一種超聲波協(xié)同cda酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，以烹飪前、后蝦殼為原料，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎預(yù)處理后，采用EDTA提取其中甲殼素，再以超聲波協(xié)同CDA酶脫乙?；?，制備殼聚糖。與傳統(tǒng)強(qiáng)酸強(qiáng)堿方法相比，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，總制備時(shí)間短，僅需8-12h，EDTA可100%回收重復(fù)使用，不使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染，產(chǎn)品脫乙酰度高達(dá)92-95%、黏度高達(dá)95-105mPa·s。所制備產(chǎn)品呈現(xiàn)白色粉末狀，性質(zhì)穩(wěn)定，可用于食品、醫(yī)藥、生物、化妝品等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及殼聚糖制備領(lǐng)域，具體涉及一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]淡水小龍奸(Red Swamp Crayfish),學(xué)名克氏原螯奸,原產(chǎn)于美國(guó)中南部,現(xiàn)已成為我國(guó)特別是華東地區(qū)淡水養(yǎng)殖蝦類的主要種類之一。甲殼素(C8H13NO5)n是天然存在的N-乙酰葡萄糖胺多糖，小龍蝦殼中甲殼素含量豐富，常用酸堿法提取龍蝦殼甲殼素，環(huán)境污染大。
[0003]殼聚糖(Chitosan)，是由甲殼素經(jīng)脫乙酰基而得，化學(xué)名聚葡萄糖胺(1_4)-2_氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的堿性多糖，廣泛用于紡織、醫(yī)藥、造紙、化妝品、食品工業(yè)、和生物技術(shù)等領(lǐng)域。目前工業(yè)上常用的殼聚糖制備方法均離不開(kāi)強(qiáng)堿的脫乙?；饔?，且產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定、能耗高、環(huán)境污染大，制備時(shí)間長(zhǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，采用EDTA提取龍蝦殼甲殼素，再以超聲波協(xié)同CDA酶脫乙?；?，制備殼聚糖，整個(gè)過(guò)程不使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，EDTA可100%回收重復(fù)使用，成本低、能耗少，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染，產(chǎn)品脫乙酰度高，性質(zhì)穩(wěn)定，制備時(shí)間短。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，包括以下步驟:
(1)蝦殼預(yù)處理:對(duì)于未經(jīng)烹飪的新鮮蝦殼洗凈、烘干、粉碎、置于干燥器中備用；或者對(duì)于烹飪后的蝦殼清理后洗凈，經(jīng)無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇依次洗滌，用蒸餾水洗凈后過(guò)濾、烘干、粉碎、置于干燥器中備用；
(2)甲殼素提取:按料液比Ig:24?30ml稱取蝦殼粉加入質(zhì)量濃度為18-209ffiDTA溶液，EDTA溶液pH值為13，置于超聲波清洗器中攪拌反應(yīng)45-60min，超聲頻率為60KHz、功率為180W-240W，反應(yīng)后過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣，收集濾渣烘干，再用過(guò)氧化氫溶液浸泡脫色，洗凈烘干后的白色粉末為甲殼素；
(3)殼聚糖制備:按料液比Ig:20ml稱取甲殼素粉加入蒸餾水，100°C恒溫水浴l_2h后，置于超聲頻率25KHz，功率400-500W超聲波清洗器中，處理40_60min后，按體積比加入7%-10%的CDA粗酶液，磁力攪拌水浴50°C恒溫酶解2.5-3.5h，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)熱滅活15 min終止酶反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，離心，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干得殼聚糖。
[0006]本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(I)中蝦殼60°C烘干，粉碎過(guò)20目篩。
[0007]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(I)中無(wú)水乙醚洗滌和無(wú)水乙醇洗滌各5次。
[0008]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(2)中收集濾渣50°C烘干，再用質(zhì)量濃度10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡2h脫色。
[0009]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(2)中以蒸餾水洗滌濾渣，提取濾液，用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH=l,使EDTA以酸的形式沉淀回收。
[0010]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(3)中稱取的甲殼素粉過(guò)80目篩。
[0011]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(3)中酶反應(yīng)期間以質(zhì)量濃度為0.lmol/1的NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5，以使酶活性最高。
[0012]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(3)中所述離心條件是指9000rpm離心1min0
