在基因組之間多核苷酸的直接轉移的制作方法
【專利說明】在基因組之間多核苷酸的直接轉移
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結合在此。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明提供了用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細胞的染色體直接轉移至 其他物種的原核受體細胞的染色體中的方法，其中該感興趣多核苷酸包括至少一種感興趣 編碼序列，優(yōu)選為一種感興趣基因，以及選擇性標記，其中該供體細胞的染色體中的所述感 興趣多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體細胞的染色體的多核苷酸區(qū)域，并且其中 這些側翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性，以允許與在該受體細胞的染色體中 的相應區(qū)域進行雙同源重組。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 在工業(yè)生物技術領域中，尤其是對于分泌的多肽，例如，酶，當要克隆并篩選新的 基因時，枯草芽孢桿菌是目前優(yōu)選的宿主微生物。這是因為該物種具有高轉化頻率和重組 頻率，其允許將基因快速并輕松的轉化到枯草芽孢桿菌宿主中并且整合至其染色體中，便 于后續(xù)的篩選。
[0006] 眾所周知，這些高頻率還允許通過用染色體DNA簡單的轉化將來自一個枯草芽孢 桿菌的基因輕松地轉移至另一個枯草芽孢桿菌中。然而，一旦在篩選過程中鑒別了感興趣 基因，枯草芽孢桿菌不一定是最優(yōu)選的表達宿主，并且，遺憾的是，通常很難并且繁瑣去將 染色體整合的異源DNA再進一步轉移至其他所希望用于工業(yè)表達的物種，例如，至地衣芽 孢桿菌宿主。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明允許在不同物種之間的異源染色體整合的多核苷酸的輕松的轉移。
[0009] 在以下實例中，我們成功地首次克隆了從地衣芽孢桿菌受體細胞至枯草芽孢桿菌 供體的足夠大的上游和下游側翼DNA區(qū)域，然后整合枯草芽孢桿菌供體中側翼DNA區(qū)域之 間的感興趣基因和選擇性標記。隨后我們通過用來自枯草芽孢桿菌供體的染色體DNA來轉 化地衣芽孢桿菌受體，將感興趣基因轉移至地衣芽孢桿菌受體中，從而通過在來自枯草芽 孢桿菌供體的進來的染色體DNA中的兩個側翼DNA區(qū)域與在地衣芽孢桿菌染色體中的相應 的相同區(qū)域之間的同源重組，將該感興趣基因位點特異性地整合至地衣芽孢桿菌受體的染 色體中。
[0010] 這種技術可具有針對轉移較大感興趣多核苷酸（例如物種之間的操縱子或功能 性多基因簇）的具體相關性。
[0011]因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及一種用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細 胞的染色體直接轉移至其他物種的原核受體細胞的染色體中的方法，其中該感興趣多核苷 酸包括至少一種感興趣編碼序列，優(yōu)選一種感興趣基因，以及選擇性標記，其中該供體細胞 的染色體中的所述感興趣多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體細胞的染色體的多 核苷酸區(qū)域，并且其中這些側翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性，以允許與在 該受體細胞的染色體中的相應區(qū)域進行雙同源重組；該方法包括以下步驟：
[0012] a)提供來自該供體細胞的染色體DNA，所述DNA包括該感興趣多核苷酸，該感興趣 多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體原核細胞的染色體的多核苷酸區(qū)域；
[0013] b)將該受體細胞用來自步驟（a)的DNA進行轉化；并且
[0014] c)選擇成功轉化的受體細胞，其中這種包括該選擇性標記的感興趣多核苷酸已經 被整合至該受體細胞的染色體中。
[0015] 優(yōu)選地，該選擇性標記已經在步驟（c)中通過在DNA的側翼區(qū)與它們的在該受體 細胞中的相應染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0016] 因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細胞的 染色體直接轉移至其他物種的原核受體細胞的染色體中的方法，該方法包括：
[0017] a)提供來自該供體細胞的染色體DNA，所述DNA包括該感興趣多核苷酸，該感興趣 多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體原核細胞的染色體的多核苷酸區(qū)域，并且所述 多核苷酸區(qū)域具有足夠尺寸和序列一致性，以允許與在該受體細胞的染色體中的相應區(qū)域 進行雙同源重組；
[0018] b)將該受體細胞用來自步驟（a)的DNA進行轉化；并且
[0019] c)選擇轉化的受體細胞，其中這種包括該選擇性標記的感興趣多核苷酸已經被整 合至該受體細胞的染色體中。
[0020] 在第二方面中，本發(fā)明涉及針對感興趣編碼活性進行基因文庫篩選的方法，所述 方法包括以下步驟：
[0021] a)提供包括在其染色體中的感興趣多核苷酸的原核供體細胞，該感興趣多核苷酸 進而包括基因文庫和選擇性標記，其中所述感興趣多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自另 一種物種受體原核細胞的染色體的多核苷酸區(qū)域，并且其中該側翼多核苷酸區(qū)域具有足夠 尺寸和序列一致性，以允許與在該受體細胞的染色體中的相應區(qū)域進行雙同源重組；
[0022] b)在編碼活性存在于該原核供體細胞的染色體中時，針對該編碼活性對該基因文 庫進行篩選，并且選擇感興趣的原核供體克隆，
[0023] c)提供來自步驟（b)的克隆細胞的染色體DNA ;
[0024] d)將該受體細胞用來自步驟（C)的DNA進行轉化；并且
