專利名稱：來自微生物的改進型凝乳蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自于微生物的蛋白酶，所述蛋白酶具有改進的凝乳活性。所述蛋白酶優(yōu)選用于奶酪的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
小牛粗制凝乳酶(calf rennet)已經(jīng)作為可凝乳的酶(milk-clotting enzyme) 被用于生產(chǎn)奶酪許多年。小牛粗制凝乳酶的凝乳活性主要歸功于凝乳酶(chymosin)，該凝乳酶為酸性蛋白酶，對乳酪蛋白(milk casein)具有位點特異性的蛋白酶活性，同時具有較低的位點非特異性活性(特異性地水解κ-酪蛋白氨基酸序列中105位的苯丙氨酸和106 位的甲硫氨酸之間的肽鍵)。非特異性蛋白酶活性被認為導(dǎo)致奶酪生產(chǎn)的產(chǎn)率降低并在成熟過程中生成苦味的肽。由于這個原因，凝乳酶是一種出色的可凝乳的酶。然而，小牛屠宰的減少和奶酪需求的增加使得很難提供所述小牛粗制凝乳酶。 現(xiàn)今，來自微生物(如米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和微小根毛霉(Rhizomucor pusillus))的可凝乳的酶以及通過將小牛凝乳酶基因?qū)胝婢蚪湍干a(chǎn)的重組凝乳酶已被廣泛用作可凝乳的酶。與小牛凝乳酶或重組凝乳酶相比，上述來自微生物的可凝乳的酶具有更高的非特異性蛋白酶活性。問題是作為可凝乳的酶的重要特征的C/P比(凝乳活性與蛋白酶活性的比)低。為克服這一缺陷，在微小根毛霉中表達和評價通過基因工程的定點突變得到的所述可凝乳的酶的變體基因。在該變體中，通過用丙氨酸替換所述可凝乳的酶的氨基酸序列中19位的谷氨酸，與野生型的C/P比相比，其C/P比有所提高(非專利文件1)。然而，進行所述氨基酸替換后，所述可凝乳的酶變體的凝乳活性降低了約40%，所以很難將這樣的酶投入實際應(yīng)用。因此，期望能得到來自于微生物的、具有高C/P比且凝乳活性得以維持或提高的可凝乳的酶。此外，已經(jīng)嘗試了利用二羧酸酐對來自于微生物(如微小根毛霉和米黑根毛霉) 的可凝乳的酶進行?；蕴岣逤/P比(專利文件1)。根據(jù)這一方法，得到了一些改進，然而，這些仍然無法令人滿意。[專利文件1]日本專利No. 2-18834B[非專利文件 1]J. Biochem. 129，791-794，200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于凝乳的蛋白酶，其中，所述蛋白酶水解除 κ -酪蛋白的氨基酸序列中105位的苯丙氨酸和106位的甲硫氨酸之間的肽鍵以外的肽鍵的活性(下文中還稱為“非特異性蛋白酶活性”)很低，并且凝乳活性得以維持或提高。本發(fā)明的發(fā)明人等進行了深入的研究以克服上述問題，在生產(chǎn)可凝乳的酶的微生物的突變株中分離得到了生產(chǎn)C/P比提高的可凝乳的酶的突變株，所述C/P比的提高是由于非特異性蛋白酶活性的降低；分離得到了改進型可凝乳的酶的基因；測定了所述基因的核苷酸序列；表達了該基因；并測定了所述改進型可凝乳的酶的凝乳活性和C/P比，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了一種來自于微生物的具有凝乳活性的蛋白酶，所述蛋白酶的凝乳活性得以維持或提高并且C/P比提高；本發(fā)明還提供了編碼該蛋白酶的DNA、包含該 DNA的載體和導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明一方面在于提供一種改進型蛋白酶，所述改進型蛋白酶含有與SEQ ID NO 3具有至少75% —致性的氨基酸序列。所述改進型蛋白酶具有至少一種突變，所述突變選自由下述突變組成的組(A)利用酸性氨基酸替換對應(yīng)于SEQ ID NO 3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺； 和(B)利用酸性氨基酸替換SEQ ID NO :3中266位的谷氨酰胺；其中，所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。本發(fā)明另一方面在于提供上述的改進型蛋白酶，該蛋白酶選自由下述蛋白質(zhì)組成的組(A)包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換；(B)包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換，以及除265位和266位的氨基酸以外，還有不多于10個氨基酸(優(yōu)選不多于5個氨基酸，更優(yōu)選不多于3個氨基酸，進一步優(yōu)選不多于2個氨基酸)被取代、缺失、插入或添加；其中，所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。本發(fā)明又一方面在于提供上述的改進型蛋白酶，其中所述酸性氨基酸為谷氨酸或天冬氨酸。本發(fā)明又一方面在于提供上述的改進型蛋白酶，其中19位的谷氨酸被纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸替換。本發(fā)明又一方面在于提供上述的改進型蛋白酶，其中81位的蘇氨酸被谷氨酰胺或天冬氨酸替換。本發(fā)明還有一方面在于提供編碼上述改進型蛋白酶的DNA。本發(fā)明還有一方面在于提供包含上述DNA的表達載體。本發(fā)明還有一方面在于提供導(dǎo)入上述表達載體的轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明還有一方面在于提供上述的轉(zhuǎn)化細胞，所述轉(zhuǎn)化細胞為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0本發(fā)明還有一方面在于提供生產(chǎn)具有凝乳活性的改進型蛋白酶的方法，該方法包含如下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化細胞；以及收集所述培養(yǎng)基中的所述改進型蛋白酶。因為凝乳活性得以維持或提高并且C/P比高，期望利用本發(fā)明的改進型酶實現(xiàn)較高的奶酪生產(chǎn)率。此外，較高的C/P比通常意味著成熟過程中在奶酪里出現(xiàn)的苦味減少， 即，利用所述改進的酶可制造出高品質(zhì)的奶酪。