[0013]本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟(3)中CDA粗酶液酶活200U/mL左右(以每小時(shí)產(chǎn)生Mg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位)。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下明顯優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明采用EDTA提取龍蝦殼甲殼素，再以超聲波協(xié)同CDA酶脫乙?；苽錃ぞ厶?，利用超聲波“空化作用”，使甲殼素緊密的結(jié)晶體疏松，改善甲殼素脫乙?；?ChitinDeacetylat1n,簡(jiǎn)稱CDA)與甲殼素分子之間的結(jié)合作用，同時(shí)利用CDA酶的高效催化性和專一性，大大縮短脫乙?；鶗r(shí)間，提高產(chǎn)品脫乙酰度和黏度。與傳統(tǒng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿法制備殼聚糖相比，整套制備工藝，不使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，EDTA可100%回收重復(fù)使用，成本低、能耗少，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染，產(chǎn)品脫乙酰度高，性質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)品脫乙酰度高達(dá)92-95%、黏度高達(dá)95-105mPa.s，制備時(shí)間在8_12h，與傳統(tǒng)的時(shí)間在48h以上相比，大幅縮短制備時(shí)間。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為本發(fā)明工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，實(shí)施例不能理解為是對(duì)技術(shù)方案的限制。
[0017]實(shí)施例1:烹飪前新鮮小蝦頭殼殼聚糖制備:將新鮮淡水小龍蝦頭殼洗凈，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎機(jī)粉碎至過(guò)20目篩。稱取一定量烹飪前小龍蝦頭殼粉末于燒杯中，按料液比為lg:30ml的量，加入pH=13的20%的EDTA溶液，置于超聲頻率為60KHz，功率為240W的超聲波清洗器中，攪拌反應(yīng)60min，過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣。收集上述濾渣，于50°C烘干，再以10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡，脫色2h，洗凈烘干后的白色粉末即為甲殼素。將此小龍蝦頭殼甲殼素粉碎至過(guò)80目篩，置于燒杯中，按料液比lg:20ml加入蒸餾水，100°C水浴中加熱預(yù)處理2h后，置于超聲頻率為25KHz，功率為500W的超聲波清洗器中，超聲波預(yù)處理60min后，按體積比加入10%的酶活約200U/mL的CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50°C下恒溫酶解3.5h，期間以0.lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5，以使酶活性最高，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)滅活15min終止酶反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，9000rpm離心lOmin，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干，即得小龍蝦頭殼殼聚糖，殼聚糖脫乙酰度92.38%、黏度 95 mPa.S。
[0018]實(shí)施例2:烹飪前新鮮小龍蝦尾殼殼聚糖制備:將新鮮淡水小龍蝦尾殼(去除頭殼后剩余部分)洗凈，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎機(jī)粉碎至過(guò)20目篩，稱取一定量烹飪前小龍蝦尾殼粉末于燒杯中，按料液比為lg:24ml的量，加入pH=13的18%的EDTA溶液，置于超聲頻率為60KHz，功率為180W的超聲波清洗器中，攪拌反應(yīng)45min，過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣。收集上述濾渣，于50°C烘干，再以10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡，脫色2h，洗凈烘干后的白色粉末即為甲殼素。將此小龍蝦尾殼甲殼素粉碎至過(guò)80目篩，置于燒杯中，按料液比lg: 20ml加入蒸餾水，100°C水浴中加熱預(yù)處理Ih后，置于超聲頻率為25KHz，功率為400W的超聲波清洗器中，超聲波預(yù)處理40min后，按體積比加入7%的酶活約200U/mL的CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50°C下恒溫酶解2.5h，期間以0.lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5，以使酶活性最高，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)滅活15min終止酶反應(yīng),迅速冷卻至室溫，9000rpm離心lOmin，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干，即得小龍蝦尾殼殼聚糖，殼聚糖脫乙酰度93.75%、黏度98mPa.S。
