單離的脫氧核糖核酸聚合酶、套組及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供單離的脫氧核糖核酸聚合酶及其修改后的脫氧核糖核酸聚合酶，其中該脫氧核糖核酸聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性?！緦＠f明】單離的脫氧核糖核酸聚合酶、套組及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種聚合酶、套組(kits)及其應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]熱穩(wěn)定酵素(Thermostableenzymes)的應(yīng)用性是不容置疑的，因為此類酵素的發(fā)現(xiàn)，使目前得以發(fā)展出一些卓越的生物技術(shù)，例如聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)就是其中之一。聚合酶鏈鎖反應(yīng)是一種已經(jīng)發(fā)展成熟的生物技術(shù)，主要是可以在體外快速進(jìn)行核酸片段的擴(kuò)增，進(jìn)而產(chǎn)生數(shù)百萬計的特定核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前此技術(shù)已廣泛的應(yīng)用在諸多領(lǐng)域，包含醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、生技、刑事鑒定等等。幾乎所有的PCR反應(yīng)采用可耐高溫的熱穩(wěn)定脫氧核糖核酸聚合酶(DNApolymerase),最為廣泛應(yīng)用的為TaqDNA聚合酶。這是一種從溫泉中篩選出的嗜熱性細(xì)菌中的酵素，對溫度耐受性(temperatureresistance)高,且其還能維持特有的活性功能。[0003]然而，隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，已有多種不同功用的聚合酶被開發(fā)，如BstDNA聚合酶，但其對高溫的耐受性卻仍有待提升。因此具有熱穩(wěn)定性的聚合酶開發(fā)仍是產(chǎn)業(yè)所需?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明提供了一種單離的DNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.1。[0005]本發(fā)明提供了一種單離的DNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.2。[0006]本發(fā)明提供了一種單離的DNA聚合酶變異體，其中所述變異體的胺基酸序列是從所述單離的DNA聚合酶中的3’一5’外切酶活性區(qū)中的胺基酸序列刪除5個片段之至少一個，所述5個片段為E309-A313、P348、V358-T365、A404-Q405和P424-E445。[0007]根據(jù)本發(fā)明實施例，所述變異體具有相關(guān)于BstDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性且相當(dāng)于BstDNA聚合酶I的股取代能力。[0008]本發(fā)明提供了一種包含所述單離的DNA聚合酶、變異體或其組合的套組。[0009]根據(jù)本發(fā)明實施例，所述套組能用于核酸復(fù)制、放大的所需的反應(yīng)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction)、核酸擴(kuò)增(nucleicacidamplification)>全基因組擴(kuò)增(wholegenomeamplification)、多重取代擴(kuò)增(multipledisplacementamplification)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)(Loop-mediatedisothermalamplification;LAMP)或DNA定序(DNAsequencing)等。[0010]本案所提供的單離的DNA聚合酶、變異體或其組合的套組，因具有高熱穩(wěn)定性及酵素活性，故提升其耐受熱的程度，同時也提高其貯存時的穩(wěn)定度，促進(jìn)其于各種生醫(yī)檢測領(lǐng)域中之應(yīng)用潛力。[0011]為讓本發(fā)明之上述特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉實施例，并配合所附圖式作詳細(xì)說明如下?！緦＠綀D】【附圖說明】[0012]圖1A示出了根據(jù)本發(fā)明實施例以管柱層析分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之轉(zhuǎn)型株(pQE-11223)蛋白質(zhì)表現(xiàn)。