圖1示出表達載體JS4的結(jié)構(gòu)。圖2示出來自于微小根毛霉的蛋白酶(RMPP)與來自于米黑根毛霉的蛋白酶 (RMMP)的序列比對。
具體實施例方式
下文將詳細闡述本發(fā)明。1.本發(fā)明的改進型蛋白酶(可凝乳的酶)本發(fā)明的改進型蛋白酶含有與SEQ ID NO 3具有至少75% —致性的氨基酸序列， 該蛋白酶具有至少一種突變，所述突變選自由下述突變組成的組(A)利用酸性氨基酸替換對應(yīng)于SEQ ID NO 3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺； 和(B)利用酸性氨基酸替換SEQ ID NO :3中266位的谷氨酰胺；并且所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。上述酸性氨基酸的實例包括谷氨酸和天冬氨酸。本發(fā)明的改進型蛋白酶優(yōu)選與SEQ ID NO 3的完整氨基酸序列的序列一致性不低于90%，更優(yōu)選不低于95%。在一個實施方式中，通過將突變引入來自于米黑根毛霉的野生型蛋白酶(SEQ ID NO 3)中而得到本發(fā)明的改進型蛋白酶。在該實施方式中，本發(fā)明的改進型蛋白酶選自由下述蛋白質(zhì)組成的組(A)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和/ 或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換；(B)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和 /或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換，以及除265位和266位的氨基酸以外，還有不多于10個氨基酸被取代、缺失、插入或添加；并且所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。圖2示出來自于米黑根毛霉的蛋白酶與來自于微小根毛霉的蛋白酶的序列比對。 在這兩個序列中，265位和266位的氨基酸是保守的，所以也可通過將突變引入來自于微小根毛霉的野生型蛋白酶(SEQ ID NO 43)中而得到本發(fā)明的改進型蛋白酶。即，在另一個實施方式中，本發(fā)明的改進型蛋白酶可以是包含SEQ ID NO :43的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換。另外，只要具有凝乳活性，除265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺的替換之外，該改進型蛋白酶可具有其它的突變(取代、缺失、插入或添加不多于10個氨基酸)。在本發(fā)明的改進型蛋白酶中，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列的19 位的谷氨酸和81位的蘇氨酸可被其它氨基酸替換。19位的谷氨酸優(yōu)選被纈氨酸、丙氨酸、 異亮氨酸或亮氨酸替換，而81位的蘇氨酸優(yōu)選被谷氨酰胺或天冬氨酸替換。在本發(fā)明中，“265位”、“266位”、“19位”和“81位”并不是必然表示從所述蛋白酶N端起的絕對位置，而是表示與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列相比的相對位置。例如，在含有SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列的蛋白酶中，當(dāng)265位的N端側(cè)某一位置缺失了一個氨基酸，上述的265位即變?yōu)?64位。即使在這一情況下，所述從N端殘基起計數(shù)為264位的氨基酸在本發(fā)明中仍為“265位”的氨基酸。通過將感興趣的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列比對而確定所述氨基酸的絕對位置。術(shù)語“對應(yīng)于”表示的氨基酸也是指在與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列相比時相對位置處的氨基酸。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :43為成熟型蛋白酶的氨基酸序列。本發(fā)明的改進型蛋白酶可包含信號肽和前肽等的氨基酸序列。根據(jù)本說明書的實施例中記載的方法，通過從生產(chǎn)具有凝乳活性和較低C/P比的野生型蛋白酶的微生物中培育生產(chǎn)高C/P比的改進型蛋白酶的突變株，并將該突變株在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可從所述突變株的細胞或從培養(yǎng)基中得到本發(fā)明的改進型蛋白酶。所述生產(chǎn)具有較低c/ρ比的野生型蛋白酶的微生物的示例包括米黑根毛霉(ATCC16457)、微小根毛霉(ATCC16458)的野生型菌株及其衍生菌株。這些菌株可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC ；P. 0. Box 1549 Manassas, VA 20108 USA)購得。也可通過從上述突變株中分離編碼所述改進型蛋白酶的DNA并表達該DNA而獲得本發(fā)明的改進型蛋白酶。此外，也可通過從米黑根毛霉(ATCC16457)、微小根毛霉(ATCC16458)的野生型菌株或其衍生菌株中分離編碼SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列的DNA，并通過定點突變對所述DNA進行修飾以編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶，隨后表達該修飾的DNA而得到本發(fā)明的改進型蛋白酶。上述DNA的表達可通過構(gòu)建含有上述DNA的表達載體并將之導(dǎo)入宿主細胞而實現(xiàn)。盡管所述宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，但是優(yōu)選真核細胞。真核細胞的示例包括酵母細胞、真菌細胞和植物細胞。優(yōu)選酵母細胞，并且特別優(yōu)選釀酒酵母細胞。此外，上述DNA的表達也可在無細胞系統(tǒng)中實現(xiàn)。與對應(yīng)的野生型蛋白酶(SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 43)的C/Ρ比相比，本發(fā)明的改進型蛋白酶的C/Ρ比更高。