專利名稱：新型2-脫氧青蟹肌糖合成酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐熱性2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因、重組載體、轉(zhuǎn)化體以及2-脫氧青蟹肌糖的制造方法。
背景技術(shù)：
目前，許多鄰苯二酚等芳香族化合物是以石油為原料而進(jìn)行生產(chǎn)的，但從石油資源枯竭的問題、削減二氧化碳排放量等方面出發(fā)，要求開發(fā)出利用生物物質(zhì)的環(huán)境協(xié)調(diào)型的新型制造工藝。另一方面，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)2-脫氧青蟹肌糖(以下稱為D0I)能夠轉(zhuǎn)換為工業(yè)上有用的芳香族化合物(鄰苯二酚等)(非專利文獻(xiàn)1)，此外，有文獻(xiàn)報(bào)道能夠由作為生物物質(zhì)的構(gòu)成要素之一的葡萄糖來合成該DOI (非專利文獻(xiàn)1)。在該DOI制造工藝中重要的是由葡萄糖-6-磷酸向DOI轉(zhuǎn)換的2-脫氧青蟹肌糖合成酶(以下稱為DOI合成酶)，DOI不僅能夠轉(zhuǎn)換為上述芳香族化合物，還能夠成為各種有用化合物的中間體，因而DOI合成酶備受矚目。DOI合成酶是于1997年由屬于丁酰苷菌素生產(chǎn)菌環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus circulans)的微生物分離純化的(非專利文獻(xiàn)2)，隨后其基因序列也被公開(專利文獻(xiàn)1)。除此之外，迄今為止還發(fā)現(xiàn)了來自印度斯坦鏈異壁菌(Str印toalloteichus hindustanus) JCM3268株(非專利文獻(xiàn)幻的DOI合成酶等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開2000-236881號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 tetrahedron Letters 41，1935-1938，2000非專利文獻(xiàn)2:The Journal of Antibiotics 50 (5)，424-428，1997非專利文獻(xiàn)3:The Journal of Antibiotics 59 (6)，358-361，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題但是，上述DOI合成酶的穩(wěn)定性和比活性等各種特性并不令人滿意，而且基本上沒有進(jìn)行與適合于數(shù)千噸規(guī)模的工業(yè)化制法的酶的分析和功能提高有關(guān)的研究。例如，來自屬于環(huán)狀芽胞桿菌的微生物的DOI合成酶(BtrC)在穩(wěn)定性等方面存在很大的問題，來自印度斯坦鏈異壁菌JCM3268株的DOI合成酶的比活性明顯較低，工業(yè)上難以利用。本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種對于熱和PH的穩(wěn)定性等特性比現(xiàn)有的酶更優(yōu)異的DOI合成酶，以及提供一種使用了該酶的DOI制造方法。用于解決課題的方案為了解決這些課題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種與現(xiàn)有的酶相比熱和/或PH穩(wěn)定性得到了提高的DOI合成酶，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及以下所示的DOI合成酶、DOI合成酶基因、重組載體、轉(zhuǎn)化體以及 DOI制造方法。[1] 一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性， 且具有下述⑶和/或(5)的特性(1)作用本酶具有將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為2-脫氧青蟹肌糖的功能；(2)最適 pH 范圍7. 0 7. 7;(3)穩(wěn)定 pH 范圍6. 0 8.0 ；(4)最適溫度范圍55 70°C ；(5)穩(wěn)定溫度范圍20 46°C ；(6)輔酶利用 NAD+ ；(7)分子量39000 42000。[2]如[1]所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(8)的特性(8)比活性1. 0μ mol/min/mg 以上(反應(yīng)溫度 65°C )。[3]如[1]或[2]所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(9)的特性(9)輔因子通過添加Co2+離子提高活性。[4]如[1] [3]的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，穩(wěn)定溫度范圍為 20 60 。[5] 一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述任一種氨基酸序列(a)序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列；(b)與序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列；或(c)在序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以
上的氨基酸的缺失、添加、和/或置換，且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列。[6] 一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有編碼下述任一種氨基酸序列的堿基序列(a)序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列；(b)與序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列具有80%以上的同源
性、且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列；或(c)在序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以
上的氨基酸的缺失、添加、和/或置換，且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列。[7] 一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有下述任一種堿基序列(a)序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列；(b)與序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列具有80%以上的同源性、 且編碼具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶的堿基序列；或(c)在序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的堿基的缺失、添加、和/或置換，且編碼具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶的堿基序列。[8] 一種重組載體，其含有[6]或[7]所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因。[9] 一種轉(zhuǎn)化體，其是通過將[6]或[7]所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因或[8] 所述的重組載體導(dǎo)入宿主中而得到的。[10] 一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其是通過培養(yǎng)[9]所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。[11] 一種2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，該方法中使用[1] [5]或 [10]的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶。[12] 一種2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，該方法將葡萄糖、以葡萄糖為構(gòu)成成分的多糖類和/或葡萄糖-6-磷酸作為原料來制造2-脫氧青蟹肌糖，其特征在于，該方法中利用[6]或[7]所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因、或者[9]所述的轉(zhuǎn)化體。[13] 一種由葡萄糖-6-磷酸制造2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，在含有鈷離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠表達(dá)2-脫氧青蟹肌糖合成酶的微生物。[14]如[13]所述的方法，其特征在于，該方法中使用含有以葡萄糖為構(gòu)成成分的多糖類或者葡萄糖的原料。[15]如[13]或[14]所述的方法，其中，2_脫氧青蟹肌糖合成酶為[1] [5]的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶。發(fā)明的效果若使用本發(fā)明的DOI合成酶，則在DOI的制造中能夠在高溫條件下利用酶。此外， 在某些制造條件下，制造時(shí)不需要嚴(yán)格的溫度管理等。另外，能夠在DOI穩(wěn)定的pH范圍即酸性條件下制造D0I。此外，在某些制造條件下，制造時(shí)不需要嚴(yán)格的pH管理等。