[0013]圖1B示出了根據(jù)本發(fā)明實施例以管柱層析分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之轉(zhuǎn)型株(pQE-glO)蛋白質(zhì)表現(xiàn)。[0014]圖2A示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得的StrainlO、BCRC11223胺基酸序列。[0015]圖2B示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得StrainlO、BCRC11223、Bst聚合酶晶體結(jié)構(gòu)序列比對結(jié)果。[0016]圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得StrainlO、BCRC11223同源模擬結(jié)果。[0017]圖4示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得ParaDock結(jié)果。[0018]圖5示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得HADDOCK結(jié)果。[0019]圖6示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得StrainlO的ParaDock動力學(xué)模擬結(jié)果。[0020]圖7示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得StrainlO的HADDOCK動力學(xué)模擬結(jié)果。[0021]圖8示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得BCRC11223的ParaDock動力學(xué)模擬結(jié)果。[0022]圖9示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得BCRC11223的HADDOCK動力學(xué)模擬結(jié)果⑴。[0023]圖10示出了根據(jù)本發(fā)明實施例所得BCRC11223的HADDOCK動力學(xué)模擬結(jié)果(II)。[0024]圖11示出了根據(jù)本發(fā)明實施例以PicoGreen染劑進(jìn)行單股DNA定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0025]圖12示出了緩冷配對引子-模板混合物中引子濃度對酵素生成dsDNA產(chǎn)物濃度的影響。[0026]圖13示出了本發(fā)明StrainlO、BCRC11223胺基酸序列刪除處。[0027]圖14A示出了本發(fā)明BCRC11223轉(zhuǎn)型株E.coli(pQE_123dell)酵素表現(xiàn)純化結(jié)果O[0028]圖14B示出了本發(fā)明BCRC11223轉(zhuǎn)型株E.coli(pQE_123del3)酵素表現(xiàn)純化結(jié)果O[0029]圖15A示出了本發(fā)明BCRC11223轉(zhuǎn)型株E.coli(pQE_123del4)酵素表現(xiàn)純化結(jié)果O[0030]圖15B示出了本發(fā)明BCRC11223轉(zhuǎn)型株E.coli(pQE-123dellB)酵素表現(xiàn)純化結(jié)果O[0031]圖15C示出了本發(fā)明BCRC11223轉(zhuǎn)型株E.coli(pQE_123delall)酵素表現(xiàn)純化結(jié)果。[0032]圖16示出了不同來源之GeobacillusDNA聚合酶I于高溫下進(jìn)行加速保存試驗結(jié)果。[0033]圖17A-C示出了不同來源的GeobacillusDNA聚合酶I于不同溫度條件下的穩(wěn)定性試驗結(jié)果?！揪唧w實施方式】[0034]此處先探討一種獨特的DNA聚合酶:BstDNA聚合酶，目前已發(fā)表之GeobacillusstearothermophiIusN3468DNA聚合酶I(簡稱polA)基因序列(參見GenBankaccessionnumberU33536)，其基因全長為2361bp，可轉(zhuǎn)譯出含876個胺基酸的蛋白質(zhì)。此種酵素來自一種耐高溫細(xì)菌嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophiIus(Bst),具有5’一3’外切酶(exonuclease)、3’一5’外切酶(exonuclease)及5’一3’聚合酶的片段的片段，但目前BstDNA聚合酶主要的商品化產(chǎn)品是BacillusstearothermophiIusDNA聚合酶蛋白質(zhì)刪除掉5’一3’外切酶基因片段而得到的大片段(Largefragment)。