本發(fā)明的改進型蛋白酶的C/Ρ比優(yōu)選不低于野生型蛋白酶 (SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 43)的C/Ρ比的1. 2倍、更優(yōu)選不低于野生型蛋白酶(SEQ ID NO 3或SEQID NO 43)的C/Ρ比的1. 5倍、進一步優(yōu)選不低于野生型蛋白酶(SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 43)的 C/Ρ 比的 2. 0 倍。本文的C/Ρ比是指[凝乳活性(MCA)]/[蛋白酶活性(PA)]?？赏ㄟ^下述方法測定PA和MCA。對于MCA的測定，盡管有國際標(biāo)準(zhǔn)方法(記載于IS015174中，IDF176 ；第一 IK 2002-09-01, Self-imposed Specifications for Food Additives)，通過下述方法計算本說明書中的MCA值(本文稱為Meito法)。[1] PA 的測定將由奶制得的酪蛋白(WakoPure Chemical Industries,Ltd.制造)溶于 0. 05M 的磷酸氫二鈉溶液中，并用lmol/1的鹽酸試液調(diào)節(jié)pH至6.0，以制備0. 6 %的酪蛋白底物溶液。將適當(dāng)稀釋的0. 2ml試樣加入到Iml的上述底物溶液中。使該混合物在37°C下反應(yīng)10到30min，然后通過加入Iml的反應(yīng)終止液(0. 1 lmol/1三氯乙酸、0. 21mol/l無水乙酸鈉和0. 33mol/l乙酸的混合溶液)終止該反應(yīng)。通過離心得到上清，并將Iml的 0. 55mol/l的無水碳酸鈉加入到0. 4ml的該上清中，然后加入0. 2ml稀釋2倍后的酚試劑 (Folin-Ciocalteu 試劑，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)。將該混合物在37°C反應(yīng)30min，隨后在660nm下測定吸光度(光程長度1cm)。單獨地，將Iml反應(yīng)終止液加入到Iml的底物溶液中，然后加入0. 2ml的試樣。此后，通過同樣的操作制備所述混合物，所得物被用作空白。將用試樣的吸光度減去空白的吸光度得到的值轉(zhuǎn)化為游離酪氨酸的含量以計算出PA值。PA的單位為單位/ml。該1單位是指在上述方法中，在Imin內(nèi)使得相當(dāng)于1 μ mol酪氨酸的酚試劑顯色物增加的酶的量。如下所述，還通過制作酪氨酸的校準(zhǔn)曲線得到了酪氨酸和酚試劑顯色物的關(guān)聯(lián)方程。酪氨酸校準(zhǔn)曲線將標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸(分子量181. 2，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造)在 105°C干燥池。隨后精確稱量0. 050g的該標(biāo)準(zhǔn)品并溶于0. 2mol/l鹽酸試液中以精確達到 50ml的終體積。精確量取lml、2ml、3ml和細1的該溶液并在每一溶液中加入0. 2mol/l的鹽酸試液以精確達到IOOml的體積。精確量取2ml各溶液。然后，加入5ml的0. 55mol/l 的碳酸鈉試液和Iml稀釋兩倍后的酚試劑。緊接著，將混合物振蕩混合并在37士0. 5°C靜置30min。從得到的溶液中，準(zhǔn)確取出2ml的0. 2mol/l的鹽酸試液，并在660nm的波長下， 與以類似方式制備的對照溶液一起，測定吸光度A1、A2、A3及A4。通過以吸光度A1、A2、A3 和A4為縱軸，并以2ml的各溶液中的酪氨酸的量(μπιο )為橫軸，制得校準(zhǔn)曲線，以確定吸光度差異為1的酪氨酸的量(μπιο )。[2]MCA 測定方法(Meito 法)將脫脂奶粉(nonfat dry milk)(優(yōu)選為CHR. HANSEN制造的)以10%的比例溶于 0. OlM的氯化鈣(pH 6. 0)中以用作底物。將試樣溶液(0. 5ml)制備成凝乳塊在2到5min 內(nèi)、優(yōu)選在anin 30s內(nèi)形成的濃度，將所述試樣溶液加入到5ml的上述底物中，將混合物在 35°C保溫。當(dāng)用玻璃棒攪拌該混合物時，觀察凝乳塊的形成以測定形成的時間。與經(jīng)相似方式測定的MCA已知的標(biāo)準(zhǔn)品的值比較，通過計算在單位時間內(nèi)每單位量的試樣能凝結(jié)的底物所增加的量(以倍數(shù)形式表示)來確定MCA。計算方程式如下MCA(Mu/ml) = SX (TsXWj/(TXff)S 可凝乳的酶的標(biāo)準(zhǔn)品的特異性活性(Mu/g)Ts 標(biāo)準(zhǔn)液的凝乳時間(s)Ws Iml標(biāo)準(zhǔn)液中的標(biāo)準(zhǔn)品的量(g)T 試樣溶液的凝乳時間(S)W Iml試樣溶液中的試樣的量(ml)此外，也可通過對試樣中含有的蛋白質(zhì)的總量進行定量來計算每單位蛋白量的 MCA。在后面記載的實施例13中，以每Img的蛋白質(zhì)來計算MCA(Mu/mg蛋白質(zhì))。通過上述方法計算得到的MCA值與通過國際標(biāo)準(zhǔn)(記載于IS015174中，IDF 176 ； 第一版2001-09-01 ,Self-imposed Specifications For Food Additives)計算得到的MCA 值有關(guān)聯(lián)。該關(guān)聯(lián)可通過下述公式示出1 國際標(biāo)準(zhǔn)單位(IMCU/ml) ^ IMeito 法單位(Mu/ml)/100優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白酶的MCA大體上等于或高于野生型蛋白酶的MCA。當(dāng)在相同的條件下制備本發(fā)明的蛋白酶和野生型的蛋白酶(SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 43)以比較 MCA時，本發(fā)明的改進型蛋白酶的MCA優(yōu)選不低于野生型蛋白酶的MCA的0. 8倍，更優(yōu)選不低于野生型蛋白酶的MCA的0. 9倍，進一步優(yōu)選不低于野生型蛋白酶的MCA的1. 0倍。