圖1示出純化DOI合成酶(D0IS-1)的最適pH范圍(實(shí)施例3)。圖2示出純化DOI合成酶(D0IS-1)的穩(wěn)定pH范圍(實(shí)施例3)。圖3示出純化DOI合成酶(D0IS-1)的最適溫度范圍(實(shí)施例3)。圖4示出純化DOI合成酶(D0IS-1)的穩(wěn)定溫度范圍(實(shí)施例3)。圖5示出純化DOI合成酶(D0IS-1)的穩(wěn)定溫度范圍(實(shí)施例3)。圖6示出純化已知DOI合成酶(BtrC)的穩(wěn)定溫度范圍(比較例1)。圖7示出純化已知DOI合成酶(BtrC)的穩(wěn)定pH范圍(比較例1)。
具體實(shí)施例方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。[D0I 合成酶]本發(fā)明的具體實(shí)施方式
(以下稱為本實(shí)施方式)的DOI合成酶具有下述特性(1)作用本酶具有將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為DOI的功能。(2)穩(wěn)定性顯示出高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鷓H穩(wěn)定性。優(yōu)選的是，本發(fā)明中的DOI合成酶具有下述⑴、(2)、⑷、(6)和(7)的特性，且具有下述⑶和/或(5)的特性。(1)作用本酶具有將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為2-脫氧青蟹肌糖的功能。
(2)最適 pH 范圍7.0 7. 7(3)穩(wěn)定 pH 范圍6. 0 8.0(4)最適溫度范圍55 70°C(5)穩(wěn)定溫度范圍20 46°C (優(yōu)選為2O 60°C )(6)輔酶利用 NAD+(7)分子量:39000 42000進(jìn)一步優(yōu)選本發(fā)明中的DOI合成酶除了具有上述特性之外，還具有下述(8)和/ 或(9)的特性。(8)比活性1. 0μ mol/min/mg 以上(反應(yīng)溫度 65°C )(9)輔因子通過添加Co2+離子提高活性本發(fā)明的DOI合成酶的氨基酸序列的具體例示于序列號2、4、6、8、10以及12。具有序列號2、4、6、8、10或12記載的氨基酸序列的DOI合成酶優(yōu)選具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的特性。具有序列號2、4、6、8、10或12記載的氨基酸序列的DOI合成酶優(yōu)選在本實(shí)施方式中具有優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的特性。本實(shí)施方式中，DOI合成酶可以是與選自由序列號2、4、6、8、10或12記載的氨基酸序列組成的組中的至少一種氨基酸序列具有優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上、 進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為99%以上的同源性的蛋白質(zhì)。另外，本實(shí)施方式中，DOI合成酶可以在選自由序列號2、4、6、8、10或12記載的氨基酸序列組成的組中的至少一種氨基酸序列中含有1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的缺失、置換和/或添加。缺失、置換和/或添加的氨基酸的個(gè)數(shù)優(yōu)選為1 50個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 30個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 20個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 10個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 5個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 3個(gè)。含有與選自由序列號2、4、6、8、10、12記載的氨基酸序列組成的組中的至少一種氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列；具有優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鷓H 穩(wěn)定性的特性；且具有DOI合成酶活性的酶包含在本發(fā)明中。含有在選自由序列號2、4、6、8、10、12記載的氨基酸序列組成的組中的至少一種氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的缺失、置換和/或添加的氨基酸序列；具有優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的特性；且具有DOI合成酶活性的酶包含在本發(fā)明中。作為使DOI合成酶中的氨基酸產(chǎn)生缺失、置換、添加等變異的方法，可以利用PCR 法、易錯(cuò)PCR法、DNA改組法或制作嵌合酶的方法等公知的方法。關(guān)于DOI合成酶中的氨基酸序列的同源性，例如，可以使用UWGCG Package提供的 BESTFIT 程序(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12，p387_395)、PILEUP 和 BLAST 算法(Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36 :290-300 ；Altschul S. F. (1990) J Mol Biol 215 :403-10)等序列分析用工具計(jì)算。另外，通過在熱處理后對由上述方法得到的DOI合成酶進(jìn)行活性測定，能夠選擇出保持高溫穩(wěn)定性的酶。[D0I合成酶基因]
本實(shí)施方式的DOI合成酶基因可以是由宏基因組或微生物分離、提取的天然的基因，另外，也可以是根據(jù)其堿基序列利用PCR法、人工合成法等公知的方法合成的基因。 另外，制作新型DOI酶嵌合基因時(shí)，可以組合已知DOI合成酶基因，例如，可以舉出來自類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)NBRC13157 株、印度斯坦鏈異壁菌(Sti^ptoalloteichus hindustanus) JCM3^8、弗氏鏈霉菌(Sti^ptomyces fradiae) NBRC12773 株等的 DOI 合成酶基因。本實(shí)施方式中的DOI合成酶基因的堿基序列的具體例示于序列號1、3、5、7、9或 11。由含有DOI合成酶基因(該DOI合成酶基因具有選自由序列號1、3、5、7、9或11 記載的堿基序列組成的組中的至少一種基因序列)的重組載體和宿主得到轉(zhuǎn)化體，對所得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，可以得到DOI合成酶。由具有序列號1、3、5、7、9或11記載的堿基序列的DOI合成酶基因得到的DOI合成酶優(yōu)選具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的特性。本實(shí)施方式中，DOI合成酶基因可以含有以下堿基序列，該堿基序列與具有序列號 1、3、5、7、9或11記載的堿基序列的DOI合成酶基因具有優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為 85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為99%以上的同源性。含有與選自由序列號1、3、5、7、9或11記載的堿基序列組成的組中的至少一種堿基序列具有80%以上的同源性的堿基序列；編碼具有優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鷓H穩(wěn)定性的特性、且具有DOI合成酶活性的酶的DOI合成酶基因包含在本發(fā)明中。本實(shí)施方式中，DOI合成酶基因可以在序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的堿基的缺失、添加、和/或置換。具有以下堿基序列的DOI 合成酶基因包含在本發(fā)明中，該堿基序列在序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的堿基的缺失、添加、和/或置換，且編碼具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的DOI合成酶。缺失、添加和/或置換的堿基的個(gè)數(shù)優(yōu)選為1 50個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 30個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 20個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 10個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 5個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 3個(gè)。本實(shí)施方式中，可以使用具有編碼下述(a)、(b)或(C)的任一種氨基酸序列的堿基序列的DOI合成酶基因。(a)序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列；(b)與序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列具有80%以上的同源
