專利名稱：利用分離的重組酶通過酶促拆分由其外消旋n－乙酰－d,l－衍生物制備l－氨基酸的方法
以前只記載了通過用來源于大腸桿菌的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶裂解苯乙酰膦絲菌素以高純度和高產(chǎn)率來拆分制備非蛋白原的氨基酸L-PPT(L-膦絲菌素)(DE-A-3048612)。然而，苯乙酰-PPT的合成比N-Ac-PPT的合成更復(fù)雜、成本更高。但是，青霉素G?；D(zhuǎn)移酶對脂族?；痪哂刑禺愋裕蚨鴮-Ac-PPT也不具有特異性。其它已知的?；D(zhuǎn)移酶對N-Ac-PPT同樣不具有或只具有很低的底物特異性，并且以前只被用于不需要酶純化的微生物的生物轉(zhuǎn)化中(例如，DE-A-2939269中所描述的)。由于這個原因，只能獲得很低的空間/時間產(chǎn)率。專利申請EP-A-0382113公開了利用酰基轉(zhuǎn)移酶1對N-Ac-PPT羧酸酯進(jìn)行的L-特異性裂解。然而，這種酶甚至對游離羧酸也不具有特異性因而在底物的制備過程中需要一個作為附加合成步驟的酯化步驟。
專利申請DE-A-19652284記載了從土壤樣品中特異性分離對N-乙酰氨基酸，優(yōu)選的是對N-乙酰膦絲菌素(N-Ac-PPT)具有特異性的微生物脫乙酰酶，以及來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種和食酸叢毛單胞菌的相應(yīng)基因的克隆。
基于發(fā)現(xiàn)的序列同源性和進(jìn)行的底物特異性試驗(yàn)，所述脫乙酰酶可能屬于馬尿酸水解酶類(EC3.5.1.32)，它的天然底物是N-苯甲酰甘氨酸，一種具有芳族N-酰基功能的氨基酸衍生物。因此有趣的是這些酶也能接受N-乙?；被?，特別是N-乙酰膦絲菌素作為底物，這些底物是具有脂族N-?；δ艿陌被嵫苌?。專利申請DE-A-2939269和DE-A-2717440公開了外消旋膦絲菌素的除草作用只來源于它的L-對映體(L-PPT)。
在這點(diǎn)上，有趣的是發(fā)現(xiàn)的脫乙酰酶只高特異性地裂解N-乙酰-PPT和某些蛋白原性氨基酸的N-乙酰衍生物的L-對映體。例如，象專利申請EP-A-0304021，DE-A-2939269和DE-A-3048612中所記載的，這些酶因而非常適用于根據(jù)拆分原理由其外消旋N-乙酰衍生物制備L-氨基酸，尤其是具有除草活性的化合物L(fēng)-膦絲菌素。然而上述三個專利申請中的方法的明顯不足在于(1)只能采用低的底物濃度(在專利申請DE-A-2939269中大約為0.5％)，鑒于這一事實(shí)，所以對其工業(yè)實(shí)用性的評價將會很低，(2)采用未分離的酶進(jìn)行反應(yīng)，鑒于這一事實(shí)，所以不能解決或者需要高成本才能解決副反應(yīng)和后續(xù)純化步驟的問題，和(3)產(chǎn)品的制備需要高成本(如專利申請DE-A-3048612的情況)。
本發(fā)明的目的在于以適當(dāng)形式和數(shù)量表達(dá)一種或多種新型脫乙酰酶(如在DE-A-19652284中已經(jīng)得到鑒定的)，和借助這些酶使通過拆分以高產(chǎn)率和高對映體純度由化學(xué)上極易得到的外消旋N-乙酰-D，L衍生物制備L-PPT和某些蛋白原的L-氨基酸成為可能。
在已大約知道酶活性和已進(jìn)行了編碼該酶的核酸序列的克隆的情況下，首先進(jìn)行的操作包括將合適的核酸片段轉(zhuǎn)移到合適的載體上以便在合適的細(xì)菌菌株中進(jìn)行超表達(dá)，和/或以便在超表達(dá)后分離該蛋白。以這種方式分離的酶可被直接用于酶促反應(yīng)或通過合適的偶聯(lián)基團(tuán)被連接到一種基質(zhì)上。
為了大體上證實(shí)所需要的反應(yīng)是否正在進(jìn)行，最好首先進(jìn)行一種酶促反應(yīng)試驗(yàn)。所有其它步驟用來優(yōu)化與反應(yīng)特異性(基于起始物和產(chǎn)物)，反應(yīng)速率，反應(yīng)效率，所用酶的半衰期和可能的底物濃度有關(guān)的參數(shù)。在個別參數(shù)不能完全符合要求的情況下，能夠適當(dāng)?shù)馗淖兙幋a該酶的核酸序列，以使天然存在的酶得到進(jìn)一步的優(yōu)化。
