一種玉米單倍體誘導(dǎo)系的選育方法及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種玉米單倍體誘導(dǎo)系的選育方法及其專用引物，屬于分子遺傳學(xué)育 種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是我國(guó)第一大糧食作物（張春雷，2012)，也是世界上重要的能源作物之一。 玉米產(chǎn)量的提高對(duì)滿足食用飼用供應(yīng)、保障國(guó)家糧食安全具有重要的意義。在當(dāng)今土地資 源有限的條件下，提高玉米單產(chǎn)對(duì)于保障玉米總產(chǎn)增長(zhǎng)具有重要意義。
[0003] 良種是提高玉米產(chǎn)量的重要要素之一。優(yōu)良的品種需要優(yōu)良自交系的支撐。在 當(dāng)前新品種的選育技術(shù)中，優(yōu)良自交系的選育乃是核心內(nèi)容。但是，在傳統(tǒng)育種當(dāng)中，自交 系的選育需6-8代才能純合，育種年限長(zhǎng)，需要投入大量的人力物力。近年來(lái)，單倍體育種 技術(shù)由于其能夠快速獲得玉米純系，節(jié)省人力物力，便于大規(guī)模生產(chǎn)而在國(guó)內(nèi)外得到了廣 泛的應(yīng)用（Hallauer，2010 ;Schmidt，2003 ;Seitz，2005 ;Vanessa Prigge，2012)。產(chǎn)生單 倍體是單倍體育種技術(shù)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，目前主要利用單倍體誘導(dǎo)系作為父本對(duì)母 本材料進(jìn)行授粉誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。誘導(dǎo)系源于美國(guó)的stock6突變株，該系具有2. 3%的誘 導(dǎo)率（Coe，1959)。由于單倍體育種技術(shù)在玉米育種中發(fā)揮的巨大作用，世界各國(guó)研宄者在 stock6及其衍生誘導(dǎo)系的基礎(chǔ)之上，積極開(kāi)展新型玉米單倍體誘導(dǎo)系的選育工作，以獲得 適合當(dāng)?shù)厥褂玫母哳l誘導(dǎo)系。目前世界上主要使用的誘導(dǎo)系有德國(guó)霍恩海姆大學(xué)選育的 UH400 (Vanessa Prigge，2011)和RWS(F.K. R6ber，2005)，法國(guó)誘導(dǎo)系WS14(LASHERMES and BECKERT，1988)、俄國(guó)誘導(dǎo)系KEMS(SARKAR，1994)以及中國(guó)農(nóng)大選育的CAUHOI、CAU5(單倍 體育種技術(shù)，2007)系列、高油型誘導(dǎo)系（Dong，2013)等。一般誘導(dǎo)率能達(dá)到8-12%。傳統(tǒng) 誘導(dǎo)系選育的方法依賴測(cè)驗(yàn)種對(duì)的單株誘導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，即在組配的群體中，對(duì)每一個(gè)單 株進(jìn)行誘導(dǎo)率測(cè)驗(yàn)，選擇誘導(dǎo)率高的單株自交或回交，獲得后代后重復(fù)測(cè)驗(yàn)過(guò)程，直至獲得 穩(wěn)定、誘導(dǎo)率高、標(biāo)記清晰、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單倍體誘導(dǎo)系。每個(gè)單株需要3-5個(gè)測(cè)驗(yàn)果穗 反以客觀映被測(cè)單株的誘導(dǎo)率水平，獲得誘導(dǎo)果穗后需要對(duì)每一粒種子進(jìn)行甄別，分離出 單倍體籽粒、雜合籽粒，并分別計(jì)數(shù)用于誘導(dǎo)率的計(jì)算，單倍體誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
[0004] 隨著分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（MAS)的發(fā)展，已有諸多成功案例。分子標(biāo)記可以直 接選擇對(duì)性狀起作用的位點(diǎn)，可以早代獲得純合的株系，因此能夠加速自交系的選育進(jìn)程。 分子標(biāo)記輔助選擇依賴于對(duì)性狀的精細(xì)定位及其過(guò)程中開(kāi)發(fā)的連鎖標(biāo)記。Prigge (2011)等 對(duì)誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率這一性狀進(jìn)行了初定位，在基因組中找到了 8個(gè)QTL位點(diǎn)能夠影響誘導(dǎo) 率。其中位于1. 04bin的位點(diǎn)qHI-1效應(yīng)最大，能夠解釋66%的變異，其次是位于第八號(hào)染 色體的qHI-8,能夠解釋20%的變異。董昕等對(duì)qHI-1位點(diǎn)進(jìn)行了精細(xì)定位，并開(kāi)發(fā)了能夠 用于誘導(dǎo)系鑒定和選擇的分子標(biāo)記。利用該分子標(biāo)記育成了高油型誘導(dǎo)系，從理論和實(shí)踐 上證實(shí)了分子標(biāo)記在誘導(dǎo)系選育過(guò)程中的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明提供的用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的引物對(duì)是由SEQ ID No. 1 所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的PCR 試劑。
[0008] 本發(fā)明提供的用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的PCR試劑包括上述引物 對(duì)。
[0009] 本發(fā)明還有一個(gè)目的提供用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明提供的用于選育或輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的試劑盒包括上述引物對(duì) 或上述PCR試劑。