性、且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列；或(c)在序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以
上的氨基酸的缺失、添加、和/或置換，且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列。[重組載體和轉(zhuǎn)化體]本實(shí)施方式的重組載體可以通過在質(zhì)粒等公知的載體中連接(插入)本實(shí)施方式的基因而獲得。上述載體只要能夠在宿主中復(fù)制則沒有特別限定，可以舉出例如質(zhì)粒DNA、 噬菌體DNA等。作為上述質(zhì)粒DNA，可以舉出來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC119、pTrcHis、pBlueBacHis等)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5等)、來自酵母的質(zhì)粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50、pYE52等)等，作為噬菌體DNA，可以舉出λ噬菌體寸。向上述載體中插入本實(shí)施方式的基因時(shí)可以采用以下方法首先，利用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⒓兓蟮腄NA切斷，在載體DNA的適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)或多克隆位點(diǎn)將其插入，連接到載體上。為了在宿主內(nèi)表達(dá)外來基因，需要在結(jié)構(gòu)基因前設(shè)置適當(dāng)?shù)膯幼?。上述啟動子沒有特別限定，可以使用已知在宿主內(nèi)發(fā)揮功能的任意的啟動子。需要說明的是，關(guān)于啟動子，在后述的轉(zhuǎn)化體中與宿主一起進(jìn)行詳細(xì)說明。另外，根據(jù)需要還可以設(shè)置增強(qiáng)子等順式作用元件、剪接信號、聚A附加信號、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、終止子序列等。將本實(shí)施方式的重組載體導(dǎo)入宿主中，以能夠表達(dá)目標(biāo)基因，從而能夠得到本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體。在此作為宿主，只要能夠表達(dá)本實(shí)施方式的DNA，則沒有特別限定，例如，可以舉出屬于大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬、枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)等芽胞桿菌屬、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等假單胞菌屬、苜蓿根瘤菌(Miizobium meliloti)等根瘤菌屬的細(xì)菌；以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母；其他COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等動物細(xì)胞；或者SH9、Sf21等昆蟲細(xì)胞。另外，用作本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體的宿主優(yōu)選具有由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等單糖類合成葡萄糖-6-磷酸的功能。另外，根據(jù)需要，還優(yōu)選具有分解兩種以上單糖連接而成的多糖類的功能。將大腸桿菌等細(xì)菌作為宿主時(shí)，從有效表達(dá)DOI合成酶的方面考慮，本實(shí)施方式的重組載體優(yōu)選能夠在各細(xì)菌中自主復(fù)制，同時(shí)優(yōu)選由啟動子、核糖體結(jié)合序列、本實(shí)施方式的基因、轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成。另外，還可以含有調(diào)節(jié)啟動子的基因。作為大腸桿菌，可以舉出大腸桿菌(E. coli)K12, DHU DHlOB (Invitrogen 公司)、BL21_CodonPlus (DE3)-RIL (S tratagene公司)、T0P10F等，作為枯草桿菌，可以舉出枯草芽胞桿菌(B. subtilis)MI114、 207-21 等。作為啟動子，只要能夠在大腸桿菌等宿主中發(fā)揮功能，則沒有特別限定，可以使用例如gapA啟動子、gadA啟動子、trp啟動子、Iac啟動子、PL啟動子、I3R啟動子等來自大腸桿菌的啟動子；T7啟動子等來自噬菌體的啟動子。對向細(xì)菌導(dǎo)入重組載體的方法沒有特別限定，只要是能夠向細(xì)菌中導(dǎo)入DNA的方法即可，可以舉出例如使用鈣離子的方法(Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69 2110(1972))、電穿孔法等。將酵母作為宿主時(shí)，使用例如釀酒酵母(S. cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)等。這種情況下，作為啟動子，可以舉出能夠在酵母中表達(dá)的啟動子，例如gall 啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白啟動子、MF α 1啟動子、ΡΗ05啟動子、AOX啟動子等。作為向酵母中導(dǎo)入重組載體的方法，可以舉出例如電穿孔法(Becker，D. Μ. et al. :Methods. Enzymol.，194 :180(1990))、原生質(zhì)球法(Hinnen，A. et al. =Proc Natl. Acad. ki. USA，75 :19 (1978))、乙酸鋰法(Itoh, H. J. Bacteriol. , 153 :163(1983))等。[D0I合成酶的生產(chǎn)]本實(shí)施方式的酶可以通過如下方式獲得在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體，由該培養(yǎng)物采集具有該酶活性的蛋白質(zhì)，從而獲得本實(shí)施方式的酶。培養(yǎng)本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體的方法根據(jù)宿主決定即可。例如，在以大腸桿菌、酵母等微生物為宿主的轉(zhuǎn)化體的情況下，只要是含有微生物可同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等；且能夠有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，則可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任一種。培養(yǎng)中可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。在以使用了誘導(dǎo)性物質(zhì)作為啟動子的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并對所得的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如，在以使用了 Iac啟動子的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并對所得到的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)等，在以使用了 trp啟動子的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并對所得到的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸(IAA)等。培養(yǎng)后，本實(shí)施方式的酶蛋白產(chǎn)生在菌體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的情況下，將細(xì)胞破碎。另一方面，本實(shí)施方式的蛋白質(zhì)分泌到菌體外或細(xì)胞外的情況下，直接使用培養(yǎng)液，或者通過離心分離等回收培養(yǎng)液。蛋白質(zhì)的分離-純化中可以單獨(dú)或者適當(dāng)組合使用例如硫酸銨沉淀、凝膠過濾、 離子交換色譜法、親和色譜法等。另外，活性表示將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為D0I?；钚灾档臏y定方法如下所示。本實(shí)施方式的DOI合成酶活性可以通過以下方法確認(rèn)向能夠作為底物的含有適當(dāng)?shù)钠咸烟?6-磷酸的反應(yīng)液中添加該酶，檢測所生成的D0I，從而進(jìn)行確認(rèn)。所生成的DOI 的確認(rèn)可以使用非專利文獻(xiàn)(Journal of Biotechnology 129，502-509 (2007))中記載的
