一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶拆分（±)-扁桃酸甲酯的方 法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 扁桃酸及其衍生物的對映體是一類非常重要的藥物中間體，被廣泛應用于多種藥 物的合成，如青霉素、頭孢菌素、環(huán)扁桃酯、抗腫瘤制劑、輔酶A等。光學純扁桃酸系列化合 物傳統(tǒng)制備工藝為化學合成外消旋產(chǎn)物后再進行手性化學拆分，此方法試劑昂貴，污染環(huán) 境，且純度不高。生物催化法制備手性化合物是一類集生物技術(shù)與化學工程于一體的新興 方法，該方法具有效率高、選擇性強、環(huán)境友好等優(yōu)點，是近年來科研人員研宄的重點和熱 點。其中，生物催化法制備光學純扁桃酸系列化合物基于所涉及催化劑種類的不同又可以 細分為3種：1)依賴于氧化還原酶體系催化法，2)腈水解酶催化法，3)酯酶/脂肪酶催化 法。Tsuchiya等利用氧化還原酶體系將外消旋的扁桃酸轉(zhuǎn)化成單一異構(gòu)體的R-扁桃酸， 產(chǎn)率達到75%，對映體過量值大于99%。李忠琴等人利用酵母菌的突變株轉(zhuǎn)化苯乙酮和苯 乙酮酸甲酯得到相應的R構(gòu)型酸和酯，產(chǎn)率大于90%，對映體過量值均大于99%。其次， Yamamoto和Banerjee等人分別利用腈水解酶催化外消旋扁桃腈，均獲得較高的產(chǎn)率和對 映體過量值的R-扁桃酸。再有，Kim等人利用Pseudomonassp.細胞拆分（±)_扁桃酸， 獲得對映體過量值為99. 4%的R-扁桃酸。這些例子均體現(xiàn)生物催化法具有轉(zhuǎn)化效率高、 立體選擇性強的特點。其中，酯酶/脂肪酶是一類酯鍵水解酶，它可在油水界面催化長鏈甘 油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸；而它在非水介質(zhì)中又能催化 酸的羧基與醇的羥基進行脫水縮合反應產(chǎn)生酯類化合物，如此獨特的性質(zhì)使其在多種反應 (水解反應、酯化反應、醇解反應、酸解反應等）中具有廣泛的應用，并且備受關(guān)注。
[0003] 然而，目前報道的這些酶類大部分是優(yōu)先作用R構(gòu)型，通過水解或者轉(zhuǎn)化得到 R-扁桃酸，因此，有必要尋找和開發(fā)優(yōu)先作用S構(gòu)型的酶類，以制備S-扁桃酸和R構(gòu)型的扁 桃酸系列化合物，進而研宄相應的作用機理。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種酯酶拆分（±) _扁桃酸甲酯的方法，利用該方法能夠拆 分（±)_扁桃酸甲酯制備R-扁桃酸甲酯，其具有操作簡單，對環(huán)境友好，耗時少，產(chǎn)物得率 高，單一對映體光學純度高的優(yōu)點。
[0005] 本發(fā)明的酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在 的情況下，對（±)_扁桃酸甲酯進行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃 酸，然后再將R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如 SEQIDN0. 2 所示。
[0006] 所述的酯酶拆分（±)-扁桃酸甲酯的方法，具體步驟優(yōu)選如下：
[0007] 稱?。ā?_扁桃酸甲酯加入到反應器中，再加入pH為6~10的反應緩沖液和酯 酶EST04211形成反應體系，在30~40°C下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁 桃酸，然后用疏水性溶劑進行萃取，從疏水性溶劑中得到R-扁桃酸甲酯。按照此方法進行 拆分，R-扁桃酸甲酯的對映體過量值為>90 %，最高達到99. 9 %以上，產(chǎn)率最高接近90 %。
[0008] 進一步優(yōu)選，在反應體系中，反應緩沖液的pH值為6~7,（±)_扁桃酸甲酯的初 始反應濃度為5~40mM，酯酶EST04211用量為20yg/ml，反應時間為1~2小時。
[0009] 所述的疏水性溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。
[0010] 本發(fā)明還提供了酯酶EST04211在拆分（±)_扁桃酸甲酯獲得R-扁桃酸甲酯中的 應用，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 本發(fā)明的（±)-扁桃酸甲酯是指R-扁桃酸甲酯和s-扁桃酸甲酯的混合物。
[0012] 本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學拆分相比，具有反應條件溫和、無污染、對映體過量值高的優(yōu) 點；與目前報道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211優(yōu)先水解S構(gòu)型的扁桃酸甲酯得 到光學純的R-扁桃酸甲酯，立體選擇性強。所得產(chǎn)品可以簡單加以純化后用于相應藥物的 合成。
【附圖說明】：
[0013] 圖1是酯酶EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解的過程方程式；
[0014] 圖2是酯酶EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解得到R-扁桃酸甲酯的GC分析 圖，圖2A是（±)-扁桃酸甲酯的GC分析圖，圖2B是R-扁桃酸甲酯標樣的GC分析圖，圖2C 是S-扁桃酸甲酯標樣的GC分析圖，圖2D是乙酸乙酯相中的GC分析圖，乙酸乙酯相中只含 有R-扁桃酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸。
【具體實施方式】：
[0015] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0016] 本發(fā)明的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示，其編碼基因序列 如SEQIDNO. 1所示，該酯酶EST04211公開于專利申請?zhí)枮椋?01410333182. 4,發(fā)明名 稱為：一種新的酯酶及其編碼基因和應用，公開號為：CN104140959A的專利申請中，酯酶 EST04211的制備方法見于該專利中，由此能夠獲得酯酶EST04211。
[0017] 實施例1 :
[0018] 1、不同溫度中酯酶EST04211水解拆分（±)_扁桃酸甲酯的影響分析，酯酶 EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解的過程方程式如圖1所示。
[0019] 用100mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH= 8. 0)配制一定量終濃度為10mM 的（±)_扁桃酸甲酯，按lml每管的體積分裝到10個EP管中，其中5個加入20yg酯酶 ￡5!'04211后分別置于10°〇、201：、301：、401：和501：的恒溫裝置下反應，反應111和211后各 分別取出500y1反應樣品并加入終濃度為5mM的十二烷作為內(nèi)標物，然后加入500y1乙 酸乙酯進行萃取，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，S-扁桃酸進入水相， 乙酸乙酯相中得到R-扁桃酸甲酯（圖2所示，通過GC分析，乙酸乙酯相中只存在R-扁桃 酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸，乙酸乙酯相中的R-扁桃酸甲酯可以通過蒸 餾的方法去除乙酸乙酯，而留下R-扁桃酸甲酯，如減壓濃縮去除乙酸乙酯，獲得R-扁桃酸 甲酯），乙酸乙酯相用氣相色譜進行檢測。與此同時，另外5個EP管不加任何酶也分別置于 10 °C、20 °C、30 °C、40 °C和50 °C的恒溫裝置下作為對照實驗。
[0020] 氣相色譜儀為福立GC-9790II，配備氫火焰離子化檢測器，以氮氣為載氣。手性色 譜柱為安捷倫產(chǎn)品112-6632CYCL0SIL-B(30mX0. 25mmID，0. 25ymdf)，進樣器和檢測器溫 度分別為250°C和280°C，升溫程序為：先60°C保持1分鐘，然每分鐘升溫15°C至120°C保 持1分鐘，再每分鐘升溫l〇°C至200°C保持1分鐘。對映體過量值（e.e% )和得率（Y% ) 按照下列公式計算：
【主權(quán)項】
1. 一種酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在的情況 下，對（±)_扁桃酸甲酯進行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后 再對R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方 法，具體步驟如下： 稱取（±)_扁桃酸甲酯加入到反應器中，再加入pH為6~10的反應緩沖液和酯酶 EST04211形成反應體系，在30~40°C下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃 酸，然后用疏水性溶劑進行萃取，從疏水性溶劑中得到R-扁桃酸甲酯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在反應體系中，反應緩沖液的pH值為6~ 7,（±)_扁桃酸甲酯的初始反應濃度為5~40mM，酯酶EST04211用量為20 μ g/ml，反應時 間為1~2小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的疏水性溶劑為乙酸乙酯。
5. 酯酶EST04211在拆分（±)_扁桃酸甲酯獲得R-扁桃酸甲酯中的應用，所述的酯酶 EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法。它是在酯酶EST04211存在的情況下，對(±)-扁桃酸甲酯進行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后再對R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學拆分相比，具有反應條件溫和、無污染、對映體過量值高的優(yōu)點；與目前報道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211優(yōu)先水解S構(gòu)型的扁桃酸甲酯得到光學純的R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸，立體選擇性強。所得產(chǎn)品可以簡單加以純化后用于相應藥物的合成。
【IPC分類】C12P7-62, C12P41-00, C12N9-18, C12P7-42
【公開號】CN104830944
【申請?zhí)枴緾N201510212293
【發(fā)明人】胡云峰, 梁甲元, 孫愛君, 張云, 鄧盾
【申請人】中國科學院南海海洋研究所
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月29日