在相同的條件下制備本發(fā)明的改進型蛋白酶和野生型蛋白酶的一個實例包括將編碼這兩種酶的DNA分別插入到相同的基因表達載體中，在相同條件下將該表達載體導(dǎo)入同樣的細胞株中，并在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述細胞，以得到作為蛋白酶溶液的培養(yǎng)物。可通過相同的方式濃縮或通過相同的方式純化所得到的培養(yǎng)物來使用。2.編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA 本發(fā)明的DNA是編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA。本發(fā)明的DNA的具體實例包括含有SEQ ID NO :1中的208位到1290位核苷酸的DNA ；含有在嚴格條件下與和SEQ ID NO 1中208位到1290位的核苷酸互補的核苷酸序列雜交的序列的DNA ；所述DNA編碼具有上述特性的改進型蛋白酶。本發(fā)明的DNA的具體實例也包括含有SEQ ID NO 42的核苷酸序列的DNA ；含有在嚴格條件下與和SEQ ID NO 42的核苷酸互補的核苷酸序列雜交的序列的DNA ；所述DNA編碼具有上述特性的改進型蛋白酶。嚴格條件是指形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。盡管該條件因核苷酸序列或其長度而不同，其實例包括具有高同源性(例如，具有不低于75%、優(yōu)選不低于90%、進一步優(yōu)選不低于95%的同源性)的DNA相互雜交，而同源性低于上述標(biāo)準(zhǔn)的DNA不雜交的條件；或Southern雜交中用于漂洗的常用條件的雜交條件(60°C和1XSSC、0. 1% SDS，優(yōu)選0. IX SSC和相當(dāng)于0. 1% SDS的鹽濃度)?？赏ㄟ^常規(guī)的基因克隆方法從具有上述改進型蛋白酶的突變株中分離得到編碼本發(fā)明的蛋白酶的DNA。例如，可通過與基于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :42的核苷酸序列的合成寡核苷酸探針雜交，從上述突變株的基因文庫中選擇所述DNA而分離。還可通過下述步驟得到編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA 基于野生型蛋白酶基因已知的基因組DNA或cDNA的核苷酸序列設(shè)計引物，并利用該引物從上述突變株的基因組 DNA和cDNA文庫中擴增所述DNA。通過將定點突變引入野生型DNA得到的DNA也包含在編碼本發(fā)明的蛋白酶的DNA 中。例如，可通過從米黑根毛霉野生型菌株(ATCC16457)或其衍生菌株中分離編碼 SEQ ID NO :3的氨基酸序列的DNA并將定點突變引入其中而很容易地獲得編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA。也可通過從微小根毛霉野生型菌株(ATCC16458)或其衍生菌株中分離編碼SEQ ID NO :42的氨基酸序列的DNA并將定點突變引入其中而獲得編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可使定點突變的引入得以實現(xiàn)。例如，可通過合成一端具有限制性酶切位點和另一端含有突變位點的引物，并利用突變部分替換未發(fā)生突變的基因中的相應(yīng)部分(盒式突變法)引入突變。作為引入定點突變的方法，例如，Gapped duplex法和Kunkel法都是已知的。所述 Kunkel法基于如下原理將未發(fā)生突變的基因克隆入單鏈?zhǔn)删w中；利用含有針對突變點的錯配的合成的DNA作為引物合成互補鏈；然后，僅以得到的含有突變的互補鏈作為模板， 制得新的噬菌體和復(fù)制的DNA?？衫每缮藤彽脑噭┖型瓿伤龆c突變。3.本發(fā)明的表達載體本發(fā)明的表達載體用于表達本發(fā)明的改進型蛋白酶。它可具有如下的結(jié)構(gòu)控制所述DNA表達的啟動子序列連接到編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA的上游。此外，還可以將終止子連接到所述DNA的下游。作為上面所述的啟動子，當(dāng)宿主是大腸桿菌時，可使用trp、lac、taq、入？,等。當(dāng)宿主是酵母時，優(yōu)選GAL7、ADH、TPI或PH05等的啟動子，在這些啟動子中，優(yōu)選GAL7是因為它能強力地啟動基因表達(Nogi Y.等，Nucl. Acids Res. 11，8555-8568 (1983))。所述終止子的實例包括TPI、GAPDH和GALlO的終止子。通過將上述的啟動子、編碼本發(fā)明的改進型蛋白酶的DNA和上述終止子以從5'上游到3'下游的順序連接，并將所得物插入載體中，可構(gòu)建本發(fā)明的表達載體。作為可在酵母中復(fù)制的載體，可使用所謂的Yip、YRp、YEp和YCp質(zhì)粒中的任何類型。從拷貝數(shù)和穩(wěn)定性的角度來看，優(yōu)選YEp型。由于這些質(zhì)粒通常包含不必要序列，考慮到質(zhì)粒的穩(wěn)定性，或為了利于質(zhì)粒的修飾，優(yōu)選刪除所述不必要序列。用于挑選重組體的選擇標(biāo)記基因或用于檢測導(dǎo)入基因表達的報告基因也可插入本發(fā)明的表達載體中。選擇標(biāo)記基因的實例包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。報告基因的實例包括葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)基因、熒光素酶(LUC)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因。此外，為了以分泌型表達本發(fā)明的改進型蛋白酶或為了便于純化所表達的蛋白酶，本發(fā)明的表達載體中可包含附加序列。在這種情況下，本發(fā)明的蛋白酶以融合蛋白(與附加序列編碼的蛋白或肽融合)的形式表達。所述附加序列的實例包括編碼信號肽或前肽的核苷酸序列及編碼His標(biāo)簽或GST 標(biāo)簽的核苷酸序列。4.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞是導(dǎo)入本發(fā)明的表達載體的細胞，該細胞能生產(chǎn)本發(fā)明的改進型蛋白酶。盡管該細胞可以是原核細胞或可以是真核細胞，優(yōu)選為真核細胞。所述真核細胞的實例包括酵母細胞、真菌細胞和植物細胞。