專利申請DE-A-19652284已經(jīng)記載了所用的各個脫乙酰酶的克隆。按照下述實(shí)施例1中的方法將編碼適當(dāng)?shù)拿撘阴Ｃ傅暮怂崞卧倏寺〉竭m當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中以便由此確保確定的底物特異性達(dá)到必需的程度和不出現(xiàn)副反應(yīng)。因此，盡管在專利申請DE-A-19652284中有可能表明N-乙酰-L-PPT是脫去乙?；?，但不可能表明N-乙酰-D-PPT是未脫去乙酰基的。然而，只有N-乙酰-L-氨基酸和N-乙酰-L-PPT的反應(yīng)才是本申請以工業(yè)用途為目的的基本先決條件。
本發(fā)明涉及一種由其外消旋的N-乙酰-D，L衍生物制備蛋白原的或非蛋白原的L-氨基酸的方法，該方法包括(a)利用分離的重組酶通過酶促拆分選擇性地脫去相應(yīng)的L-氨基酸的N-乙酰-L衍生物的乙?；鄳?yīng)的D-氨基酸的N-乙酰-D衍生物的乙?；鶆t不被脫去，和(b)從未脫去乙酰基的N-乙酰-D衍生物和/或不完全脫去乙?；腘-乙酰-L衍生物中分離制得的脫去乙酰基的L-氨基酸。
本發(fā)明特別涉及一種利用分離的重組酶通過酶促拆分由N-乙酰-D，L-膦絲菌素制備L-膦絲菌素(L-PPT)的方法。
本發(fā)明還涉及一種通過酶促拆分由其相應(yīng)的N-乙酰-D，L衍生物制備L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸的方法。
本發(fā)明還涉及一種方法，該方法包括利用一種或多種源自于一組馬尿酸水解酶的脫乙酰酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物進(jìn)行一種或多種L-氨基酸的對映選擇性生產(chǎn)，特別是利用一種或多種源自于一組馬尿酸水解酶的脫乙酰酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物進(jìn)行L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸的對映選擇性生產(chǎn)。
尤其是，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括利用源自于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或源自于食酸叢毛單胞菌的deac2酶(兩種脫乙酰酶均被記載在DE-A-19652284中)由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物進(jìn)行一種或多種L-氨基酸的對映選擇性生產(chǎn)，并且在本文中，尤其是涉及利用源自于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或源自于食酸叢毛單胞菌的deac2酶(兩種脫乙酰酶均被記載在DE-A-19652284中)由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物進(jìn)行L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸的對映選擇性生產(chǎn)。兩種酶具有很高的序列同源性，因而導(dǎo)致在裂解N-乙酰-D，L衍生物方面的相同或至少相似的功能。
另外，本發(fā)明涉及制備的重組脫乙酰酶作為生物催化劑的用途，該生物催化劑能夠利用高底物濃度和/或達(dá)到高空間/時間產(chǎn)率，尤其是利用固定化形式的重組脫乙酰酶來進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。
本發(fā)明還涉及上述方法在反應(yīng)溫度大約為25℃至65℃，優(yōu)選地在反應(yīng)溫度大約為30℃至45℃和特別優(yōu)選地在反應(yīng)溫度大約為35℃至40℃下進(jìn)行。
另外，本發(fā)明涉及上述方法在底物濃度大約為10mM至1500mM，優(yōu)選地在底物濃度為大于50mM，特別優(yōu)選地在底物濃度為大于250mM和特別優(yōu)選地在底物濃度為大于500mM的條件下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及借助上述步驟從相應(yīng)的N-乙酰-D，L衍生物中分離所制備的L-氨基酸或L-PTC，該衍生物尚未發(fā)生反應(yīng)—如在N-乙酰-D衍生物的情況下—或者未完全發(fā)生反應(yīng)—如在N-乙酰-L衍生物的情況下。
在本文中，可利用的方法是采用酸性離子交換劑的離子交換色譜法或利用有機(jī)溶劑如甲基異丁酮對N-乙酰-D，L衍生物進(jìn)行萃取，其中上述制備的L-氨基酸或L-PPT進(jìn)入水相，然后通過干燥被從中濃縮。