此酵素最大的特點是具有股取代能力(Stranddisplacement)的活性片段,利用BstDNA聚合酶的Largefragment,可進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)(Loop-mediatedisothermalamplification;LAMP)。LAMP有幾項特點:(一)因只需要恒溫加熱即可完成反應(yīng)，只需利用如水/干浴槽或是加熱器等恒溫儀器即可達(dá)成。對于落后偏遠(yuǎn)地區(qū)來說，實屬方便、簡單而實用。(二)其引子組須經(jīng)特別設(shè)計，有別于一般傳統(tǒng)PCR反應(yīng)引子組的設(shè)計，因此可提高整體反應(yīng)的專一性。(三)反應(yīng)時間和其它類似技術(shù)比較起來較為快速，節(jié)省反應(yīng)時間。(四)靈敏度高，和一般PCR反應(yīng)比較，靈敏度約是其100~1000倍。(五)除了可用傳統(tǒng)膠體電泳檢驗其反應(yīng)終產(chǎn)物外，因其反應(yīng)終了會產(chǎn)生白色沉淀物，故也可利用濁度計或肉眼觀察的方式，判斷反應(yīng)是否完成，過程相當(dāng)簡便。(六)可使用于RNA樣品之中。因為不像傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要反復(fù)的經(jīng)過升降溫的步驟，LAMP技術(shù)的特色就是整個反應(yīng)都維持在均一溫度，因此可以降低儀器的制造成本，而且機(jī)構(gòu)設(shè)計上也相對的變得簡單，反應(yīng)時間也可以大大的縮減。以上這幾項優(yōu)點，使得LAMP技術(shù)一推出就受到重視。而參與該反應(yīng)的酵素BstDNA聚合酶，就更顯其重要性與獨特性。[0035]為了使BstDNA聚合酶應(yīng)用更加廣泛，而且能在不同的檢測或貯存運送環(huán)境中，仍能維持高活性。因此本創(chuàng)意提出一簡單且富創(chuàng)意的酵素改造策略，藉此提升其結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定，使其對于溫度的耐受性更高，卻還能維持其特殊的活性狀態(tài)。概念原理簡述如下:BstDNA聚合酶在溫度耐受度上,屬于中等程度耐熱(moderatethermophilic),其適合溫度為55_65°C，當(dāng)溫度>70°C時失活。而TaqDNA聚合酶則為高度耐熱(highlythermophilic)聚合酶，適合溫度為70-80°C。此外，在這許多不同來源的嗜高溫(Thermophilic)的聚合酶中，有個共同特色，就是雖然這些酵素都具有類似3’一5’exonuclease的結(jié)構(gòu)，但都缺乏3’一5’exonuclease的活性。而無論是BstDNA聚合酶全部長度或是其Largefragment,均具有這樣的特性。其他物種具有3’一5’exonuclease活性的DNA聚合酶，卻是對熱的耐受性低，往往環(huán)境溫度一升高就產(chǎn)生失活。因此，本發(fā)明認(rèn)為嗜高溫聚合酶刪除掉具有3’一5’exonuclease活性的結(jié)構(gòu),會使整體酵素結(jié)構(gòu)更傾向于熱穩(wěn)定。[0036]BstDNA聚合酶雖然也是嗜高溫酵素，然其對溫度的耐受性不若TaqDNA聚合酶來的高。且其在常溫下的貯存仍無法達(dá)到長久且穩(wěn)定。然而，試劑的長效保存及穩(wěn)定性為體外診斷產(chǎn)品必要條件，分子診斷試劑中最容易影響穩(wěn)定性及保存條件的重要成分就是酵素，如能透過基因及蛋白質(zhì)工程方法穩(wěn)定酵素結(jié)構(gòu)，將可減少整體分子檢測技術(shù)由于試劑不穩(wěn)定造成之誤差，達(dá)到穩(wěn)定表現(xiàn)之目的。[0037]Geobacillussp.中DNA聚合酶基因選殖[0038]DNA聚合酶I基因選殖與酵素純化[0039]Geobacillussp.polA基因序列比對[0040]目前已發(fā)表之GeobaciIIusstearothermophiIusN3468DNA聚合酶I(簡稱polA)基因序列(參見GenBankaccessionnumberU33536),其基因全長為2361bp,可轉(zhuǎn)譯出含876個胺基酸的蛋白質(zhì)。其序列包含3個功能性區(qū)域(domain)，N端的第175~248個胺基酸為5’一3’外切酶活性區(qū)(5，一3’exonucleasedomain);中間第315~465個胺基酸為3’一5’外切酶活性區(qū)(3’一5’exonucleasedomain);而C端則為聚合酶活性區(qū)。BstDNA聚合酶I的商品化酵素產(chǎn)品一般是去除5’一3’外切酶活性區(qū)而得到的大片段(Iargefragment)部份?！贝笃巍贝蠹s是由第289個胺基酸開始到C端(289~876aminoacids)。本實驗以DNA聚合酶大片段的胺基酸序列于菌株G.stearothermophiIusstrainlO及GeobacilluskaustophilusBCRCl1223的基因體資料庫中比對到identity聞達(dá)99%的polA基因序列。