優(yōu)選酵母細胞，尤其優(yōu)選釀酒酵母。釀酒酵母的實例包括SHY3、D13-1A和MC16菌株?？筛鶕?jù)宿主細胞的類型適當(dāng)選擇將表達載體導(dǎo)入宿主細胞的方法。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可通過以下方法獲得釀酒酵母的轉(zhuǎn)化體將釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物(Difco制造)、2%細菌用蛋白胨 (Difco制造)和2%葡萄糖)中過夜培養(yǎng)，然后以10%的終體積接種至新鮮YPD培養(yǎng)基并在30°C培養(yǎng)4h。利用臺式離心機輕微離心得到的培養(yǎng)物(1.5ml)以收集細胞。利用0. 2M LiSCN(Kanto Chemical Co.，INC.制造)漂洗所得細胞并懸于 0. 02ml 的 IM LiSCN 中。隨后，將0. Olml的含有表達載體(約1到10 μ g)的溶液和0. 03ml的70%PEG4000 混合，將混合物置于30°C下lh。通過加入0. 14ml的無菌水稀釋該混合物，然后涂布于兩塊SDah平板(0. 67%無氨基酸細菌用酵母氮基、2%葡萄糖、0. 002%硫酸腺嘌呤、0. 002% L-組氨酸-鹽酸、2%瓊脂)上。在30°C下培養(yǎng)2到3天后，可得到所述轉(zhuǎn)化體。5.生產(chǎn)本發(fā)明的具有凝乳活性的改進型蛋白酶的方法通過培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞，可生產(chǎn)本發(fā)明的改進型蛋白酶，通過與信號肽的融合蛋白的形式表達本發(fā)明的改進型蛋白酶以用于分泌，本發(fā)明的蛋白酶可在培養(yǎng)基中積累。當(dāng)使用誘導(dǎo)型啟動子時，優(yōu)選在培養(yǎng)期間進行誘導(dǎo)。盡管培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞的方法隨細胞的類型而不同，但可以使用傳統(tǒng)方法。
培養(yǎng)所述釀酒酵母轉(zhuǎn)化體的方法的實例如下所述在500ml的^ikaguchi燒瓶中的50ml YPD培養(yǎng)基中，于30°C下振蕩培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體兩天，以使酵母細胞增殖。將該培養(yǎng)基于1000 Xg下離心5min以收集細胞。將該細胞重懸于IOOml的YPGal培養(yǎng)基(1 %酵母提取物、2%細菌用蛋白胨、4%半乳糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造))，并在 500ml 的 Sakaguchi 燒瓶中于 30°C下振蕩培養(yǎng)三天。當(dāng)所述具有凝乳活性的蛋白酶(分泌到培養(yǎng)基中的蛋白酶)處在存在于培養(yǎng)物上清中的狀態(tài)時，可被使用；也可通過濃縮所述培養(yǎng)物上清使用所述蛋白酶?？杉兓虿糠旨兓鼍哂心榛钚缘牡鞍酌?分泌到培養(yǎng)基中的蛋白酶)。利用蛋白純化的一般方法，可實現(xiàn)純化或部分純化。例如，可以使用包括色譜(如離子交換或凝膠過濾)、硫酸銨鹽析或有機溶劑沉析技術(shù)。還可通過凍干、超濾膜和有機溶劑沉析等濃縮所述純化后的酶。實施例下文通過實施例具體描述本發(fā)明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍并不局限于這些示例性的說明。而且，所有的基因操作可按Molecular Clonging(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))所記載的進行。實施例1生產(chǎn)具有提高的C/P比的蛋白酶的米黑根毛霉突變株的獲得將生產(chǎn)蛋白酶的米黑根毛霉的親本株(CBS182_67(ATCC16457的衍生菌株))進行突變處理，從而獲得分泌具有提高的C/P比的蛋白酶的突變株。細節(jié)如下所示。(1)突變處理米黑根毛霉親本株在麥芽平板麥芽提取物、2%葡萄糖、0. 蛋白胨、2%瓊脂)上于37°C下生長3天到1周以使孢子形成。利用玻璃分散器使這些孢子懸于無菌水中。將亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍，SIGMA CHEMICAL CO.制造)加入該孢子懸液至終濃度為200 μ g/ml。將得到的混合物在室溫下處理5到20min以使死亡率達到90%。將適量的該混合物涂布在麥芽平板上，并將所得平板置于37°C。第二天，將得到的每一簇微小的真菌菌絲接種于8ml的YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)中，在37°C培養(yǎng)4天后的培養(yǎng)物上清被用作測量蛋白酶活性(PA)和凝乳活性(MCA) 的樣品。該細胞儲存于-80°C。(2)搜尋改進型蛋白酶作為根據(jù)上述方法測量MCA和PA的結(jié)果，得到了一種改進型蛋白酶，該蛋白酶的 PA遠小于親本株的PA，并且，與親本株相比，所得蛋白酶的C/P比(MCA/PA)明顯提高了 4. 6倍。實施例2從所述突變株中分離蛋白酶基因(1)突變株和親本株的染色體DNA的獲得親本株及實施例1中得到的突變株在麥芽平板上生長，并在37°C下放置3天到1 周以使孢子形成。這些孢子利用玻璃分散器懸于無菌水中。將該孢子懸液接種于500ml Mkaguchi燒瓶中的200ml YPD液體培養(yǎng)基中，以使每個燒瓶中含有大約1 X IO8個孢子，并在37°C下培養(yǎng)兩天。當(dāng)這些細胞形成尺寸為約0. 5到2mm的小球時，過濾所述培養(yǎng)基以移除多余的水分，由此得到濕重約為5g的細胞。液氮冷凍后，將這些細胞轉(zhuǎn)移入預(yù)冷的研缽中并加入3g海砂(850到1400 μ m)。 在液氮冷卻下，將該混合物用研杵細細研磨成粉末。將該粉末懸于15ml含0. 05M EDTA(pH 8. 5)和0. 2% SDS的溶液(將該溶液預(yù)熱至68 °C )中，所得物在68°C保溫15min。然后，將所得物靜置并冷卻至室溫，并通過離心收集混濁的上清。在向所收集的溶液中加入1/10體積的3M乙酸鈉后，輕柔攪拌該混合物并通過離心收集上清。接下來，當(dāng)向收集的上清中加入15ml異丙醇并輕輕攪拌后，基因組DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)塊出現(xiàn)。在用70%乙醇漂洗生成的沉淀物后，將所得物減壓干燥，溶于400 μ 1的TE和10 μ 1的RNase溶液(10mg/ml)中。將所得混合物置于37°C下lh。在RNase處理結(jié)束后，進行酚/氯仿處理和氯仿處理，隨后為乙醇沉淀，從而得到基因組DNA。(2)從突變株和親本株的染色體DNA中分離蛋白酶基因以親本株和來自上面所得的突變株的染色體DNA為模板，通過PCR分離所述蛋白酶基因?；谠诨驍?shù)據(jù)庫(日本DNA數(shù)據(jù)庫(DBBJ)登錄號E0U64)中注冊的米黑根毛霉的蛋白酶的序列，制備如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的引物。PCR條件為