實(shí)施例1.在大腸桿菌中以重組蛋白形式制備deac酶來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的編碼一種N-Ac-PPT-特異性脫乙酰酶的deac1結(jié)構(gòu)基因以1.4kb BamHI/SalI片段(DE-A-19652284中所述的)的形式被克隆到來源于Quiagen的His Tag表達(dá)載體pQE30的BamHI/SalI切割位點(diǎn)中[Quiaexpress試劑盒，IV型，目錄號32149，Stüber等(1990)，在Immunological Methods中，Lefkovits，I.和Pernis，B.，編輯，第IV卷，Academic Press，紐約，121-152頁]。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了所有的分子-生物學(xué)研究，例如按照Ausubel等撰寫的“Current protocols in molecular biology”(1995，John Wiley和Sons，紐約)中描述的方法進(jìn)行。將再連接構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到由廠商(Qiagen)推薦的細(xì)菌菌株E.coli M15中，并且采用100μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml的卡那霉素篩選重組克隆。通過加入1mM的IPTG來誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)4-5小時后收集細(xì)胞并且在對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工之前一直保存在-20℃下。
通過對經(jīng)誘導(dǎo)的克隆的細(xì)胞等分樣品進(jìn)行SDS/聚丙烯酰胺電泳，能夠檢測到His Tag deac1融合蛋白的49kDa的附加電泳帶。
脫乙酰酶融合蛋白的酶促活性通過以[14C]-N-乙酰-L-PPT作為底物的放射性測定法來進(jìn)行檢測。為此，在37℃下用0.5％的甲苯，0.5％的乙醇對各200μl的誘導(dǎo)培養(yǎng)物進(jìn)行30分鐘的透化處理。將細(xì)胞團(tuán)粒分別重新懸浮在25μl的0.1mM的[14C]-N-乙酰-L-PPT，10mM的氯化鈉，10mM的磷酸鈉，pH 7.5中并在37℃下溫育1小時。為了定性測定形成的[14C]-L-PPT，通過以正丙醇∶25％的氨＝3∶2作為洗脫液在HPTLC纖維素板(Merck)上進(jìn)行薄層層析來分析各試驗(yàn)批料的5μl等分樣品。通過X-射線膠片的放射自顯影使放射性條帶可見。
為了定量分析酶反應(yīng)，通過以Spheris orbSAX作為分離柱的放射-HPLC來測定試驗(yàn)批料(洗脫液5mM的KH2PO4，10％的甲醇，pH＝1.92，流速0.5ml/分鐘)。在這些條件下，[14C]-L-PPT在4.5分鐘時被洗脫出來，而[14C]-N-乙?；?L-PPT在6.5分鐘時被洗脫出來。
具有最高N-乙酰-L-PPT-特異性脫乙酰酶活性的表達(dá)克隆產(chǎn)生脫乙酰酶蛋白，按照半定量測量方法測得該脫乙酰酶蛋白大約占總蛋白的10％并且該脫乙酰酶蛋白被用于下述的酶純化和生物轉(zhuǎn)化。
2.通過親和色譜法純化脫乙酰酶在自然條件下，通過利用鎳-次氮基三乙酸酯基質(zhì)(Ni-NTA)的親和色譜法，按照Quiagen方法(Qiaexpress試劑盒)，從根據(jù)實(shí)施例1中描述的克隆方法而新命名的表達(dá)菌株pQEDEAC中分離脫乙酰酶蛋白。為此，對表達(dá)菌株pQEDEAC的800ml培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵并按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行誘導(dǎo)。將收集的細(xì)胞團(tuán)粒(4g)重新懸浮在20ml的裂解緩沖液中并進(jìn)行超聲破碎。離心后，采用4ml 50％強(qiáng)度的Ni-NTA懸浮液處理清澈的蛋白裂解液(120mg的總蛋白)以便與His Tag融合蛋白結(jié)合，然后將所述物質(zhì)加樣到一根酶柱上。用10個體積的洗滌緩沖液洗滌親和基質(zhì)，然后用4ml的洗脫緩沖液洗脫。為了檢測親和純化的純度，通過SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳分析洗滌液和洗脫液中的細(xì)胞破碎的等分樣品。利用實(shí)施例1中所述的放射性測定法測定含有不同蛋白的分步收集液的脫乙酰酶活性(反應(yīng)批料9μl蛋白溶液+1μl 1mM的[14C]-N-乙酰基-L-PPT，反應(yīng)條件參見上文)。為了定量測定酶，將蛋白分步收集液與50mM的N-乙酰基-D，L-PPT(9μl蛋白溶液+1μl 500mM的N-乙酰基-D，L-PPT)在37℃下溫育30分鐘。然后用氨基酸分析儀(Biotronic LC 5001)測定所產(chǎn)生的PPT。