[0025] e)選擇成功轉化的受體細胞，其中這種包括該選擇性標記的感興趣多核苷酸已經 被整合至該受體細胞的染色體中。
[0026] 優(yōu)選地，該選擇性標記已經在步驟（e)中通過在DNA的側翼區(qū)與它們的在該受體 細胞中的相應染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0027] 附圖簡要說明
[0028] -圖1示出了來自實例1的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0029] -圖2示出了來自實例3的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0030] -圖3示出了來自實例5的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0031] -圖4示出了具有針對實例5中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3034ara 基因座；總大?。?8218bp。
[0032] -圖5示出了具有針對實例7中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3041ara 基因座；總大?。?4889bp。
[0033] -圖6示出了具有針對實例9中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3053ara~aprH 盒;總大?。?7505bp。
[0034] -圖7示出了來自實例15的具有針對PCR驗證的基因和引物位置的地衣芽孢桿菌 TaHy9轉化體。
[0035] -圖8示出了針對來自實例15的轉化體的PCR驗證的PCR分析瓊脂糖凝膠電泳的 圖片。
[0036] -圖9示出了來自實例16的具有針對PCR驗證的基因和引物位置的地衣芽孢桿菌 TaHy9轉化體。
[0037] -圖10示出了針對來自實例16的轉化體的PCR驗證的PCR分析瓊脂糖凝膠電泳 的圖片。
[0038] 定義
[0039] 編碼序列：術語"編碼序列"意指直接指定一個多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0040] 破壞：術語"破壞"意指參照基因的編碼區(qū)和/或控制序列被部分或完全修飾（例 如通過缺失、插入和/或取代一個或多個核苷酸），從而使得編碼的多肽的表達不存在（失 活）或降低，和/或編碼的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本領域已知的技術測量破 壞效果，如使用在此參照的無細胞提取物測量值檢測酶活性的不存在或降低；或通過對應 的mRNA的不存在或降低（例如，至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 % 降低、至少80%降低或至少90%降低）；具有酶活性的對應多肽的量的不存在或降低（例 如，至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低或至少 90%降低）；或具有酶活性的對應多肽的比活性的不存在或降低（例如，至少25%降低、至 少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低或至少90 %降低）?？梢酝ㄟ^ 本領域已知的方法破壞感興趣的具體基因，例如通過定向同源重組（directed homologous recombination)(參見酵母遺傳學方法（Methods in Yeast Genetics) (1997 版），亞當 斯（Adams)，戈特斯科林（Gottschling)，凱澤（Kaiser)及施特姆斯（Stems)，冷泉港出版 社（Cold Spring Harbor Press) (1998))。在此描述了用于破壞芽孢桿菌屬基因的技術 并且已經在本領域中證實（參見斯特爾（Stahl)&法拉利（Ferrari)，1984,細菌學雜志 (J. Bacteriol.)158,411-418)。
[0041] 控制序列：術語"控制序列"意指表達編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的（即，來自相同基 因）或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉錄終止子。至少， 控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼 一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供 有多個接頭。
[0042] 表達：術語"表達"包括涉及多肽產生的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0043] 表達載體：術語"表達載體"意指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達的控制序列。
[0044] 宿主細胞：術語"宿主細胞"意指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構 建體或表達載體進行轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語"宿主細胞"涵蓋由于復制 期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。
[0045] 分離的：術語"分離的"意指處于非天然存在的形式或環(huán)境中的物質。分離的物 質的非限制性實例包括：（1)任何非天然存在的物質；(2)至少部分地從與其天然相關聯(lián)的 一種或多種或所有天然存在的成分中去除的任何物質，包括但不限于任何酶、變體、核酸、 蛋白質、肽或輔因子；(3)相對于在自然界中發(fā)現的那種物質通過人工修飾的任何物質；或 (4)通過相對于與其天然相關聯(lián)的其他組分增加該物質的量（例如，宿主細胞中的重組體 產量；編碼該物質的基因的多個拷貝；以及比與編碼該物質的基因天然相關聯(lián)的啟動子更 強的啟動子的使用）而修飾的任何物質。
