基化的 XYN10B。圖2重組木聚糖酶的最適pH。圖3重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖4重組木聚糖酶的最適溫度。圖5重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體:畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑:內(nèi)切酶購自TAKARA公司，連接酶購自Promega公司。底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基: (I)重組畢赤酵母菌培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基:1000mL馬鈴薯汁，IOg葡萄糖，25g瓊脂，PH5.0。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基:1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 1% 甘油(V/V)。(4) BMMY培養(yǎng)基:除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4.0。說明:以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。實(shí)施例1毛殼菌Chaetomium sp.C8產(chǎn)酶特性將來源于寧夏沙漠表面樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后(富集培養(yǎng)基:(NH4)2S045g/L，KH2PO4Ig/L, MgSO4.7Η200.5g/L, FeSO4.7Η200.01g/L, CaCl20.2g/L,玉米芯粉 0.5 %，麩皮 0.5%,pH5.0)，按常規(guī)稀釋后涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基((NH4) 2S045g/L, KH2PO41g/L, MgSO4.7H200.5g/L，F(xiàn)eSO4.7H200.0lg/L, CaCl20.2g/L，木聚糖 0.5%，1.5% 瓊脂糖，ρΗ5.0)平板上，45°C培養(yǎng)5 6d，挑取產(chǎn)生透明圈菌落在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板劃線分離，重復(fù)劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到該分泌葡聚糖酶的菌株。產(chǎn)透明圈最大的菌株經(jīng)劃線分離純化后定名為C8,經(jīng)18S rDNA鑒定該菌株為毛殼菌,命名為Chaetomium sp.C8。在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后觀察，菌落淺色，氣生菌絲淺色。子囊果表生，球形，卵圓形，頂端有一孔口，子囊殼壁膜質(zhì)，透明或不透。須根根狀，起固定子囊殼和吸收養(yǎng)分的作用，側(cè)生附屬絲較短，似剛毛。內(nèi)含8個子囊抱子，無隔，單細(xì)胞，球形、橢圓形等，成熟前多為灰白色，成熟后呈褐色，檸檬形，厚壁，兩側(cè)平滑，兩端突起，有一個明顯的頂生萌發(fā)孔。實(shí)施例2木聚糖酶編碼基因XYNlOB的克隆提取毛殼菌C8 (Chaetomium sp.C8)基因組 DNA:培養(yǎng)3天后將菌絲離心后取入研缽中，液氮凍制研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，加入2mL CTAB提取液，70°C水浴鍋裂解2h，每隔IOmin混勻一次，在4°C下12000rpm離心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置IOmin后，4°C下12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗漆兩次，真空干燥，加入0.2mL TE溶解，置于_20°C備用。根據(jù)第十家族木聚糖酶基因的保守序列(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)設(shè)計(jì)合成了簡并引物P1，P2
Pl:5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；P2:5’-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3’ 。以毛殼菌C8(Chaetomium sp.C8)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C變性5min ;然后94°C變性30sec，50 °C降落45°C(每個循環(huán)降落0.5 °C )退火30sec，72°C延伸30s，十個循環(huán)；94°C變性30s，48°C退火30s，72 °C延伸30s，30個循環(huán)，72 °C保溫IOmin0得到一約256bp片段，將該片段回收后與pEBSY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各二條TAIL-PCR特異性引物:設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，第二條引物的位置設(shè)計(jì)在第一條引物的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離為50bp左右，引物長度一般20 30nt，退火溫度在60°C。并將它們分別命名為uspl, usp2, usp3(上游特異性引物),dspl, dsp2, dsp3 (下游特異性引物)見表I。表1.木聚糖酶XYNlOB TBIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種高催化效率木聚糖酶XYN10B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQID N0.2 所示。
2.一種高催化效率木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的高催化效率木聚糖酶XYN10B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高催化效率木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3或4所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-xynlOB。
6.包含權(quán)利要求2或3所述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備高催化效率木聚糖酶XYNlOB的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶XYNlOB的表達(dá)；以及 3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYN10B。
9.權(quán)利要求1所述 高催化效率木聚糖酶XYNlOB的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高催化效率木聚糖酶XYN10B及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的高催化效率木聚糖酶XYN10B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的木聚糖酶最適pH5.5，并在pH4.0～10.0范圍內(nèi)具有80%以上的酶活力；最適溫度75℃，具有很高的催化效率為3710ml s-1mg-1。此外，木聚糖酶XYN10B可有效降解各種不同類型的木聚糖。因此，本木聚糖酶將在飼料和食品工業(yè)的應(yīng)用中顯示出其巨大的潛力。
文檔編號C12R1/84GK103232985SQ20131015090
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者詹志春, 張菁, 陳小燕 申請人:武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司