細(xì)胞破碎后的粗提取物中的蛋白質(zhì)具有3ncat/mg蛋白質(zhì)的脫乙酰酶比活性(1ncat＝1nmol的底物/秒鐘)。通過親和色譜法能夠從800ml的表達(dá)菌株培養(yǎng)物中分離到10mg的His Tag deac融合蛋白，該融合蛋白具有20ncat/mg蛋白質(zhì)的比活性和大約80％的純度。
3.脫乙酰酶的底物特異性和立體選擇性為了研究deac1蛋白的底物特異性和立體選擇性，以20μl的批料在10mM的NaCl，10mM的磷酸鈉，pH＝7.5中分別將各5μg的純化酶與表1中列舉的各25mM的N-乙酰-L-氨基酸或相應(yīng)的D-對映體一起進(jìn)行溫育。采用馬尿酸(N-苯甲酰甘氨酸)，脫乙酰酶的天然底物來進(jìn)行比較。反應(yīng)物在37℃下溫育1小時，然后利用氨基酸分析儀(BiotronicLC5001)測定游離氨基酸的形成。表1列出了脫乙酰酶對不同底物的L-對映體的相對活性。除了馬尿酸和N-Ac-L-PPT外，deac1酶還另外切割許多天然氨基酸的N-乙?；苌?，特別是N-Ac-L-谷氨酸，N-Ac-甘氨酸，N-Ac-L-組氨酸，N-Ac-L-鳥氨酸，N-Ac-L-亮氨酸，N-Ac-L-谷氨酰胺胺和N-Ac-L-苯丙氨酸。在所有情況下，所述酶只對L-對映體有活性，而在任何情況下所述酶都不可能使相應(yīng)的D-化合物發(fā)生反應(yīng)。在所有其它試驗(yàn)的情況下(參見表1)，N-乙?；?L衍生物只發(fā)生了很低程度的反應(yīng)或者根本未發(fā)生反應(yīng)。
表1deac酶的底物特異性
1所有化合物都是L對映體2將利用馬尿酸測定的比活性[nmol的甘氨酸/分鐘/mg蛋白質(zhì)]設(shè)為100％，其它值以它為基準(zhǔn)。
4.通過利用deac生產(chǎn)菌株的細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化來拆分N-乙酰基-D，L-膦絲菌素如實(shí)施例1所述對400ml表達(dá)菌株pQEDEAC的培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵并進(jìn)行誘導(dǎo)。然后用10mM的NaCl，10mM的磷酸鈉，pH＝7.5洗滌收集的細(xì)胞并過夜冷凍干燥。以這種方式處理的細(xì)胞能夠在4℃下保藏?cái)?shù)星期而仍能保持很高的脫乙酰酶比活性并且這些細(xì)胞能被用作下列實(shí)驗(yàn)中的生物催化劑。
將2mg的凍干細(xì)胞重新懸浮在1ml的下列不同濃度的底物溶液中(1)10 mM的N-乙酰-D，L-PPT，二鈉鹽(0.3％)(2)50 mM的” ”(1.3％)(3)100mM的” ”(2.6％)(4)250mM的” ”(6.7％)(5)500mM的” ”(13.3％)作為反應(yīng)緩沖液，批料含有10mM的NaCl，10mM的磷酸鈉，pH＝8.0并在100轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上于37℃下溫育48小時。水解反應(yīng)中形成的游離PPT利用氨基酸分析儀(Biotronic LC5001)來進(jìn)行檢測。結(jié)果列于表2。反應(yīng)產(chǎn)物的對映體純度通過采用分離柱Chirex(D)Penicillamine(Phenomenex)的手性HPLC來進(jìn)行分析。使用的洗脫液是流速為0.5ml/分鐘的2mM的CuSO4，10％的甲醇。采用光度計(jì)在254nm下進(jìn)行檢測。在這些條件下，L-PPT的參照溶液在17分鐘時洗脫出來，而D-PPT的參照溶液在21分鐘時洗脫出來。在所有試驗(yàn)樣品中，僅L-PPT作為反應(yīng)生成物被檢測到。達(dá)到的轉(zhuǎn)化率[生成的L-PPT/底物中的N-乙酰-L-PPT×100]為低底物濃度(10mM，50mM)時的100％至采用的最高底物濃度(500mM)時的66％。
表2作為底物濃度函數(shù)的N-乙酰-D，L-PPT的拆分