方法等。作為測定DOI合成酶活性的方法，可以使用以下方法向含有IOOOmM葡萄糖-6-磷酸溶液20 μ L、IOOmM NAD+溶液50 μ L、IOOmM氯化鈷六水合物溶液50 μ L的ρΗ7. 0 的150mM Bis-Tris緩沖液900 μ L中混合適當(dāng)濃度的DOI合成酶液100 μ L,反應(yīng)約5 60
分鐘后，使酶失活，對DOI進(jìn)行定量。純化后的DOI合成酶的純化度的確認(rèn)和分子量的測定可以通過電泳、凝膠過濾色譜法等來進(jìn)行。另外，關(guān)于酶的最適溫度范圍或者最適PH范圍，可以改變反應(yīng)溫度或者反應(yīng)PH來測定酶活性。進(jìn)而，通過在將DOI合成酶暴露于各種ρΗ條件下或溫度條件下一定時(shí)間后再測定酶活性，能夠考察穩(wěn)定PH范圍和穩(wěn)定溫度范圍。例如，在各ρΗ條件下評價(jià)DOI 合成酶時(shí)，可以使用Bis-Tris緩沖液(ρΗ5· 5 8. 0)和Tris緩沖液(ρΗ7· 4 8. 0)。最適ρΗ范圍是指，在改變ρΗ而進(jìn)行測定時(shí)將顯示最高活性的活性值設(shè)為100的情況下活性值為70以上的ρΗ范圍。穩(wěn)定ρΗ范圍是指，在改變ρΗ而進(jìn)行測定時(shí)將顯示最高活性的活性值設(shè)為100的情況下活性值在70以上的ρΗ范圍。最適溫度范圍是指，在改變溫度而進(jìn)行測定時(shí)將顯示最高活性的活性值設(shè)為100 的情況下活性值為50以上的溫度范圍。穩(wěn)定溫度范圍是指，在改變溫度而進(jìn)行測定時(shí)將顯示最高活性的活性值設(shè)為100 的情況下活性值在50以上的溫度范圍。本實(shí)施方式中的DOI合成酶的高溫穩(wěn)定性是指，穩(wěn)定溫度范圍的上限為46°C，更優(yōu)選為50°C，進(jìn)一步優(yōu)選為60°C，進(jìn)一步優(yōu)選為70°C，進(jìn)一步優(yōu)選為80°C，進(jìn)一步優(yōu)選為90°C，特別優(yōu)選為95°C。下限沒有特別限定，在通常的操作下穩(wěn)定的溫度范圍的下限例如可以為20°C，優(yōu)選為10°C，優(yōu)選為5°C，進(jìn)一步優(yōu)選為1°C。作為本實(shí)施方式的具有高溫穩(wěn)定性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，例如，可以挑選在 50°C溫育1小時(shí)后的殘存酶活性為50以上的酶。殘存酶活性表示將顯示最高活性的活性值設(shè)為100時(shí)的相對活性。通常，在工業(yè)上的酶反應(yīng)中，需要調(diào)節(jié)在酶具有高活性的溫度范圍內(nèi)，因此溫度的調(diào)節(jié)是非常重要的因素。DOI合成中，以往從菌的活性的方面出發(fā)，需要將溫度調(diào)節(jié)至37°C以下的嚴(yán)格的溫度管理。若使用具有高溫穩(wěn)定性的DOI合成酶，則在高溫范圍內(nèi)也能夠保持高活性，因此能夠進(jìn)行DOI的制造而不需要進(jìn)行嚴(yán)格的溫度管理。本實(shí)施方式中的具有寬范圍pH穩(wěn)定性的DOI合成酶具有以下特性穩(wěn)定pH范圍優(yōu)選為PH6. 0 7. 0，更優(yōu)選為pH6. 0 7. 4，更優(yōu)選為pH6. 0 7. 7，更優(yōu)選為pH6. 0 8. 0，特別更優(yōu)選為ρΗ4· 0 9. 0。DOI合成中，以往從菌的高活性的方面出發(fā)，需要將pH調(diào)節(jié)為pH6. 0 7. 0的嚴(yán)格的pH管理。若使用具有寬范圍pH穩(wěn)定性的DOI合成酶，則在寬范圍的pH范圍內(nèi)也能夠保持高活性，因此能夠進(jìn)行DOI的制造而不需要進(jìn)行嚴(yán)格的pH管理。關(guān)于本實(shí)施方式的酶，只要其作用不受到抑制則不需要為高純度。因此，純化不是必須的，也可以含有其他酶等。[D0I 的生產(chǎn)]本實(shí)施方式的DOI可以通過以下發(fā)酵生產(chǎn)法獲得培養(yǎng)本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體，由所得到的培養(yǎng)物采集DOI。作為上述培養(yǎng)的營養(yǎng)源，可以使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、其他有機(jī)營養(yǎng)源的培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度只要為該菌能夠生長的溫度即可。培養(yǎng)時(shí)間沒有特別限定，可以為1天至7天左右。其后，由所得到的培養(yǎng)菌體或培養(yǎng)上清液回收DOI即可。作為用于培養(yǎng)的碳源，只要是轉(zhuǎn)化體能夠同化的碳源，則可以直接使用以葡萄糖為構(gòu)成成分的多糖類，更優(yōu)選舉出來自含有單糖類或者淀粉、米糠、廢糖蜜等多糖類的原料的單糖類，具體地說可以舉出D-葡萄糖等。另外，啟動子的表達(dá)為誘導(dǎo)型時(shí)，適時(shí)添加誘導(dǎo)物質(zhì)即可。作為碳源，可以使用D-葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖等糖類；油脂類；脂肪酸類以及正鏈烷烴等。作為油脂，例如，可以舉出菜籽油、椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油等。作為脂肪酸，可以舉出己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、十四酸等飽和 /不飽和脂肪酸、或者這些脂肪酸的酯或鹽等脂肪酸衍生物等。作為有機(jī)營養(yǎng)源，可以舉出氨基酸類，例如，腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、色氨酸等。作為氮源，例如，除了氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽之外，可以舉出蛋白胨、肉浸膏、酵母浸膏等。作為無機(jī)鹽類，例如，可以舉出磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸鎂、 氯化鈉等。本發(fā)明中，通過在含有鈷離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠表達(dá)DOI合成酶的微生物，能夠由葡萄糖-6-磷酸制造DOI。
本實(shí)施方式中的DOI生產(chǎn)法中，鈷離子優(yōu)選以二價(jià)鈷離子的鹽的形式使用。具體地說，可以舉出氯化鈷、硫酸鈷、乙酸鈷等。若向培養(yǎng)液中添加鈷離子，則DOI生產(chǎn)率高于不添加鈷離子的培養(yǎng)。在培養(yǎng)液中過量添加鈷離子時(shí)，可能會引起微生物的生長抑制。因此，培養(yǎng)中的鈷濃度以以下范圍為宜對于該酶具有活性而言是充分的，且不抑制微生物的生長。剛開始培養(yǎng)后的鈷濃度根據(jù)宿主而異，例如在使用大腸桿菌的情況下，剛開始培養(yǎng)后的鈷濃度以氯化鈷六水合物換算優(yōu)選維持在0. 1 200mg/L、更優(yōu)選0. 1 100mg/L、進(jìn)一步更優(yōu)選0. 1 50mg/L的范圍內(nèi)。剛開始培養(yǎng)后表示從主培養(yǎng)開始至菌液OD達(dá)到5的范圍。菌液OD是指培養(yǎng)液的光密度，本實(shí)施方式中，表示培養(yǎng)液對于600nm的光的吸收強(qiáng)度。應(yīng)用高密度培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)液中的菌體濃度的上升，作為微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、維生素等構(gòu)成成分的原料；且對于微生物的生長為必須的能量源的葡萄糖等碳源會變得不足。這種情況下，連續(xù)地或者間歇地向培養(yǎng)基中供給碳源。本實(shí)施方式中， 優(yōu)選進(jìn)一步添加鈷離子，連續(xù)地或者間歇地適量供給該酶的活性表達(dá)所必需的鈷離子。