后續(xù)將依比對到的polA基因序列進(jìn)彳丁引子設(shè)計與基因選殖，將polA基因分別由G.stearothermophiIusstrainlO及GeobacilluskaustophilusBCRCl1223中選殖出并進(jìn)行基因表現(xiàn)。[0041]Geobacillussp.polA基因選殖與表現(xiàn)[0042]根據(jù)比對結(jié)果，我們分別由G.stearothermophiIusstrainlO及G.kaustophilusBCRCl1223polA基因的第289個胺基酸位置設(shè)計DNA引子(Bst-pB引子:5’_GAGGATCCTCAGAAGAGGAAAAACCGCT-3，；Bst_pK引子:5，-GAGGTACCTTATTTCGCATCATACCACG-3’)進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出polA大片段的DNA片段后，構(gòu)筑于載體pQE30(QiagenC0.)并轉(zhuǎn)殖至宿主細(xì)胞E.coli中進(jìn)行表現(xiàn)。表現(xiàn)載體PQE30上包含T5啟動子與6xHistag,可利用IPTG誘導(dǎo)啟動子下游基因表現(xiàn)并以Ni2+-NTA瓊膠管柱(QiagenC0.)將大量表現(xiàn)的重組蛋白純化。本實驗已成功挑選出分別具G.stearothermophilusstrainlO及G.kaustophilusBCRCl1223polA基因的E.coli轉(zhuǎn)型株，并分別命名為E.coli(pQE-glOpolA)與E.coli(pQE_11223polA)。經(jīng)DNA定序后確認(rèn)選殖基因之序列無誤，所選殖之DNA聚合酶大片段(largefragment)由第289個胺基酸Ala開始,全長共580個胺基酸，而序列的N端也確實接上并表現(xiàn)出6xHistag方便后續(xù)的蛋白質(zhì)純化。[0043]將挑選的E.coli轉(zhuǎn)型株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)質(zhì)體上的T5啟動子進(jìn)行基因表現(xiàn)后之菌體回收。以20ml的50mMTris-HCl,pH8.0清洗并回溶菌體，隨后利用超音波細(xì)胞破碎儀(UltrasonicprocessorUP-800,ChromTech,MN,USA)進(jìn)行破菌，并以SDS-PAGE管柱層析分析基因表現(xiàn)情形。圖1A顯示根據(jù)本發(fā)明實施例以管柱層析分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之轉(zhuǎn)型株(pQE-11223)蛋白質(zhì)表現(xiàn)。圖1B顯示根據(jù)本發(fā)明實施例以管柱層析分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之轉(zhuǎn)型株(pQE-glO)蛋白質(zhì)表現(xiàn)。圖示中直行M:蛋白質(zhì)標(biāo)記；直行C:EcolipQE30作控制組；直行1:細(xì)胞淬??；直行2:上清液；直行3:細(xì)胞碎片；直行4:純化酵素。結(jié)果顯示E.coli轉(zhuǎn)型株確實可以大量表現(xiàn)所選殖的polA基因，且其表現(xiàn)的可溶性PolA蛋白約占所有表現(xiàn)PolA蛋白的80~90%(直行I&2)，只有少量的不可溶PolA蛋白產(chǎn)生(直行3);以Ni2+-NTA瓊膠管柱純化后可得到高純度的DNA聚合酶I大片段酵素，其分子量大小符合預(yù)期，約為65kDa(圖中直行4)。并將由G.stearothermophiIusStrainlO及G.kaustophilusBCRCl1223選殖純化的酵素分別命名為BstgIODNA聚合酶與BkuDNA聚合酶I，而其胺基酸序列分別表為StrainlO(SEQIDN0.1)和BCRCl1223(SEQIDN0.2)。[0044]本發(fā)明提供了一種單離的DNA聚合酶，亦即BstgIODNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.1。而且，本發(fā)明提供了另一種單離的DNA聚合酶，亦即BkuDNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.2。[0045]本發(fā)明將藉由比對BstDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶的結(jié)構(gòu)，找出差異點，并以生物資訊與分子動力學(xué)模擬的技術(shù)輔助，分析及解構(gòu)出參與熱穩(wěn)定作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)位置。