[0011] 上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單株的單 倍體誘導(dǎo)性狀中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單株的單倍體誘導(dǎo)性 狀的方法。
[0013] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單株的單倍體誘導(dǎo)性狀的方 法包括如下步驟：用上述引物對(duì)對(duì)待測(cè)玉米單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所 述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定待測(cè)玉米單株的單倍體誘導(dǎo)性狀：PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物中僅含有大小為70bp片段的待測(cè)玉米單株的平均單倍體誘導(dǎo)率大于或候選大于PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物中含有大小為7〇bp和140bp片段的待測(cè)玉米單株的平均單倍體誘導(dǎo)率；PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物中含有大小為70bp和140bp片段的待測(cè)玉米單株的平均單倍體誘導(dǎo)率大于或候選大于 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有大小為140bp片段的待測(cè)玉米單株的平均單倍體誘導(dǎo)率。
[0014] 上述方法中，所述待測(cè)玉米單株為由兩個(gè)單倍體誘導(dǎo)系親本雜交，得到雜交子代， 將所述雜交子代自交，得到的自交子代群體；
[0015] 所述自交子代群體為自交第2代的子代群體或自交第3代的子代群體。
[0016] 上述方法中，所述兩個(gè)單倍體誘導(dǎo)系為CAUH0I和UH400或所述兩個(gè)單倍體誘導(dǎo)系 為 CAUH0I 和 CAU5。
[0017] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)玉米單株的基因組DNA。
[0018] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育高誘導(dǎo)率的玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的培育高誘導(dǎo)率的玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法包括如下步驟：培育PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有大小為70bp片段的待測(cè)玉米，實(shí)現(xiàn)高誘導(dǎo)率的玉米單倍體誘導(dǎo)系培育。
[0020] 本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)記輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法及其專用引物，本 發(fā)明所提供的分子標(biāo)記輔助選育玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法能直接在苗期鑒定出含有qHI-1 和qHI-8兩個(gè)主效QTL位點(diǎn)的單株，淘汰其它基因型，迅速獲得兩個(gè)位點(diǎn)純合基因型的株 系，省去大量不必要的測(cè)驗(yàn)和單倍體挑選工作，顯著提高單倍體誘導(dǎo)系選育的效率，加速單 倍體誘導(dǎo)系選育的進(jìn)程，增加優(yōu)良誘導(dǎo)系的育成機(jī)率。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為瓊脂糖電泳圖。其中，1為UH400 ;2為CAUH0I ;3為CAU5 ;4為 CAUH0I-UH400F1;5 為 CAUH0I-CAU5F 1;6-11 為 F 2單株。
[0022] 圖2為瓊脂糖電泳圖。其中，1為CAU5 ;2為CAUHOI ;3-11為F3單株。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0024] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025] 下述實(shí)施例中的高油單倍體誘導(dǎo)系CAUH0I，其誘導(dǎo)率為2%，具有Rl-nj標(biāo)記，在 文獻(xiàn)"Liang Li，Xiaowei Xu,ffeiwei Jin, Shaojiang Chen. Morphological and molecular evidence for DNA introgression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize. Planta, 2009, 230:367-376"中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0026] 下述實(shí)施例中的高頻單倍誘導(dǎo)系UH400,由德國(guó)霍恩海姆大學(xué)選育，其單倍 體誘導(dǎo)率為 8%，具有 Rl_nj 標(biāo)記，在文獻(xiàn) "Vanessa Prigge, Ciro Sdnchez, Baldev S. Dhillon, Wolfgang Schipprack, Jose Luis Araus, Marianne Banziger, and Albrecht E. Melchinger. Doubled Haploids in Tropical Maize:I Effects of Inducers and Source Germplasm on in vivo Haploid Induction Rates. Crop Sci, 2011，51:1-9"，公眾 可以從霍恩海姆大學(xué)獲得。
[0027]下述實(shí)施例中的高頻單倍體誘導(dǎo)系CAU5,其平均誘導(dǎo)率為10%，具有Rl-nj標(biāo)記， 在文獻(xiàn)"陳紹江，黎亮，李浩川.玉米單倍體育種技術(shù)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009"中 公開(kāi)過(guò)，公眾可