一種殼聚糖酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因遺傳改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖酶突變體。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼寡糖是甲殼質(zhì)在脫乙酰后形成的殼聚糖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步水解而得到的一種天 然生物高分子，是生物界中大量存在的唯一的一種堿性多糖。殼寡糖其獨(dú)特的功能性質(zhì)使 其在廢水處理、食品工業(yè)、紡織、化工、日用化學(xué)品、農(nóng)業(yè)、生物工程和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛 的用途。我國年產(chǎn)甲殼質(zhì)及衍生物3-4萬噸，產(chǎn)值幾十億元。但是我國甲殼質(zhì)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè) 以粗加工以及原料中間體銷售為主，在產(chǎn)業(yè)中處于弱勢的甲殼質(zhì)資源主要是作為殼聚糖原 料低價(jià)出口或作為低附加值中間體進(jìn)行開發(fā)出口。目前限制甲殼質(zhì)資源開發(fā)利用的關(guān)鍵因 素是主要集中在以下兩個(gè)方面:一是傳統(tǒng)的甲殼質(zhì)原料的化學(xué)法加工工藝技術(shù)粗放，對環(huán) 境的二次或三次污染嚴(yán)重，導(dǎo)致甲殼質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)一直不能形成工業(yè)化生產(chǎn)。二是現(xiàn)代的生 物酶法制備殼寡糖已經(jīng)成為國際大趨勢，但是目前商品化的特異性水解殼聚糖的酶仍被丹 麥的諾維信以及日本的杰能科公司所壟斷，昂貴的價(jià)格成本以及酶自身性質(zhì)的不穩(wěn)定限制 了甲殼質(zhì)以及殼聚糖的開發(fā)。
[0003] 能夠?qū)Ｒ恍运鈿ぞ厶堑拿钢饕嬖谟诩?xì)菌和真菌細(xì)胞中，主要包括殼聚糖酶和 溶菌酶。殼聚糖酶EAGl(GenBank登錄號AB008788)是來自芽孢桿菌Bacillus ehimensis的 一種多糖水解酶。它不僅能將殼聚糖分子中的糖苷鍵切斷，將其水解成不同分子量的殼寡 糖，而且在有機(jī)溶劑與金屬離子中依然保留著良好的催化活性，是一種極具應(yīng)用前景的工 業(yè)用酶。然而，EAG1的熱穩(wěn)定性較差，50°C時(shí)其活性急劇下降。因此，有必要提高殼聚糖酶 EAG1的穩(wěn)定性，提高其在高溫條件下的催化效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，對殼聚糖酶EAGl(GenBank登 錄號AB008788)進(jìn)行改造，獲得了一種新的殼聚糖酶突變體。
[0005] 本發(fā)明提供的殼聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1;
[0006] 編碼上述殼聚糖酶突變體的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2;
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)方面還保護(hù)攜帶有上述編碼基因的重組表達(dá)載體；
[0008] 本發(fā)明再一個(gè)方面保護(hù)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有上述重組表達(dá)載體的宿主菌
[0009] 作為優(yōu)選，所述的宿主菌為畢赤酵母。
[0010] 本發(fā)明的該突變體與殼聚糖酶EAG1相比，具有更優(yōu)良的熱穩(wěn)定性與更高的催化效 率，從而具有更廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0011 ]圖1:殼聚糖酶EAG1與EAG1突變體的氨基酸序列比對結(jié)果圖；
[0012] 圖2:殼聚糖酶EAG1突變體的SDS-PAGE電泳圖；
[0013] 圖3:殼聚糖酶EAG1突變體的熱穩(wěn)定性影響圖；
[0014] 圖4:殼聚糖酶EAG1突變體的熱滅活實(shí)驗(yàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述
[0016] 實(shí)施例1:殼聚糖酶EAG1突變體基因的獲得