*生物催化劑的濃度2mg/ml
在下列實(shí)驗(yàn)中，增加了生物催化劑的濃度并且記錄了底物裂解的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。將13mg的凍干細(xì)胞重新懸浮在1ml的底物溶液中并于37℃下在100轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，該底物溶液含有500mM的N-乙酰-D，L-PPT，二鈉鹽(13.3％w/v)，10mM的NaCl，10mM的磷酸鈉，pH＝8.0。為了測定所形成的L-PPT，在55小時的培養(yǎng)過程中，從反應(yīng)批料中分別取出50μl的各等分樣品，離心并且在分析之前一直將上清液冷凍保存在-20℃下。反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)-PPT的定量分析和對映體純度的測定按上述方法進(jìn)行。結(jié)果列于表3中。在選擇的條件下，大約55小時后完成L-特異性底物的裂解。在這種情況下，獲得了大約90％的轉(zhuǎn)化率和483[L-PPT的毫克數(shù)/生物催化劑的克數(shù)/小時]的空間/時間產(chǎn)率。
表3N-乙酰-D，L-PPT拆分的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)
*生物催化劑的濃度13mg/ml底物濃度500mM的N-乙酰-D，L-PPT5.純化deac蛋白質(zhì)的固定化為了能與分離的deac蛋白進(jìn)行酶反應(yīng)，實(shí)施例2中純化的酶以HisTag融合蛋白的形式被固定在聚合物載體VINA-EpoxyBiosynth(Riedel de Haen)上。為此，通過硫酸銨沉淀將deac蛋白濃縮到15mg/ml并用1M的磷酸鈉，pH＝8.0透析過夜。在室溫下緩慢振蕩10mg的所述蛋白和100mg的VINA載體2天來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)反應(yīng)。離心分離出固定化物并用固定化緩沖液以及50mM的磷酸鈉，pH＝7.0各洗滌一次。為了封閉游離的環(huán)氧基團(tuán)，將所述載體與50mM的磷酸鈉，pH＝7.0，50mM的2-巰基-乙醇在室溫下溫育1小時。所述生物催化劑然后被保存在4℃下的1ml 5mM的磷酸鈉，pH＝7.0，0.02％的疊氮化鈉中。為了測定蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，在固定化前后，并且采用洗滌溶液，借助Bradford方法[Bradford(1976)，Anal.Biochem.(生物化學(xué)分析)72248-254]測定溶液中的蛋白含量。在固定化前后，利用實(shí)施例1中描述的放射性測定法測定脫乙酰酶的比活性。偶聯(lián)后，所述酶的相對活性為大于溶解蛋白的測定值的90％。
6.在柱反應(yīng)器中利用固定化的deac酶拆分N-乙酰-D，L-膦絲菌素將1g的酶固定化物(濕重)加樣到柱反應(yīng)器中并用作拆分流速不同的各種濃縮底物溶液的生物催化劑。如表4中列出了在10mM NaCl，10mM磷酸鈉，pH＝8.0中含有不同濃度的N-乙酰-D，L-PPT，二銨鹽的底物溶液。反應(yīng)在37℃下總共進(jìn)行10天。通過利用氨基酸分析和手性HPLC(參見實(shí)施例4)測定流經(jīng)柱的物質(zhì)中存在的L-PPT來定量分析該反應(yīng)。結(jié)果見表4。采用最高底物濃度(500mM)和最低底物流速(0.03ml/分鐘)獲得了83％的最高轉(zhuǎn)化率?？臻g/時間產(chǎn)率隨著流速和底物濃度而增加并且在500mM的底物濃度和0.3ml/分鐘的流速的條件下，達(dá)到了181[L-PPT的毫克數(shù)/生物催化劑的克數(shù)/小時]的最高值。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，固定化的脫乙酰酶顯示出良好的穩(wěn)定性并且在37℃下10天以后仍具有大約80％的起始活性。
表4在柱反應(yīng)器中利用固定化的deac酶拆分N-乙酰-D，L-PPT