(a)940C 2min ； (b)94°C 30s_55°C 30s_72°C 3min，進行 28 個這樣的循環(huán)；和(c)72°C 5min。 TaKaRa Ex Taq (Takara Bio Inc.制造)被用作聚合酶。TaKaRa PCRThermal Cycler Dice Gradient (Takara Bio Inc.制造)被用作熱循環(huán)儀。測定PCR所得的DNA片段的核苷酸序列的結(jié)果顯示，以親本株的染色體DNA為模板擴增的DNA所編碼的氨基酸序列包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列。以突變株的染色體DNA為模板擴增的DNA所編碼的氨基酸序列包含 SEQ ID NO :4的氨基酸序列(19位的氨基酸被纈氨酸替換，266位的氨基酸被谷氨酸替換)。下文中，來自米黑根毛霉的親本株的蛋白酶被稱為野生型RMMP，所述改進型蛋白酶被稱作“改進的RMMP”，編碼所述改進型蛋白酶的基因被稱為“改進的RMMP基因”。實施例3以出芽酵母(釀酒酵母)MC16作為宿主來表達外源蛋白的質(zhì)粒載體JS4 的構(gòu)建。JS5(記載于日本專利No. 3012377
中)被用作構(gòu)建所述質(zhì)粒載體JS4的原材料。首先，以JS5作為模板，利用SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8的引物DNA進行PCR， 從而得到0. 55kbp的、含有GAL7啟動子區(qū)域的PCR產(chǎn)物。PCR條件為(a) 94 V 2min ；
(b)98 "C 10s-52 "C 30s_72 "C lmin,進行 30 個這樣的循環(huán)；和(c) 72 "C 5min。TaKafci Ex Taq(Takara Bio Inc.制造)被用作聚合酶。TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient (Takara Bio Inc.制造)被用作熱循環(huán)儀。接下來，利用限制性酶EcoR I和BamH I消化得到的PCR產(chǎn)物，并插入也用EcoR I和BamH I消化過的pUC18中。將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入E. coliDH5 α，并將細胞涂布于含有 100 μ g/ml氨芐青霉素、O. ImM IPTG和0. 04mg/ml X-GAL的LB瓊脂平板上，并在37°C下培養(yǎng)16h。在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下振蕩培養(yǎng)出現(xiàn)的白色菌落14到16h。從離心收集的轉(zhuǎn)化體中，利用QIAprep Miniprep試劑盒(QIAGEN，下文中所有的質(zhì)粒提取均采用該試劑盒進行)提取質(zhì)粒。對于插入片段，進行測序以確認未引入不想要的突變。隨后，利用EcoR I和BamH I消化包含插入片段的質(zhì)粒，得到0. 551Λρ的DNA片段，然后將該DNA片段與利用BamH I消化后再利用EcoR I部分消化JS5后得到的約61Λρ 的DNA片段連接。將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入Ε. coli DH5 α，在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上于37°C下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的E. coli 16h。將出現(xiàn)的菌落在相同的液體培養(yǎng)基中于 37°C下振蕩培養(yǎng)14到16h，然后從離心收集的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒。利用限制性酶EcoR I、 BamH I和I^st I消化該質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳分析確認遷移類型。用這種方法，制備出表達載體JS4。作為構(gòu)建這種質(zhì)粒載體的原材料，除了 JS5，也可使用例如日本專利No. 3012377 的0112段中記載的JS52(登錄號FERM BP-3898)。實施例4表達野生型RMMP基因和改進的RMMP基因的質(zhì)粒載體的構(gòu)建利用引物(SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10)進行PCR，設(shè)計所述引物使得含有編碼野生型RMMP的DNA或含有具有Glul9Val/Gln266Glu的突變的改進的RMMP的DNA的核苷酸序列(在實施例2中得到)的兩個末端具有BamH I位點。用BamH I消化得到的PCR產(chǎn)物，插入到類似地用BamH I消化并去磷酸化的JS4中，并將所得載體導(dǎo)入E. coli DH5 α。利用可退火至GAL7啟動子的正向引物和可退火至RMMP基因3'末端的反向引物 (SEQ ID Ν0:11和SEQ ID NO 10)進行菌落PCR。將含有所述質(zhì)粒載體(確認基因插入方向正確)的Ε. coli轉(zhuǎn)化體接種至上述液體培養(yǎng)基中。提取該質(zhì)粒并測序以確認未引入不想要的錯誤，由此得到了用于表達野生型RMMP基因和改進的RMMP基因的質(zhì)粒載體。