接著利用基因及蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改造BstDNA聚合酶，使其能具有高熱穩(wěn)定性及酵素活性。盼提升其耐受熱的程度，同時也提高其貯存時的穩(wěn)定度，促進(jìn)其于各種生醫(yī)檢測領(lǐng)域中之應(yīng)用潛力。[0046]利用生物資訊與分子動力學(xué)模擬技術(shù)，比對BstDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶的序列和結(jié)構(gòu)。推測嗜高溫聚合酶犧牲掉具有3’一exonuclease活性的結(jié)構(gòu)，使整體酵素結(jié)構(gòu)更傾向于熱穩(wěn)定。而BstDNA聚合酶在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)上，比起TaqDNA聚合酶多出了將近40個胺基酸。因此我們推測，如將此多出的胺基酸進(jìn)行刪除(deletion)，所得之酵素結(jié)構(gòu)將會接近TaqDNA聚合酶的構(gòu)型，而可提高其熱穩(wěn)定性，且能繼續(xù)擁有BstDNA聚合酶特有的活性。而在最不耐高溫的可列諾片段(Klenowfragment;KF)的結(jié)構(gòu)上，比起其他兩個酵素結(jié)構(gòu)，就多出了更多的胺基酸。本發(fā)明方式突破過往采取隨機(jī)點突變，或是大量篩選突變株的耗時作法。[0047]本發(fā)明提出一種提升聚合酶熱穩(wěn)定性之方法，該方法概略描述至少包括下列兩道程序。[0048]程序(A):比對參考的熱穩(wěn)定聚合酶與欲提升熱穩(wěn)定性之目標(biāo)聚合酶。舉例而言，參考的熱穩(wěn)定聚合酶為TaqDNA聚合酶，而目標(biāo)聚合酶為BstDNA聚合酶。比對該目標(biāo)聚合酶在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)的氨基酸序列與參考的熱穩(wěn)定聚合酶在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，分析得出多余的胺基酸基。舉例而言，透過多重序列比對(multiplesequencealignment)比對該目標(biāo)聚合酶在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)的胺基酸序列與參考的熱穩(wěn)定聚合酶在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)的胺基酸序列。利用生物資訊方法例如:分子動力學(xué)模擬分析、分子對接演算法等，分析得出在3’一5’exonuclease結(jié)構(gòu)上多余的胺基酸基。[0049]程序(B)利用分子生物學(xué)技術(shù)包括基因工程與蛋白質(zhì)工程技術(shù)等，切除該酵素多出之胺基酸基或序列，并經(jīng)過選殖、表現(xiàn)、純化等技術(shù)，獲得此酵素突變株。[0050]下列會針對該些技術(shù)作進(jìn)一步解釋。[0051]BstDNA聚合酶生物資訊與分子動力學(xué)模擬分析[0052]以BstDNA聚合酶I之大片段結(jié)晶結(jié)構(gòu)(PDBid:1XWL)為模板(其序列長度約580個胺基酸)。接續(xù)使用Sybyl-X將AMBER7F99電荷力場添加至蛋白質(zhì)，再刪除蛋白質(zhì)片段結(jié)構(gòu)(38個胺基酸)，并進(jìn)行能量最小化來調(diào)整胺基酸間碰撞(以η和η-1個構(gòu)形能量差距小于0.025kcal/(mol*A)或最大運算次數(shù)50000次為終止點)。將處理后之蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)透過ParaDock和HADDOCK(HighAmbiguityDrivenprotein-proteinDOCKing)進(jìn)行大分子的對接(docking)分析,其中ParaDock可建構(gòu)任意序列之DNA結(jié)構(gòu),并使可彎曲之DNA結(jié)構(gòu)對接至目標(biāo)蛋白；HADD0CK則使用與Bst共同結(jié)晶之DNA結(jié)構(gòu)(PDBid:1XffL)，再設(shè)定DNA與蛋白質(zhì)可能作用殘基,透過柔性對接(flexibledocking)方式結(jié)合至目標(biāo)蛋白。