本實(shí)施方式的DOI生產(chǎn)法中，優(yōu)選將添加鈷值調(diào)節(jié)為0. 0003 70，更優(yōu)選為 0. 001 15，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 01 5。添加鈷值通過下式計(jì)算。添加鈷值=[培養(yǎng)液中氯化鈷六水合物的總添加量(mg)]/培養(yǎng)液量(L)/菌液OD使用除氯化鈷六水合物以外的鈷鹽時(shí)，可以通過氯化鈷六水合物換算計(jì)算出添加鈷值，并添加鈷鹽以使鈷離子的量為適當(dāng)?shù)闹?。作為由培養(yǎng)液回收DOI的方法，可以舉出以下方法。培養(yǎng)終止后，利用離心分離器或過濾裝置等從培養(yǎng)液中除去菌體，得到培養(yǎng)上清液。對該培養(yǎng)上清液進(jìn)一步進(jìn)行過濾處理，除去菌體等固體物質(zhì)，向其濾液中添加離子交換樹脂，用蒸餾水進(jìn)行洗脫。一邊測定ICP發(fā)射光譜、PH等，一邊分離不含雜質(zhì)的級分，除去該水溶液的溶劑，從而可以回收DOI。所得到的DOI的分析例如可以通過高效液相色譜法或核磁共振法等進(jìn)行。另外，作為上述發(fā)酵生產(chǎn)法以外的方法，可以舉出利用通過葡萄糖激酶等由葡萄糖轉(zhuǎn)換而得到的葡萄糖-6-磷酸的方法，可以通過本實(shí)施方式的DOI合成酶或者轉(zhuǎn)化體由葡萄糖-6-磷酸得到DOI。從反應(yīng)速度、酶的穩(wěn)定性的方面考慮，使用本實(shí)施方式的DOI合成酶和/或轉(zhuǎn)化體制造DOI時(shí)的反應(yīng)溫度優(yōu)選為10 95°C，更優(yōu)選為20 70°C，進(jìn)一步優(yōu)選為30 60°C。反應(yīng)pH可以在寬范圍調(diào)整，從酶的穩(wěn)定性的方面考慮，優(yōu)選為pH2.0 10.0，更優(yōu)選為pH4. 0 8. 0，進(jìn)一步優(yōu)選為6. 0 8. 0。反應(yīng)時(shí)間還根據(jù)酶的用量而異，考慮工業(yè)利用時(shí)，通常優(yōu)選為20分鐘 200小時(shí)， 更優(yōu)選為6 80小時(shí)。利用轉(zhuǎn)化體作為DOI合成催化劑時(shí)，可以事先進(jìn)行冷凍處理、各種
破碎處理。但是，本實(shí)施方式不限于以上的反應(yīng)條件和反應(yīng)形態(tài)，可以適當(dāng)選擇。以下，通過實(shí)施例進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。實(shí)施例[實(shí)施例1](1)染色體DNA的制備
根據(jù)常規(guī)方法制備類芽孢桿菌NBRC13157株的染色體DNA。將類芽孢桿菌NBRC13157株在NR瓊脂培養(yǎng)皿(1%細(xì)菌用胰化胨、0. 2%酵母浸膏、 Ehrlich松魚浸膏(工A >J 7 t力ν才工矢ζ )、1.5%細(xì)菌用瓊脂、？!17.0)中，于30°C
培養(yǎng)1天，形成菌落。將30mLNR培養(yǎng)基(1 %細(xì)菌用胰化胨、0. 2%酵母浸膏、1 % Ehrlich松魚浸膏、pH7. 0)分注到150mL錐形瓶中，向其中接種1接種環(huán)的該菌落，在30°C、ISOrpm的條件下培養(yǎng)1天。在4°C、12，OOOg的條件下將該培養(yǎng)液離心分離1分鐘，除去上清，回收菌體。將所得到的菌體懸浮于裂解緩沖液(50mM Tris-HCl (pH8. 0)、20mM EDTA、50mM葡萄糖)中，充分清洗。離心分離回收菌體后，重懸浮于裂解緩沖液中，向其中加入溶菌酶，在 37°C溫育45分鐘。接下來添加SDS和RNase，在37°C溫育45分鐘。其后添加蛋白酶K，在 50°C平穩(wěn)地振蕩60分鐘。利用苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷對此處得到的溶液進(jìn)行處理，然后進(jìn)行乙醇沉淀，使析出的核酸纏繞到玻璃移液管上，進(jìn)行回收。用70%乙醇清洗該核酸后，進(jìn)行干燥，再溶解于TE中。通過該操作，制備約10(^8的染色體0嫩。合成酶基因的分離作為用于由上述(1)中制備的染色體DNA擴(kuò)增DOI合成酶基因的PCR引物，正義引物合成具有序列號15的序列的寡聚DNA，反義引物合成具有序列號16的序列的寡聚DNA。使用此處得到的PCR引物，以上述(1)中制備的染色體DNA為模板，通過PCR法進(jìn)行DOI合成酶基因的擴(kuò)增，得到由1107個(gè)堿基對構(gòu)成的PCR產(chǎn)物。利用DNA測序儀對此處得到的PCR產(chǎn)物的基因序列進(jìn)行分析并確認(rèn)，得到具有序列號13的堿基序列的已知DOI合成酶(BtrC)基因。與該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列示于序列號 14 (BtrC)中。(3) DOI合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)筑和轉(zhuǎn)化對上述(2)中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑化、磷酸化，連接到在pUC19中連接有來自大腸桿菌的gapA啟動子、SD序列、終止子的質(zhì)粒中。該質(zhì)粒載體中導(dǎo)入了 gapA啟動子，該gapA啟動子能夠在大腸桿菌中有效地轉(zhuǎn)錄作為外來基因而連接的基因，因而即使在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物時(shí)，也能夠有效地表達(dá)、制造DOI合成酶基因。通過熱激法將此處得到的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到利用氯化鈣法制備的大腸桿菌JM109 株的感應(yīng)細(xì)胞中，制作重組微生物。(4)新型DOI合成酶基因的獲得對于上述(3)中得到的質(zhì)粒載體，利用常規(guī)方法進(jìn)行變異導(dǎo)入，從而可以得到具有序列號l(DOIS-l)、序列號3(D0IS-2)、序列號5(D0IS-3)、序列號7(D0IS-4)、序列號 9(D0IS-5)和序列號ll(D0IS-6)記載的堿基序列的耐熱性DOI合成酶基因。關(guān)于此處得到的DOI合成酶基因，也與(3)同樣地獲得轉(zhuǎn)化體。另外，將與序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9和序列號11的堿基序列對應(yīng)的氨基酸序列示于序列號2 (D0IS-1)、序列號 4 (D0IS-2)、序列號 6 (D0IS-3)、序列號 8 (D0IS-4)、序列號 10 (D0IS-5)和序列號 12 (D0IS-6) 中。新型DOI合成酶的挑選可以通過在對利用常規(guī)方法制作的各種DOI合成酶熱處理或者各種PH處理后進(jìn)行活性測定等來實(shí)施。[實(shí)施例2]
[純化酶的獲得]將實(shí)施例1中制作的DOI合成酶(D0IS-1)的轉(zhuǎn)化體在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中于37 °C培養(yǎng)一天，形成菌落。接下來，將30mL含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基加入容量為150mL的錐形瓶中，利用接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿接種菌落，在37°C以ISOrpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)3 8小時(shí)，直至 0D(600nm)達(dá)到0. 5左右，以此作為主培養(yǎng)的前培養(yǎng)液。向36個(gè)容量為500mL的錐形瓶中分別加入含有2g/L葡萄糖和100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基lOOmL，在各錐形瓶中添加0. 5mL前培養(yǎng)液，在37°C以ISOrpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 16小時(shí)。接下來，將該培養(yǎng)液在4°C以10，OOOg離心分離30分鐘，除去上清，用含有0. 2mg/ L氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)清洗多次，同時(shí)回收菌體?；厥蘸蟮木w在-80°C冷凍保存。將該冷凍保存菌體懸浮于含有0. ang/L氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)中，添加ISOmg溶菌酶(Sigma公司制造，來自蛋清)和60 μ L脫氧核糖核酸酶 I (WaKo公司制造，來自牛，重組體溶液)，在37°C以120rpm振蕩5小時(shí)，進(jìn)行菌體破碎。將菌體破碎后的溶液在4°C以10，OOOg離心分離30分鐘，除去菌體殘?jiān)?，回收上清。向該上清中加入硫酸銨，形成30%飽和，在4°C攪拌一段時(shí)間后，在4°C以10，OOOg 離心分離30分鐘，除去所生成的沉淀，回收上清。