實施例5引入定點突變的改進的RMMP基因的表達載體的構(gòu)建(I) 用BamH I消化按實施例4所述的方法得到的野生型RMMP基因的PCR產(chǎn)物(含有前原序列(PMPr0 sequence)且各末端含有BamH I位點)，插入到類似地用BamH I消化并去磷酸化的PUC18中。將所得的質(zhì)粒導(dǎo)入E. coli DH5 α，然后從所得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒并確認其核苷酸序列，從而得到了 pRMMP-wt。接下來，通過利用pRMMP-wt作為模板，利用引物對SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 13、引物對SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:15、引物對SEQ ID N0:16和SEQ ID NO :17、引物對 SEQ ID NO :18 禾口 SEQID N0:19、引物對 SEQ ID N0:20 禾口 SEQ ID NO :21、引物對 SEQ ID NO: 22和 SEQ ID NO :23或引物對SEQ ID N0:24禾口 SEQ ID NO 25 以及PrimeSTAR Mutagenesis Basal試劑盒(Takara Bio Inc.，下文中簡稱為“試劑盒”)進行PCR引入突變，使得SEQ ID NO 3中19位的谷氨酸或者266位的谷氨酰胺中的一個殘基被另外的氨基酸替換。參考該試劑盒所附的手冊來完成引入突變的引物的設(shè)計及PCR。所述突變實驗與該手冊一致。將得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli DH5 α，并將細胞涂布于含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，并在37°C下培養(yǎng)16h，從而得到轉(zhuǎn)化體。從這些轉(zhuǎn)化體中，采用與上述相同的方法提取質(zhì)粒并進行測序，以確認未引入不想要的突變。通過這些操作，制備出編碼具有Glul9Val、Glul9Ala、Glul9Ile、Glul9Leu、 Glul9Phe、Gln266Glu或Glr^66Asp突變的改進的RMMP的基因。含有上述改進的RMMP 基因的這些質(zhì)粒載體分別被稱為pRMMP-E19V、pRMMP_E19A、pRMMP_E19I、pRMMP_E19L、 PRMMP-E19F、pRMMP-Q266E 和 pRMMP_Q266D。此外，利用pRMMP-G^66E或pRMMP_Q266D作為模板，利用引物對SEQ ID NO 12和 SEQ ID N0:13、引物對 SEQ ID N0:14 禾口 SEQ ID N0:15、引物對 SEQ ID N0:16 禾口 SEQ ID NO :17或引物對SEQ ID N0:18和SEQ ID NO 19以及上述的試劑盒進行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli DH5ci，然后采用與上述相同的方法從得到的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒并測序， 由此制備出編碼具有 Glul9Val/Glr^66Asp、Glu 19Ala/Gln266Glu,Glu 19Ala/Gln266Asp, Glul9Ile/Gln266Glu, Glul9Ile/Gln266Asp 或 Glul9Leu/Glr^66Glu 突變的改進的 RMMP 的基因。含有上述改進的RMMP基因的這些質(zhì)粒載體分別被稱為pRMMP-E19VG^66D、 PRMMP-E19AQ266E、pRMMP_E19AQ266D、pRMMP_E19IQ266E、pRMMP_E19IQ266D 禾口 PRMMP-E19LQ266E。用BamH I消化由此得到的質(zhì)粒載體，通過上述方法將所得到的片段插入JS4中， 從而得到上述各改進的RMMP基因的表達載體。實施例6引入定點突變的改進的RMMP基因的表達載體的構(gòu)建(II)此夕卜，利用pRMMP-wt作為模板，利用引物對SEQ ID NO丨6和SEQ ID N0:27、引物對 SEQ ID NO: 28 禾口 SEQ ID NO 29、引物對 SEQID NO 30 禾口 SEQ ID N0:31、引物對 SEQ ID NO 32 和 SEQ ID NO 33、引物對 SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO 35 或引物對 SEQ ID NO 36 和SEQ ID N0:37以及上述的試劑盒進行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli DH5a，然后采用與上述相同的方法從得到的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒并測序，由此得到編碼具有Gln265Glu、 Gln265Asp、Gln265Glu/Gln266Glu、Gln265Glu/Gln266Asp、Gln265Asp/Gln266Glu 或 Gln265Asp/Gln266Asp的突變的改進的RMMP的基因。含有上述改進的RMMP基因的這些質(zhì)粒載體分別被稱為pRMMP_Q265E、pRMMP_Q265D、pRMMP-Q265EQ266E, pRMMP-Q265EQ266D, PRMMP-Q265DQ266E 和 pRMMP_Q265DQ266D。通過利用BamH I消化由此得到的質(zhì)粒載體而得到所述改進的RMMP基因，按上述方法插入JS4中，從而得到上述的改進的RMMP基因的表達載體。