*在37℃下反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種由其外消旋的N-乙酰-D，L-衍生物制備蛋白原的或非蛋白原的L-氨基酸的方法，該方法包括(a)利用分離的重組酶通過酶促拆分選擇性地脫去相應(yīng)的L-氨基酸的N-乙酰-L-衍生物的乙?；?，而相應(yīng)的D-氨基酸的N-乙酰-D-衍生物的乙?；鶆t不被脫去，和(b)從未脫去乙?；腘-乙酰-D-衍生物和/或不完全脫去乙?；腘-乙酰-L-衍生物中分離制得的脫去乙?；腖-氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其用于由N-乙酰-D，L-膦絲菌素制備L-膦絲菌素(L-PPT)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其用于由其相應(yīng)的N-乙酰-D，L衍生物制備L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中利用一種或多種來源于一組馬尿酸水解酶的脫乙酰酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備一種或多種L-氨基酸。
5.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中利用一種或多種來源于一組馬尿酸水解酶的脫乙酰酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸。
6.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中利用來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或來源于食酸叢毛單胞菌的deac2酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備一種或多種L-氨基酸。
7.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中利用來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或來源于食酸叢毛單胞菌的deac2酶由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸。
8.如權(quán)利要求4至7中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中制備的重組脫乙酰酶以固定化的形式被使用。
9.如權(quán)利要求4至8中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中反應(yīng)溫度大約為25℃至65℃。
10.如權(quán)利要求4至8中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中底物以大約10至1500mM的濃度存在。
11.一種或多種馬尿酸水解酶在由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備一種或多種L-氨基酸中的用途。
12.一種或多種馬尿酸水解酶在由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸中的用途。
13.來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或來源于食酸叢毛單胞菌的deac2酶在由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備一種或多種L-氨基酸中的用途。
14.來源于寡養(yǎng)單胞菌屬某種的deac1酶和/或來源于食酸叢毛單胞菌的deac2酶在由其相應(yīng)的外消旋N-乙酰-D，L衍生物對映選擇性地制備L-膦絲菌素，L-谷氨酸，L-組氨酸，L-亮氨酸，L-谷氨酰胺和/或L-苯丙氨酸中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由其外消旋的N－乙酰－D,L－衍生物制備蛋白原的或非蛋白原的L－氨基酸,特別是L－膦絲菌素的方法。該方法的特征在于:(a)利用分離的重組酶通過酶促拆分選擇性地脫去相應(yīng)的L－氨基酸的N－乙酰－L－衍生物的乙?；?而相應(yīng)的D－氨基酸的N－乙酰－D－衍生物的乙?；鶆t不被脫去,和(b)從未脫去乙?；腘－乙酰－D－衍生物和/或不完全脫去乙酰基的N－乙酰－L－衍生物中分離制得的脫去乙?；腖－氨基酸。
文檔編號C12P41/00GK1371422SQ00810510
公開日2002年9月25日 申請日期2000年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月20日
發(fā)明者K·巴奇 申請人:阿溫提斯作物科學(xué)有限公司