向該上清中進(jìn)一步加入硫酸銨，形成40. 0%飽和，在4°C攪拌一段時(shí)間后，對于所生成的沉淀，在4°C以10，OOOg離心分離30分鐘，除去上清，回收沉淀。接下來，將該沉淀溶解于含有0. 2mg/L氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)中。在4°C使用平均分級分子量為10，000的超濾膜濃縮該溶解液，加入含有0. 2mg/L 氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)，再次濃縮，重復(fù)該脫鹽操作2 3次。使上述得到的酶溶液吸附到用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)平衡化后的“DEAE Sepharose FF” (GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES 公司)上，然后通過含有 0 0. 4M 氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫后的酶的DOI合成酶的活性級分，使用平均分級分子量為10，000的超濾膜進(jìn)行濃縮，用含有10重量％硫酸銨的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)懸浮，使其吸附到用含有10重量％硫酸銨的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)平衡化后的“HiTrap Phenyl FF(high sub) ” (GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES 公司)上，然后通過含有 10 0 重量％硫酸銨的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫后的活性級分，使用平均分級分子量為10，000的超濾膜進(jìn)行濃縮， 使其吸附到用 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 7)平衡化后的“MonoQ 5/50GL”(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)上，然后通過含有0 0. 2M氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7· 7) 的濃度梯度法將酶洗脫出來。收集上述洗脫后的活性級分，使用平均分級分子量為10，000的超濾膜進(jìn)行濃縮， 填充到用含有0. 2mg/L氯化鈷六水合物和0. IM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)平衡化后的“HiLoad 16/60Superdex 200” (GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES 公司)中，然后利用同樣的緩沖液進(jìn)行洗脫。收集上述洗脫后的活性級分，使用平均分級分子量為10，000的超濾膜進(jìn)行濃縮， 得到純化DOI合成酶(D0IS-1)。與上述一系列的純化酶獲得實(shí)驗(yàn)同樣地獲得純化DOI合成酶(D0IS-2)、純化DOI 合成酶(D0IS-3)、純化DOI合成酶(D0IS-4)、純化DOI合成酶(D0IS-5)、純化DOI合成酶 (D0IS-6)和純化已知DOI合成酶(BtrC)。[實(shí)施例3][新型DOI合成酶的評價(jià)]使用實(shí)施例2中得到的純化DOI合成酶，進(jìn)行與其作用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。(1)最適pH范圍在各pH下的活性測定中，向反應(yīng)液中添加適量純化DOI合成酶(D0IS-1)，制備反應(yīng)液，使得葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co. , ltd.制造)為20mM、 NAD+(Oriental Yeast Co. , ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM、各種緩沖液為 IOOmM0作為緩沖液，使用Bis-Tris緩沖液(pH6. 0 7. 7)和Tris緩沖液(ρΗ7· 4 8. 0)。 反應(yīng)溫度設(shè)為30°C，對所生成的DOI進(jìn)行定量，從而測定活性。求出以顯示最高活性的活性值為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖1。本發(fā)明的酶的最適？!1范圍為？!17.0 7.7。(2)穩(wěn)定pH范圍使用pH5. 5 8. 0的范圍的IOOmM緩沖液，將純化DOI合成酶(D0IS-1)在各pH 下于30°C溫育60分鐘，測定其殘存酶活性。作為溫育中使用的緩沖液，使用Bis-Tris緩沖液(pH5. 5 8. 0)和 Tris 緩沖液(pH7. 4 8. 0)。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。求出以顯示最高活性的活性值為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖2。該酶的穩(wěn)定pH范圍為pH6.0 8.0，純化DOI 合成酶(D0IS-2)和純化DOI合成酶(D0IS-3)也顯示出同樣的結(jié)果。這些寬范圍pH穩(wěn)定性是現(xiàn)有酶所沒有的新特性。(3)最適溫度范圍在反應(yīng)溫度為10 70°C的各反應(yīng)溫度條件下，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽 (Oriental Yeast Co. ,ltd.制造)為 20mM、NAD+(Oriental Yeast Co. ,ltd.制造)為 5mM、 氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中實(shí)施純化DOI合成酶(D0IS-1) 的酶活性測定。求出以顯示最高活性的活性值為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖3。最適溫度范圍為陽 70°C，反應(yīng)溫度為65°C時(shí)的比活性為1. 8 Pmol(DOI)/min/mg (酶)，顯示出非常高的值。(4)穩(wěn)定溫度范圍對于添加了純化 DOI 合成酶(D0IS-1)、且制備成 NAD+(Oriental Yeast Co. ,ltd. 制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)，在溫度范圍為 25 60°C的各溫度下溫育1小時(shí)后，測定各殘存酶活性。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。求出以顯示最高活性的活性值為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖4。純化DOI合成酶(D0IS-1)的穩(wěn)定溫度范圍為 50°C以下，純化DOI合成酶(D0IS-2)和純化DOI合成酶(D0IS-3)也顯示出同樣的結(jié)果。這些高溫穩(wěn)定性是現(xiàn)有酶所沒有的新特性。另外，在不存在已知具有穩(wěn)定劑的作用的NAD+和鈷離子的條件下進(jìn)行溫育，實(shí)施穩(wěn)定溫度范圍試驗(yàn)，結(jié)果純化DOI合成酶(D0IS-1)在46°C溫育溫度下的相對活性為38，在 42°C溫育溫度下的相對活性為89，在37°C溫育溫度下的相對活性為100。(5)分子量通過使用了分離凝膠濃度為10 %的“Ready-Gel J”(日本Bio-Rad Laboratories, Inc.)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出分子量，結(jié)果純化DOI合成酶 (D0IS-1)的分子量為約40，000，與由氨基酸序列推測的分子量40，656基本一致。[實(shí)施例4][新型DOI合成酶的評價(jià)]使用實(shí)施例2中得到的純化DOI合成酶(D0IS-4)，進(jìn)行與其作用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。(溫度穩(wěn)定性的評價(jià))對于添加了純化DOI合成酶(D0IS-4)、且制備成氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)，在25°C和42°C的各溫度下溫育1小時(shí)后，測定各殘存酶活性。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。將在25°C溫育時(shí)的殘存活性設(shè)為100，則42°C溫育的活性值為74，顯示出非常高的值。(比活性的測定)另外，反應(yīng)溫度為60°C時(shí)的比活性為1. 2 μ mol (DOI)/min/mg (酶)，顯示出非常高的值。[實(shí)施例5][新型DOI合成酶的評價(jià)]使用實(shí)施例2中得到的純化DOI合成酶(D0IS-5)，進(jìn)行與其作用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。(pH穩(wěn)定性的評價(jià))使用pH5. 5 8. 0的范圍的IOOmM緩沖液，將純化DOI合成酶(D0IS-5)在各pH 于30°C溫育60分鐘，測定其殘存酶活性。作為溫育中使用的緩沖液，使用Bis-Tris緩沖液 (pH5. 5 8. 0)和 Tris 緩沖液(pH7. 4 8. 0)。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。求出以最大活性為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖5。如圖5所示，該酶在非常寬的pH區(qū)域中顯示出高穩(wěn)定性。該高穩(wěn)定性是現(xiàn)有酶所沒有的新特性。[實(shí)施例6][新型DOI合成酶的評價(jià)]使用實(shí)施例2中得到的純化DOI合成酶(D0IS-6)，進(jìn)行與其作用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
