一種用于核酸測(cè)序的emPCR體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于核酸測(cè)序的emPCR體系。
【背景技術(shù)】
[0002] emPCR (emulsion PCR)技術(shù)利用油包水結(jié)構(gòu)作為PCR反應(yīng)的微反應(yīng)器，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。emPCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其關(guān)鍵技 術(shù)是"注水到油"，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有的反應(yīng)成分的水溶液注入到 高速旋轉(zhuǎn)的油相表面，水溶液瞬間形成數(shù)以萬計(jì)個(gè)被油相包裹的小液滴。這些小液滴就形 成了 PCR反映空間。由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè) DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同 源DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，每個(gè)片段擴(kuò)增后產(chǎn)生幾百萬個(gè)相同的拷貝，這些拷貝也結(jié)合在磁珠上。
[0003] 基于油包水的乳液系統(tǒng)提出一個(gè)擴(kuò)增復(fù)雜DNA混合物的方案，目標(biāo)分子被分割在 微小的乳液液滴中并進(jìn)行分別擴(kuò)增，這種方法能夠在低濃度目標(biāo)DNA和大量的PCR循環(huán)條 件下進(jìn)行。每個(gè)獨(dú)立的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或 污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段 仍然結(jié)合在磁珠上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種用于核酸測(cè)序的emPCR體系，所述PCR體系為微乳液體 系，包括水相、油相、引發(fā)劑、表面活性劑與助表面活性劑。
[0005] 所述水相與油相的體積比為4:9-4:7,優(yōu)選為5:9。
[0006] 所述油相為DC5225C、PGFE、DC193、DC556和礦物油中的1種或幾種，優(yōu)選為 DC5225C、DC193 和 DC556。
[0007] 所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈和硫酸亞鐵，占體系的重量比為0. 03-0. 1%。
[0008] 所述表面活性劑為 span80、TritonX-100、tween80、tween60 和 tween20 中的一 種或幾種，優(yōu)選為span80、TritonX-100、tween80和tween60 ;在微乳液制備時(shí)，span80、 tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-100 溶于水相。
[0009] 所述表面活性劑占體系的體積比為span80 2. 5-5%，TritonX-100 0? 4-1. 0%， tween80 0? 2-0. 5%，tween60 0? 3-0. 5%、tween20 0? 2-0. 8% ;優(yōu)選為 span80 2. 5-3. 5%， TritonX-100 0.7-0. 9%，tween80 0.3-0. 4%，tween60 0.4-0. 5% 和 tween20 0.4-0. 7%〇
[0010] 所述助表面活性劑為聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一種或幾種。
[0011] 所述水相中含有61^〇?助劑、8肛€61'、引物、0嫩聚合酶、(1階1\]\%2+和水。
[0012] 所述emPCR助劑包括betaine (甜菜堿)、D_(+) trehalose (右旋海藻糖)、 L-carnitine (左旋肉堿)、NP_40 (乙基苯基聚乙二醇）、DTT (二硫蘇糖醇）、formamide (甲酰胺）和DMS0(二甲基亞砜）中的一種或幾種，優(yōu)選為betaine、D_(+) trehalose、 L-carnitine、NP_40、DTT 和 formamide。
[0013] 所述水為nuclease-free water ;所有試劑采用分析純及其以上純度。
[0014] 本發(fā)明提供的emPCR體系優(yōu)化了核酸測(cè)序的體系環(huán)境，試劑的選取增加了微乳液 體系的穩(wěn)定性，油水比例適宜，使測(cè)序結(jié)果更精確、均一和穩(wěn)定。該方案制備的微乳液體系 熱穩(wěn)定性好，微球在液滴中分布均勾，單克隆比例高。本發(fā)明選取的表面活性劑和助劑的增 溶度大，成核效率高，非常有利于提高測(cè)序的反應(yīng)速率。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 (1)油相，混合 DC5225C、DC556 和 DC193 共 387 y L。
[0016] (2)水相，加入
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述PCR體系為乳液體系，包括水相、 油相、引發(fā)劑、表面活性劑與助表面活性劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述水相與油相的體 積比為4:9-4:7,優(yōu)選為5:9。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述油相為 DC5225C、PGFE、DC193、DC556 和礦物油中的 1 種或幾種，優(yōu)選為 DC5225C、DC193 和 DC556。
4. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述引發(fā)劑為偶氮二 異丁腈和硫酸亞鐵。
5. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述表面活性劑 為 span80、TritonX-100、tween80、tween60 和 tween20 中的一種或幾種，優(yōu)選為 span80、 TritonX-100、tween80 和 tween60 ;在微乳液制備時(shí)，span80、tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-IOO溶于水相。
6. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述表面活性劑 占體系的比例為 span80 2. 5-5%，TritonX-IOO 0? 4-1. 0%，tween80 0? 2-0. 5%，tween60 0? 3-0. 5%、tween20 0? 2-0. 8% ;優(yōu)選為 span80 2. 5-3. 5%，TritonX-lOO 0? 7-0. 9%，tween80 0? 3-0. 4%，tween60 0?4-0. 5% 和 tween20 0? 4-0. 7%〇
7. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述助表面活性劑為 聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一種或幾種。
8. 如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述水相中包括 emPCR 助劑、Buffer、引物、DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+和水。
9. 如權(quán)利要求8所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述emPCR助劑包括 betaine、D- (+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide 和 DMSO 中的一種或幾種， 優(yōu)選為 betaine、D- (+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT 和 formamide。
10.如權(quán)利要求1所述的用于核酸測(cè)序的emPCR體系，其特征在于，所述水為 nuclease-freewater;所有試劑采用分析純及其以上純度。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于核酸測(cè)序的emPCR體系。該emPCR體系為乳液體系，包括水相、油相、引發(fā)劑、表面活性劑與助表面活性劑。水相與油相的體積比為4:9-4:7，油相選自DC5225C、PGFE、DC193、DC556和礦物油。表面活性劑選自span80、TritonX-100、tween80、tween60和tween20。本發(fā)明選取的表面活性劑和助劑的增溶度大，成核效率高，非常有利于提高測(cè)序的反應(yīng)速率。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104846112
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510300252
【發(fā)明人】蔡亦梅, 高靜, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年6月4日