[0019]實(shí)施例3:烹飪前新鮮小龍蝦殼殼聚糖制備:將新鮮淡水小龍蝦殼(包括頭殼、尾殼)洗凈，置于60°C烘箱中烘干，使用粉碎機(jī)粉碎至過(guò)20目篩，稱取一定量烹飪前小龍蝦殼粉末于燒杯中，按料液比為lg: 28ml的量，加入pH=13的19%的EDTA溶液，置于超聲頻率為60KHz，功率為220W的超聲波清洗器中，攪拌反應(yīng)55min，過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣。收集上述濾渣，于50°C烘干，再以10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡，脫色2h，洗凈烘干后的白色粉末即為甲殼素。將此小龍蝦殼甲殼素粉碎至過(guò)80目篩，置于燒杯中，按料液比lg: 20ml加入蒸餾水，100°C水浴中加熱預(yù)處理1.5h后，置于超聲頻率為25KHz，功率為450W的超聲波清洗器中，超聲波預(yù)處理50min后，按體積比加入9%的酶活約200U/mL的CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50°C下恒溫酶解3h，期間以0.lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5，以使酶活性最高，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)滅活15min終止酶反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，9000rpm離心lOmin，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干，即得小龍蝦殼聚糖，殼聚糖脫乙酸度 94.54%、黏度 101 mPa.S。
[0020]實(shí)施例4:烹飪后小龍蝦殼殼聚糖制備:將烹飪后小龍蝦殼洗凈，以無(wú)水乙醚中洗滌5次，再以無(wú)水乙醇抽提5次，用蒸餾水洗凈后過(guò)濾，濾渣于60°C烘箱中烘干，粉碎機(jī)粉碎至過(guò)20目篩。稱取一定量烹飪后小龍奸殼粉末于燒杯中，按料液比為lg:26ml的量,加入PH= 13的18%的EDTA溶液，置于超聲頻率為60KHz，功率為200W的超聲波清洗器中，攪拌反應(yīng)50min，過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣。收集上述濾渣，于50°C烘干，再以10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡，脫色2h，洗凈烘干后的白色粉末即為甲殼素。將此小龍蝦殼甲殼素粉碎至過(guò)80目篩，置于燒杯中，按g/ml料液比1:20加入蒸餾水，100°C水浴中加熱預(yù)處理1.5h后，置于超聲頻率為25KHz，功率為480W的超聲波清洗器中，超聲波預(yù)處理55min后，按體積比加入8%的酶活約200U/mL的CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50°C下恒溫酶解2.5h，期間以0.lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5，以使酶活性最高，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)滅活15min終止酶反應(yīng),迅速冷卻至室溫,9000rpm離心1min,蒸懼水反復(fù)洗漆至中性,沉淀物烘干，即得殼聚糖，殼聚糖脫乙酰度95.12%、黏度105mPa.S。
【權(quán)利要求】
1.一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)蝦殼預(yù)處理:對(duì)于未經(jīng)烹飪的新鮮蝦殼洗凈、烘干、粉碎、置于干燥器中備用；或者對(duì)于烹飪后的蝦殼清理后洗凈，經(jīng)無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇依次洗滌，用蒸餾水洗凈后過(guò)濾、烘干、粉碎、置于干燥器中備用； (2)甲殼素提取:按料液比Ig:24?30ml稱取蝦殼粉加入質(zhì)量濃度為18-209ffiDTA溶液，EDTA溶液pH值為13，置于超聲波清洗器中攪拌反應(yīng)45-60min，超聲頻率為60KHz、功率為180W-240W，反應(yīng)后過(guò)濾并以蒸餾水洗滌濾渣，收集濾渣烘干，再用過(guò)氧化氫溶液浸泡脫色，洗凈烘干后的白色粉末為甲殼素； (3)殼聚糖制備:按料液比Ig:20ml稱取甲殼素粉加入蒸餾水，100°C恒溫水浴l_2h后，置于超聲頻率25KHz，功率400-500W超聲波清洗器中，處理40_60min后，按體積比加入7%-10%的⑶A粗酶液，磁力攪拌水浴50°C恒溫酶解2.5-3.5h，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100°C水浴下連續(xù)熱滅活15 min終止酶反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，離心，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干得殼聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(I)中蝦殼60°C烘干，粉碎過(guò)20目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(I)中所述無(wú)水乙醚洗滌和無(wú)水乙醇洗滌各5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(2)中收集濾渣50°C烘干，再用質(zhì)量濃度10%的過(guò)氧化氫溶液在35°C水浴中浸泡2h脫色。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(2)中以蒸餾水洗滌濾渣，提取濾液，用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH=l，使EDTA以酸的形式沉淀回收。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(3)中稱取的甲殼素粉過(guò)80目篩。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(3)中酶反應(yīng)期間以質(zhì)量濃度為0.lmol/1的NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(3)中所述離心條件是指9000rpm離心lOmin。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波協(xié)同CDA酶制備龍蝦殼殼聚糖的方法，其特征在于:所述步驟(3)中CDA粗酶液酶活200U/mL左右。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK104262507SQ201410600320
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】竇勇, 胡佩紅 申請(qǐng)人:江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院