(pH穩(wěn)定性的評價(jià))使用pH5. 5 8. 0的范圍的IOOmM緩沖液，將純化DOI合成酶(D0IS-6)在各pH 于30°C溫育60分鐘，測定其殘存酶活性。作為溫育中使用的緩沖液，使用Bis-Tris緩沖液 (ρΗ5· 5 8. 0)。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-1Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。將顯示最大活性的pH8. 0 的殘存活性設(shè)為100時(shí)，在pH6. 5 8. 0的范圍內(nèi)活性值為70以上，pH6. 0的殘存活性為 53，顯示出非常高的值。該高pH穩(wěn)定性是現(xiàn)有酶所沒有的新特性。[實(shí)施例7]"D0I的生產(chǎn)方法”將實(shí)施例1中制作的DOI合成酶(D0IS-1)的轉(zhuǎn)化體在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中于37 °C培養(yǎng)一天，形成菌落。接下來，將30mL含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基加入容量為150mL的錐形瓶中，利用接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿接種菌落，在37°C以ISOrpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)3 8小時(shí)，直至 0D(600nm)達(dá)到0. 5左右，以此作為主培養(yǎng)的前培養(yǎng)液。向36個(gè)容量為500mL的錐形瓶中分別加入含有2g/L葡萄糖和100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基lOOmL，在各錐形瓶中添加0. 5mL前培養(yǎng)液，在37°C以ISOrpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 16小時(shí)。接下來，將該培養(yǎng)液在4°C以10，OOOg離心分離30分鐘，除去上清，用含有0. 2mg/ L氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)清洗多次，同時(shí)回收菌體。回收后的菌體在-80°C冷凍保存。DOI的合成中，作為DOI合成催化劑，使用將上述冷凍菌體懸浮在含有0. ^iig/L氯化鈷六水合物的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 7)中而得到的溶液。DOI合成反應(yīng)的反應(yīng)液組成為葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為 85mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為0. ImM、氯化鈷六水合物為ImM，菌體OD為30，開始DOI的合成反應(yīng)。反應(yīng)開始時(shí)的pH調(diào)整為7. 7，在46°C的反應(yīng)溫度進(jìn)行2. 5小時(shí)合成反應(yīng)，由此生成1 重量％的D0I。反應(yīng)終止后，添加鹽酸，使pH降低至6以下。接下來，將該反應(yīng)溶液在4°C 以10，OOOg離心分離30分鐘，回收上清，用過濾器過濾，除去菌體殘?jiān)?。對于上述合成的DOI 溶液，使用將 Amberlite IR120BNa (Organo Corporation 制造)再生為H+型的陽離子交換樹脂和將Amberlite IRA96SB (Organo Corporation制造) 再生為0!1_型的陰離子交換樹脂進(jìn)行純化處理。該純化處理中，合用柱處理和間歇處理，將未通過ICP發(fā)射光譜法檢測出P、Co、Na且含有DOI溶液的級分回收。接下來，在上述得到的DOI溶液中，相對于溶液中的Ig DOI添加0. 5g的活性炭 CARB0RAFFIN(Japan EnviroChemicals, Ltd.，制造)，在室溫下攪拌1小時(shí)，使微量雜質(zhì)吸附到活性炭上。1小時(shí)后，通過過濾操作除去活性炭，回收DOI溶液。通過將該DOI溶液減壓濃縮，濃縮DOI，通過冷凍干燥得到DOI的粉末。[實(shí)施例8]將實(shí)施例1中制作的DOI合成酶(D0IS-1)的轉(zhuǎn)化體在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中于37 °C培養(yǎng)一天，形成菌落。接下來，將30mL含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基加入容量為150mL的錐形瓶中，利用接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿接種菌落，在37°C以ISOrpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)3 8小時(shí)，直至 OD達(dá)到0. 5左右，以此作為主培養(yǎng)的前培養(yǎng)液。將IOOmL表1所示的含有不同濃度的氯化鈷六水合物的培養(yǎng)基A分別加入容量為 500mL的錐形瓶中，進(jìn)一步加入0. 5mL的前培養(yǎng)液，在37°C以180rpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。 培養(yǎng)18小時(shí)后各培養(yǎng)基條件下的菌液0D、添加鈷值和以未添加鈷離子的培養(yǎng)基的上清DOI 濃度為100時(shí)的相對值(D0I生產(chǎn)率)示于表2。[表1]表1培養(yǎng)基A
磷酸二氫鉀2g/L磷酸氫二銨3g/L硫酸鎂七水合物0. 2mg/L硫胺素鹽酸鹽20mg/L酵母浸膏3g/L葡萄糖10g/L氯化鈷六水合物0 20mg/L⑷用蒸餾水溶解，調(diào)整為pH7. 0。[表 2]
氯化鈷六水合物菌液添加鈷值相對值添加濃度(mg/L)OD(DOI生產(chǎn)率)04.20.001000.14.30.021140.54.40.1111814.30.2312434.20.7113154.31.1712574.01.77114104.32.30122204.64.37122比較例1[已知DOI合成酶的評價(jià)]關(guān)于具有序列號14記載的氨基酸序列的純化已知DOI合成酶(BtrC)，與實(shí)施例 3-(4)穩(wěn)定溫度范圍同樣地進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。對于添加了純化已知DOI合成酶(BtrC)、且制備成NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)，在溫度范圍為25 60°C的各溫度下溫育1小時(shí)后，測定各殘存酶活性。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。求出以最大活性為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖6。純化已知DOI合成酶(BtrC)的穩(wěn)定溫度范圍為42°C以下， 于46°C的相對活性為23，于50°C的相對活性為0，顯示出明顯低的熱穩(wěn)定性。另外，在不存在已知具有穩(wěn)定劑的作用的NAD+和鈷離子的條件下進(jìn)行溫育，實(shí)施穩(wěn)定溫度范圍試驗(yàn)，結(jié)果純化已知DOI合成酶(BtrC)在42°C和46°C溫育溫度下的相對活性為0，在37°C溫育溫度下的相對活性為14。本實(shí)驗(yàn)也表明，現(xiàn)有酶具有明顯低的熱穩(wěn)定性。關(guān)于具有序列號14記載的氨基酸序列的純化已知DOI合成酶(BtrC)，與實(shí)施例 3-(2)穩(wěn)定pH范圍同樣地進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將純化已知DOI合成酶(BtrC)在各pH下于30°C溫育60分鐘，測定其殘存酶活性。 作為溫育中使用的緩沖液，使用Bis-Tris緩沖液(ρΗ5· 5 7. 