最終以DiscoveryStudio進(jìn)行分子動力學(xué)模擬(moleculardynamicsimulation)確認(rèn)DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合體之穩(wěn)定度，先添加CHARMm力場至復(fù)合體結(jié)構(gòu)上，并建構(gòu)涵蓋復(fù)合體結(jié)合區(qū)域的水分子模擬環(huán)境，再進(jìn)入兩階段能量最小化(steepestdescent和conjugategradient)以優(yōu)化復(fù)合體結(jié)構(gòu)；接續(xù)執(zhí)行升溫(heating)、平衡(equilibration)、采樣(production)等三個階段,在升溫過程由起始溫度50度逐漸提高至300度左右，平衡過程中使復(fù)合體能量適度分布以維持熱平衡，并于采樣過程挑選適合的熱力學(xué)系綜(如isothermal-1sobaricensemble;NPT)進(jìn)行米樣；最后利用軌跡分析(trajectoryanalyze)程序檢視復(fù)合體總能量和結(jié)構(gòu)均方根偏差(RMSD)隨時間的變化，若RMSD值小于2A說明模擬結(jié)果良好并可進(jìn)行后續(xù)的分析。[0053]表1【權(quán)利要求】1.一種單離的DNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.1。2.一種單離的DNA聚合酶，其胺基酸序列包括SEQIDN0.2。3.權(quán)利要求2所述的單離的DNA聚合酶的變異體，其中所述變異體的胺基酸序列是從所述單離的DNA聚合酶中的3’一5’外切酶活性區(qū)中的胺基酸序列刪除5個片段的至少一個，所述5個片段為E309-A313、P348、V358-T365、A404-Q405和P424-E445。4.權(quán)利要求3所述的變異體，其胺基酸序列包括SEQIDN0.3。5.權(quán)利要求4所述的變異體，其中所述變異體具有相當(dāng)于BstDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性且相當(dāng)于BstDNA聚合酶的股取代能力。6.一種施用權(quán)利要求1或2所述的單離的DNA聚合酶于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的用途。7.權(quán)利要求6所述的用途，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)包含聚合酶鏈反應(yīng)、核酸擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、多重取代擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)或DNA定序。8.—種施用權(quán)利要求3~5中任一項所述的變異體于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的用途。9.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)包含聚合酶鏈反應(yīng)、核酸擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、多重取代擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)或DNA定序。10.一種套組，其包括權(quán)利要求1或2所述的單離的DNA聚合酶。11.權(quán)利要求10所述的套組，其用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。12.權(quán)利要求11所述的套組，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)，包含聚合酶鏈反應(yīng)、核酸擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、多重取代擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)或DNA定序。13.一種套組，其包括權(quán)利要求3~5中任一項所述的變異體。14.權(quán)利要求13所述的套組，其用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。15.權(quán)利要求14所述的套組，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)，包含聚合酶鏈反應(yīng)、核酸擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、多重取代擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)或DNA定序。【文檔編號】C12N9/12GK103898077SQ201310719542【公開日】2014年7月2日申請日期:2013年12月23日優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日【發(fā)明者】劉振凰,江佩馨,林志龍,李淑貞,高肇鴻申請人:財團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院