[0017] 對殼聚糖酶EAGl(GenBank登錄號AB008788)進(jìn)行突變，具體步驟如下：
[0018]①人工合成一段編碼7個(gè)氨基酸的且富含甘氨酸的核酸片段：
[0019] 5'-ggaggaggatccggaggagga-3';該片段編碼的氨基酸為-GGGSGGG-
[0020]②采用PCR擴(kuò)增的方法將上述序列引入EAG1基因；其中正向引物為 [0021 ] 57 -ggaggaggatccggaggaggaatgcatatgtccaatgcgaaaccat-37 入片段），反向引物為5' -cttcatttcccagttcgtgacttgag-3'，模板為EAG1 基因。
[0022]將上述擴(kuò)增后的含有插入片段的EAG1基因 16°C下用T4DNA連接酶連接12小時(shí)。反 應(yīng)體系如下： EAG1突變基因 2 |iL T4 DNA ligase 1 uL
[0023] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 pL. 雙蒸水
[0024] ③將上述連接成環(huán)的EAG1突變基因進(jìn)行酶切開環(huán)。所用酶為Dnasel，為保證整個(gè) 基因環(huán)只產(chǎn)生一個(gè)切口，所用Dnasel的量為每30yg加入1U Dnasel。
[0025] 反應(yīng)體系如下： _EAG1突變環(huán)狀基因 2 μL UOpig) Dnasel 1 liL (1U)
[0026] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 μL 雙蒸水 6 pL
[0027] 將開環(huán)后的EAG1突變基因通過l%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收900-1000 之間的DNA片段。
[0028] ④設(shè)計(jì)二次擴(kuò)增引物，其中正向引物為5' -atccggtacagcgtcgaacaagcgc-3'，反向 引物為5' -atacacgttatagaaggtttcccaca-3'。以上述瓊脂糖凝膠電泳回收的DNA片段為模 板，采用PCR的方法擴(kuò)增獲得EAG1突變基因。
[0029] 反應(yīng)體系（50μ1)如下： !〇χ buffer 5.0 μL dN'TPs (2.5 mM) 4.0'uL 正向引物（50 mM) 1,0 μL
[0030] 反向引物（50 mM) 1.0 μΕ Taq DNA polymerase 0.5 μL? 模板 1.0 μL^ Η20 37.5 μL
[0031] 最終獲得的殼聚糖酶EAG1突變體的基因序列，該序列含有927個(gè)堿基(SEQ ID Ν0: 2)，編碼309個(gè)氨基酸（SEQ ID NO: 1)，它與EAG1相比，不僅蛋白的一、二級結(jié)構(gòu)排布順序不 同，而且增添了 一段富含甘氨酸的柔性序列（圖1)。
[0032] 實(shí)施例2殼聚糖酶EAG1突變體基因的表達(dá)與蛋白純化
[0033] 將實(shí)施例1得到的殼聚糖酶EAG1突變體基因與表達(dá)載體pIC9K連接通過電轉(zhuǎn)化的 方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中。電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓：1500V;電阻:400 Ω ;電容:25yF;脈 沖時(shí)間：10mS;l-2次電擊。
[0034] 將含有突變基因的轉(zhuǎn)化子接入到BMGY液體培養(yǎng)基中，250-300rpm，28°C培養(yǎng)0D600 至12-16之間時(shí)；3000rpm，離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移到20mL BMMH液體培養(yǎng)基中， 20mLBMMY需使用100mL搖瓶配置，保證一定的通氣量，28°C繼續(xù)培養(yǎng);每隔24小時(shí)在培養(yǎng)基 中加入100 %甲醇至終濃度為0.5 %。培養(yǎng)96小時(shí)，將發(fā)酵上清液離心，用lOKDa超濾膜濃縮， 經(jīng)離子交換柱與分子篩進(jìn)行純化，得到了電泳純的EAG1突變體樣品。
[0035]實(shí)施例3:殼聚糖酶EAG1突變體的酶學(xué)性質(zhì) [0036]①殼聚糖酶EAG1突變體的分子量
[0037]將純化后的EAG1突變體樣品進(jìn)行不連續(xù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為一條電泳帶，根據(jù)已知分 子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜進(jìn)行比較，EAG1突變體的分子量約為34000道爾頓 (34kDa)，該酶為單體蛋白。
[0038]②純化后EAG1突變體的熱穩(wěn)定性與50°C下半衰期
[0039]將純化后的EAG1突變體分別置于40-60°C范圍內(nèi)孵育30分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至冰上冷 卻5分鐘，37°C條件下測定殘余的殼聚糖酶活力，結(jié)果見圖3AAG1突變體的熱穩(wěn)定性與EAG1 相比有了明顯的提高。50°C下的酶活性保持在81%以上。
[0040] 將純化后的EAG1突變體置于50°C孵育0-80分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至冰上冷卻5分鐘，37度 條件下測定殘余的殼聚糖酶活力，結(jié)果見圖4。50°(：下EAG1突變體的半衰期明顯提高，EAG1 在50°C下保溫10分鐘，酶活力下降了50%，保溫50分鐘后酶活力下降了95%』AG1突變體50 °C下半衰期提高到70分鐘，比EAG1提高了 7倍。
[0041]③殼聚糖酶的活力測定：
[0042]殼聚糖酶的活力測定采用二硝基水楊酸(DNS)方法。酶活單位定義：1U表示在上述 條件下每分鐘釋放lymol還原糖所需要的酶量。
[0043] 為測定殼聚糖酶EAG1突變體對殼聚糖的Km和Vmax，將0.5mL不同濃度的殼聚糖溶 液(5、7.5、10、15、20mg/mL)分別與Ο. lmL殼聚糖酶EAG1突變體(最終酶濃度5. OU/mL)混合。 37 °C反應(yīng)lOmin，加入4 · OmL 10 % TCA溶液終止反應(yīng)。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk) 以1 /[S]為橫坐標(biāo)1 /v為縱坐標(biāo)作圖，直線的的斜率為Km/Vmax，截距為1 /Vmax，計(jì)算出動力 學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax(表1)。與EAG1相比，EAG1突變體的最大反應(yīng)速度(Vmax)與催 化效率(Kcat/Km)分別提高了 142%與203%。
[0044] 表1 :EAG1與EAG1突變體的動力學(xué)參數(shù)表
[0045]
[0046] 結(jié)果表明殼聚糖酶EAG1突變體特異性強(qiáng)，可以以內(nèi)切方式有效的打斷殼聚糖中的 β_1，4糖苷鍵。每克殼聚糖添加1.0U單位的EAG1突變體，45°C下水解4個(gè)小時(shí)，可以將殼聚糖 完全分解成聚合度2-8糖的殼寡糖，水解率達(dá)到95%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種殼聚糖酶突變體，其特征在于，所述的突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的殼聚糖酶突變體。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求2或3所述的 基因。5. -種重組菌，其特征在于，所述的重組菌為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求4所述的重組表達(dá) 載體的宿主菌。6. 如權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于，所述的宿主菌為畢赤酵母。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種殼聚糖酶EAG1突變體，其氨基酸序列為SEQ？ID？NO:1。本發(fā)明的該突變體與殼聚糖酶EAG1相比，具有更優(yōu)良的熱穩(wěn)定性與更高的催化效率，對殼聚糖具有快速分解能力。通過對含有突變體基因的酵母工程菌的高效異源表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)殼聚糖酶EAG1突變體的規(guī)模化制備。
【IPC分類】C12N1/19, C12R1/84, C12N9/42, C12N15/81, C12N15/56
【公開號】CN105602921
【申請?zhí)枴緾N201610212888
【發(fā)明人】盛軍, 沙珍霞, 鄭媛, 紀(jì)曉峰, 王致鵬
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年4月7日