0)和Tris緩沖液(ρΗ7· 4 8. 0)。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。求出以最大活性為100時(shí)的相對活性，其結(jié)果示于圖5。如圖7所示，pH6時(shí)的相對活性為27，是非常低的值，在pH5. 5 的條件下幾乎完全失活。[比較例2][已知DOI合成酶的評價(jià)]關(guān)于具有序列號14記載的氨基酸序列的純化已知DOI合成酶(BtrC)，與實(shí)施例3 同樣地進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。對于添加了純化已知DOI合成酶(BtrC)、且制備成氯化鈷六水合物為5mM的IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)，在25°C和42°C的各溫度下溫育1小時(shí)后，測定各殘存酶活性。關(guān)于殘存酶活性的測定，在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental Yeast Co.，ltd. 制造)為20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的 IOOmM Bis-Tris緩沖液(pH7. 0)中，在30°C的反應(yīng)溫度下實(shí)施。將在25°C溫育時(shí)的殘存活性設(shè)為100，則42°C溫育的活性值為0，顯示出明顯低的熱穩(wěn)定性。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，能夠通過有效的制造工藝來生產(chǎn)D0I，所述DOI作為工業(yè)上有用的芳香族化合物(鄰苯二酚等)的前體的利用價(jià)值高。
權(quán)利要求
1.一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述(1)“2)“4)、(6)和(7)的特性，且具有下述⑶和/或(5)的特性(1)作用本酶具有將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為2-脫氧青蟹肌糖的功能；(2)最適pH范圍:7.0 7.7;(3)穩(wěn)定pH范圍:6.0 8.0；(4)最適溫度范圍55 70°C；(5)穩(wěn)定溫度范圍20 46°C；(6)輔酶利用NAD+；(7)分子量39000 42000。
2.如權(quán)利要求1所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(8)的特性(8)比活性于65°C的反應(yīng)溫度為Ι.Ομmol/min/mg以上。
3.如權(quán)利要求1或2所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(9)的特性(9)輔因子通過添加Co2+離子提高活性。
4.如權(quán)利要求1 3的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其中，穩(wěn)定溫度范圍為 20 60 。
5.一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述任一種氨基酸序列(a)序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列；(b)與序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列具有80%以上的同源性、 且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列；或(c)在序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的缺失、添加、和/或置換，且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列。
6.一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有編碼下述任一種氨基酸序列的堿基序列(a)序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列；(b)與序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列具有80%以上的同源性、 且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列；或(c)在序列號2、4、6、8、10或12的任一項(xiàng)記載的氨基酸序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的缺失、添加、和/或置換，且具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的氨基酸序列。
7.一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有下述任一種堿基序列(a)序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列；(b)與序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列具有80%以上的同源性、且編碼具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶的堿基序列；或(c)在序列號1、3、5、7、9或11的任一項(xiàng)記載的堿基序列中包含1個(gè)或2個(gè)以上的堿基的缺失、添加、和/或置換，且編碼具有高溫穩(wěn)定性和/或?qū)挿秶鶳H穩(wěn)定性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶的堿基序列。
8.—種重組載體，其含有權(quán)利要求6或7所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因。
9.一種轉(zhuǎn)化體，其是通過將權(quán)利要求6或7所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因或權(quán)利要求8所述的重組載體導(dǎo)入宿主中而得到的。
10.一種2-脫氧青蟹肌糖合成酶，其是通過培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體而得到的。
11.一種2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，該方法中使用權(quán)利要求1 5或 10的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶。
12.—種2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，該方法將葡萄糖、以葡萄糖為構(gòu)成成分的多糖類和/或葡萄糖-6-磷酸作為原料來制造2-脫氧青蟹肌糖，其特征在于，該方法中利用權(quán)利要求6或7所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因、或者權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體。
13.一種由葡萄糖-6-磷酸制造2-脫氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，在含有鈷離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠表達(dá)2-脫氧青蟹肌糖合成酶的微生物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，該方法中使用含有以葡萄糖為構(gòu)成成分的多糖類或者葡萄糖的原料。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，2-脫氧青蟹肌糖合成酶為權(quán)利要求1 5 的任一項(xiàng)所述的2-脫氧青蟹肌糖合成酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種對于熱和pH的穩(wěn)定性等特性比現(xiàn)有的酶更優(yōu)異的DOI合成酶，以及提供一種使用了該酶的DOI制造方法。根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性、且具有下述(3)和/或(5)的特性的2-脫氧青蟹肌糖合成酶。(1)作用本酶具有將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為2-脫氧青蟹肌糖的功能。(2)最適pH范圍7.0～7.7。(3)穩(wěn)定pH范圍6.0～8.0。(4)最適溫度范圍55～70℃。(5)穩(wěn)定溫度范圍20～46℃。(6)輔酶利用NAD+。(7)分子量39000～42000。
文檔編號C12N1/21GK102361978SQ201080013139
公開日2012年2月22日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者今津晉一, 小西一誠 申請人:旭化成化學(xué)株式會社