一種制備胰凝乳蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，從合格的動物胰臟中制備胰凝乳蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰凝乳蛋白酶chymotrypsin，是一種典型的絲氨酸蛋白酶，脊椎動物的消化酶。EC 3.421.1。在胰臟中以酶前體物質(zhì)胰凝乳蛋白酶原的形態(tài)生物合成，隨胰液分泌出去。在小腸受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，轉(zhuǎn)變成活性的胰凝乳蛋白酶。
[0003]胰凝乳蛋白酶經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，在醫(yī)藥方面主要作為治療藥物:(1).用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合(2)抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫(3)乳房手術(shù)后浮腫、中耳炎、鼻炎等(4)本品對眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，故可用于白內(nèi)障摘除，使晶狀體比較容易地移去。
[0004]藥用的胰凝乳蛋白酶主要從牛胰臟中提取，而本發(fā)明是靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，使用磷酸鹽、丙酮、硫酸銨等價(jià)格便宜的輔料，制備胰凝乳蛋白酶，不僅在一定程度上降低了成本，且產(chǎn)品的收率也能達(dá)到20萬單位/kg胰臟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是從合格的動物胰臟中提取胰凝乳蛋白酶。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將合格的動物胰臟經(jīng)過絞碎后，靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨鹽析結(jié)晶等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰凝乳蛋白酶的方法。本發(fā)明操作簡單、成本低，非常適合于規(guī)?；笊a(chǎn)。包括如下步驟:
(1)水解:將新鮮或冷凍豬胰臟絞碎置于容器中，加入2~5倍量0°C以下的丙酮，在0°C左右攪拌脫水0.5-1.5小時(shí)，離心得沉淀物，加入0.5-1.5倍量的水及0.01-0.02倍量胰酶攪拌溶解，用6%~10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值至6.0-9.0，于15°C ~25°C保溫?cái)嚢?~3小時(shí)，再加入娃藻土充分?jǐn)嚢?，過濾；
(2)沉淀:收集濾液與1.5~3倍量丙酮攪勻，靜置10~14小時(shí)，虹吸棄去上層丙酮清液，用1.5-2倍量丙酮分3?4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，即得胰凝乳蛋白酶粗品；
(3)提純:將粗品與45~60倍量磷酸緩沖液攪拌0.5-1.5小時(shí)，于15°C ~25°C靜置15-25小時(shí)，按照溶液的體積加入其量約3%~7%的硅藻土拌勻，過濾。往濾液中加入硫酸銨，至硫酸銨濃度達(dá)35%~45%。過濾，得鹽析物；將鹽析物再按lg:8~10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，0°C ~8°C下靜置48~72小時(shí)，慢慢形成針狀結(jié)晶，過濾；
(4)干燥:濾取晶體并用水沖洗3~5次，冷凍干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0008]實(shí)施例1
所述的利用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨結(jié)晶等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰凝乳蛋白酶的方法，包括如下步驟:
1.水解:將新鮮豬胰臟絞碎置于容器中，加入3倍量0°C的丙酮，在0°C左右攪拌脫水1小時(shí)，離心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶攪拌溶解，用8%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值至7.5，于20°C保溫?cái)嚢?小時(shí)，再加入0.01倍量硅藻土充分?jǐn)嚢瑁^濾。
[0009]2.沉淀:收集濾液與2倍量丙酮攪勻，靜置12小時(shí)，虹吸棄去上層丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，約得120g胰凝乳蛋白酶粗品。
[0010]3.提純:將粗品與52倍量磷酸緩沖液攪拌混合1小時(shí)，于20 V靜置20小時(shí)，加入其量約5%的娃藻土拌勾，過濾。往濾液中加入硫酸錢至濃度達(dá)40%，過濾，約得35g鹽析物；將鹽析物再按lg: 10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，4°C下靜置72小時(shí)，慢慢形成針狀結(jié)晶，過濾。
[0011]4.干燥:濾取晶體并用水沖洗3次，冷凍干燥，約可得4.5g胰凝乳蛋白酶。
[0012]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種制備胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)水解:將新鮮或冷凍動物胰臟絞碎置于容器中，加入丙酮攪拌脫水，離心得沉淀物，加入水及胰酶攪拌溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值，保溫?cái)嚢?，再加入硅藻土充分?jǐn)嚢瑁^濾； (2)沉淀:收集濾液，加入丙酮攪勻，靜置，虹吸棄去上層丙酮清液，然后用丙酮洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥；得胰凝乳蛋白酶粗品； (3)提純:將粗品用磷酸緩沖液溶解，攪拌混合，靜置，然后加入硅藻土拌勻，過濾；往濾液中加入硫酸銨，過濾后可得鹽析物；將鹽析物再溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，靜置，過濾； (4)濾取晶體并用水沖洗，冷凍干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，丙酮與胰臟的比例為2~5L:lkg，丙酮溫度0°C以下；氫氧化鈉溶液濃度為6%~10% ;溶液的pH值調(diào)節(jié)到6.0-9.0 ;于15°C ~25°C保溫?cái)嚢杓s1~3小時(shí)；過濾前，加入硅藻土進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，丙酮與濾液的體積比為1.5-3:1 ；靜置時(shí)間為:10~14小時(shí)；棄去上清液后，用丙酮洗滌沉淀物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，粗品與磷酸緩沖液的比例是:lg:45~60ml ;溶液于15°C ~25°C靜置15~25小時(shí)；按照溶液的體積加入其量3%~7%重量的硅藻土 ；往濾液中加入硫酸銨的量為使溶液的濃度達(dá)到35%~45% ;鹽析物與碳酸緩沖液的比例是:lg:8~10ml ;加入飽和硫酸銨溶液的量為至溶液微渾；靜置溫度是:0°C ~8°C，時(shí)間為:48~72小時(shí)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:得到的胰凝乳蛋白酶晶體要進(jìn)行冷凍干燥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備胰凝乳蛋白酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是將動物胰臟經(jīng)過絞碎，靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰凝乳蛋白酶。本發(fā)明操作簡單、成本低，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。
【IPC分類】C12N9/76
【公開號】CN105368810
【申請?zhí)枴緾N201510826531
【發(fā)明人】劉乃山, 趙葉華, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月25日