實施例7引入定點突變的改進的RMMP基因的表達載體的構(gòu)建(III)利用pRMMP-E19V、pRMMP_E19A 或 pRMMP_E19I 作為模板，利用引物對 SEQ ID NO 30 禾口 SEQ ID N0:31、引物對 SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID N0:33、引物對 SEQ ID N0:34 禾口 SEQ ID NO 35或引物對SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 37以及上述的試劑盒進行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli DH5 a，然后采用與上述相同的方法從每一個得到的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒并測序，從而得到編碼具有 Glul9Val/Gln265Glu/Glr^66Glu、Glul9Val/Gln265Glu/ Gln266Asp、 Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Glu、 Glul9Val/Gln265Asp/Gln266Asp、 Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Glu、Glul9Ala/Gln265Glu/Gln266Asp、Glul9Ala/Gln265Asp/ Gln266Glu、Glul9Ala/Gln265Asp/Gln266Asp、Glul9Ile/Gln265Glu/Gln266Glu、Glul9Ile/ Gln265Glu/Gln266Asp、 Glul9Ile/Gln265Asp/Gln266Glu 或 Glul9Ile/Gln265Asp/ Gln266Asp突變的改進的RMMP的基因。含有上述改進的RMMP基因的這些質(zhì)粒載體分別被稱為pRMMP_E19VQ265EQ266E、pRMMP_E19VQ265EQ266D、pRMMP_E19VQ265DQ266E、 PRMMP-E19VQ265DQ266D、pRMMP-E19AQ265EQ266E、pRMMP-E19AQ26 5EQ266D、 PRMMP-E19AQ265DQ266E、 pRMMP-E19AQ265DQ266D、 pRMMP-E19IQ265EQ266E、 PRMMP-E19IQ265EQ266D、pRMMP-E19IQ265DQ266E 和 pRMMP_E19IQ265DQ266D。通過利用BamH I消化由此得到的質(zhì)粒載體而得到所述改進的RMMP基因，按上述方法插入JS4中，從而得到上述的改進的RMMP基因的表達載體。實施例8利用含有野生型或改進的RMMP基因的表達載體對芽酵母MC16的轉(zhuǎn)化通過Gietz和khiestl的方法(19卯)將如上述生產(chǎn)的表達載體導(dǎo)入出芽酵母MC16 (ΜΑΤ α、leu2、his4、ade2)中，并將細胞涂布于SDah平板上，在30°C下培養(yǎng)3天，從而得到轉(zhuǎn)化體。實施例9野生型和改進的RMMP的分泌表達在IOOml的YPD液體培養(yǎng)基(在500ml帶擋板的錐形瓶中預(yù)先制備)中，將根據(jù)上述方法得到的轉(zhuǎn)化體以200rpm的轉(zhuǎn)速于30°C下振蕩培養(yǎng)Mh。在兩倍量的YPGal液體培養(yǎng)基中重懸通過離心收集的酵母細胞，然后轉(zhuǎn)移至無菌的帶擋板的錐形瓶中，并進一步以相同的方式振蕩培養(yǎng)72到96h以進行分泌表達。培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)基，從而得到含有上述RMMP的培養(yǎng)物上清。實施例10MCA和PA的測定及C/P比的評價對于含有RMMP的培養(yǎng)物上清，測定MCA和PA以計算所述C/P比。結(jié)果見表1。表 權(quán)利要求
1.一種改進型蛋白酶，所述改進型蛋白酶含有與SEQ ID NO: 3具有至少75% —致性的氨基酸序列，所述改進型蛋白酶具有至少一種突變，所述突變選自由下述突變組成的組(A)利用酸性氨基酸替換對應(yīng)于SEQID NO 3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺；和(B)利用酸性氨基酸替換SEQID NO :3中266位的谷氨酰胺； 其中，所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。
2.如權(quán)利要求1所述的改進型蛋白酶，所述改進型蛋白酶選自由下述蛋白組成的組(A)包含SEQID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換；(B)包含SEQID NO :3或SEQ ID NO :43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替換，以及除265位和266位的氨基酸以外，還有不多于10個氨基酸被取代、缺失、插入或添加；其中，所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的改進型蛋白酶，其中，所述酸性氨基酸為谷氨酸或天冬氨酸。
4.如權(quán)利要求1到3任一項所述的改進型蛋白酶，其中，19位的谷氨酸被纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸替換。
5.如權(quán)利要求1到4任一項所述的改進型蛋白酶，其中，81位的蘇氨酸被谷氨酰胺或天冬氨酸替換。
6.編碼如權(quán)利要求1到5任一項所述的改進型蛋白酶的DNA。
7.包含如權(quán)利要求6所述的DNA的表達載體。
8.導(dǎo)入權(quán)利要求7所述的表達載體的轉(zhuǎn)化細胞。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化細胞，所述轉(zhuǎn)化細胞為釀酒酵母。
10.一種生產(chǎn)具有凝乳活性的改進型蛋白酶的方法，所述方法包括如下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求8或9所述的轉(zhuǎn)化細胞；以及收集所述培養(yǎng)基中的所述改進型蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了改進型蛋白酶，所述改進型蛋白酶含有與SEQ ID NO3具有至少75％一致性的氨基酸序列，所述改進型蛋白酶具有至少一種突變，所述突變選自由下述突變組成的組(A)利用酸性氨基酸替換對應(yīng)于SEQ ID NO3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺；和(B)利用酸性氨基酸替換SEQ ID NO3中266位的谷氨酰胺；其中，所述改進型蛋白酶具有凝乳活性。
文檔編號C12N9/58GK102361975SQ20108001342
公開日2012年2月22日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者加藤重昭, 原田和德, 小林弘幸, 山口大志, 角田昭, 須賀太郎 申請人:名糖產(chǎn)業(yè)株式會社