[0046] 核酸構建體：術語"核酸構建體"意指單-鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在 的基因，或其被修飾成以本來在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其 包括一個或多個控制序列。
[0047] 可操作地連接：術語"可操作地連接"意指一種配置，其中一個控制序列相對于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個適當位置處，以使得控制序列指引編碼序列的表達。 [0048] 序列一致性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數"序列 一致性"描述。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟 件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人， 2000,遺傳學趨勢（Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本）的尼德爾 (Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德爾 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物學雜志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)來確定兩個氨 基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10,空位延伸罰分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出 (使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0049] (一致的殘基X 100)八比對長度-比對中的空位總數）
[0050] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟件套件， 賴斯（Rice)等人，2000,見上文）（優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的尼德爾程序中所實施的尼 德爾曼-翁施算法（尼德爾曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,見上文）來確定兩個 脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10,空位拓展罰分 0. 5,和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的 輸出（使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0051] (一致的脫氧核糖核苷酸X 100)八比對長度-比對中的空位總數）
[0052] 發(fā)明的詳細說明
[0053] 在一個方面中，本發(fā)明涉及一種用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細胞的染 色體直接轉移至其他物種的原核受體細胞的染色體中的方法，其中該感興趣多核苷酸包括 至少一種感興趣編碼序列，優(yōu)選一種感興趣基因，以及選擇性標記，其中該供體細胞的染色 體中的所述感興趣多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體細胞的染色體的多核苷酸 區(qū)域，并且其中這些側翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性，以允許與在該受體 細胞的染色體中的相應區(qū)域進行雙同源重組；該方法包括以下步驟：
[0054] a)提供來自該供體細胞的染色體DNA，所述DNA包括該感興趣多核苷酸，該感興趣 多核苷酸的每一側上的側翼為衍生自該受體原核細胞的染色體的多核苷酸區(qū)域；
[0055] b)將該受體細胞用來自步驟（a)的DNA進行轉化；并且
[0056] c)選擇成功轉化的受體細胞，其中這種包括該選擇性標記的感興趣多核苷酸已經 被整合至該受體細胞的染色體中。
[0057] 優(yōu)選地，該選擇性標記已經在步驟（c)中通過在DNA的側翼區(qū)與它們的在該受體 細胞中的相應染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0058] 多核苷酸的來源
[0059] 對具有本發(fā)明的感興趣活性的多肽進行編碼的多核苷酸或基因可以從任何屬的 微生物獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結合一種給定的來源使用的術語"從...獲得"應 意指由多核苷酸編碼的多肽是由該來源或者由其中已經插入來自該來源的多核苷酸的一 種菌株產生的。
[0060] 該多核苷酸可以是細菌多核苷酸。例如，該多核苷酸可以是革蘭氏陽性細菌多 核苷酸，如芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌屬（Enterococcus)、 土芽抱桿菌屬（Geobacillus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、 海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、或鏈霉菌屬（Streptomyces)多核苷酸；或革蘭氏陰性細菌多核苷酸， 如彎曲桿菌屬（Campylobacter)、大腸桿菌（E. coli)、黃桿菌屬（Flavobacterium)、梭 桿菌屬（Fusobacterium)、螺桿菌屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏 菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、沙門氏菌屬（Salmonella)或脲原體屬 (Ureaplasma)多核昔酸。
[0061] 在一方面，該多核苷酸是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillu