一種cpc?；钢亟M表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)CPC?；副磉_(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 頭孢菌素類藥物（Cephalosporins)是一族廣譜半合成抗生素，它與青霉素類抗 生素一樣，分子結(jié)構(gòu)中都具有內(nèi)酰胺環(huán)，故統(tǒng)稱為內(nèi)酰胺類抗生素，都是以破壞細(xì) 菌細(xì)胞壁合成為機(jī)制的抗生素。近年來，由于其過敏反應(yīng)小、對(duì)酸和內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定， 且與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性，在抗生素工業(yè)日益收到研宄人員的重視。
[0003] 頭孢菌素類抗生素結(jié)構(gòu)均為由母核和側(cè)鏈構(gòu)成，其母核7-氨基頭孢烷酸 (7-ACA)，是頭孢菌素的抗菌部位，是各類半合成頭孢菌素類抗生素藥物的重要中間體。 7-ACA的研宄和生產(chǎn)顯得至關(guān)重要。目前獲得7-ACA有三種方法：化學(xué)裂解法、兩步酶法 和一步酶法。化學(xué)法的反應(yīng)條件較為苛刻，反應(yīng)過程必須在超低溫條件下進(jìn)行，而且涉及 到大量有毒有害的有機(jī)溶劑，因此環(huán)境友好的酶法越來越受到重視。酶法裂解主要包括兩 步酶法和一步酶法，兩步酶法即通過D-氨基酸氧化酶（DAA0)、戊二酰-7-氨基頭孢烷酸 (glutaryl7_aminocephalosporanic acid，GL-7-ACA)酰化酶兩步酶法實(shí)現(xiàn)酶法 7-ACA 的 工業(yè)化制備，但存在氧化條件控制難度大、兩步酶法生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本較高的缺點(diǎn)。研宄 人員嘗試了分別提高兩種酶的酶活并將二者融合表達(dá)，并加入H 202酶消除反映過程中產(chǎn)生 的H202對(duì)酶活的影響，但效果并不顯著。一步酶切法是通過CPC?；笇PC直接轉(zhuǎn)化為 7-ACA。為縮短工藝流程，降低7-ACA生產(chǎn)成本，提高國際競(jìng)爭(zhēng)力，各國科學(xué)家一直致力于一 步酶法工藝的研宄。在未來的幾十年里，應(yīng)用一步酶法直接?；疌PC獲得7-ACA將具有廣 闊的發(fā)展前景。利用克隆重組技術(shù)，可以提高CPC酰化酶的表達(dá)量，對(duì)其進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用 具有重要意義。
[0004] 頭孢菌素酰化酶（Cephalosporin acylase，CA)是一類催化頭孢菌素C (CPC)或 GL-7-ACA酰基側(cè)鏈脫酰基生成7-ACA的酶。根據(jù)催化底物的不同，可以將頭孢菌素?；?分為CPC?；福╝cy II基因產(chǎn)物）和GL-7-ACA?；福╝cy I基因產(chǎn)物）。
[0005] 目前產(chǎn)頭孢菌素酰化酶的菌株有假單胞菌Pseudomonas sp. A14，Pseudomonassp. SY-77-1， Pseudomonas sp.C130， Pseudomonas sp.SE83， Pseudomonas sp.N176? Pseudomonas sp.C427，Pseudomonas sp.V22? Pseudomonas sp. BL072? Pseudomonas sp.CCRC11041、Flavobacterium、bacillus 和小型絲狀真菌 Aoryzae，Aspergillus nidulan， Penicillium oxalicum， Schizomycetes， Paecilomyces puntonii C2106， Fusarium。111111〇1'11111等。其中已經(jīng)克隆的基因有來自 Pseudomonas sp. N176和 Pseudomonas sp. SE83的CPC?；富?。這2株菌都能產(chǎn)種頭孢菌素?；?，不僅可以催化GL-7-ACA 為7-ACA，也可以直接催化CPC為7-ACA。但是原菌CPC酰化酶對(duì)CPC的活性是對(duì)GL-7-ACA 活性的2%~4%。
[0006]目前基因工程技術(shù)被認(rèn)為是提高酶產(chǎn)量和活力最有競(jìng)爭(zhēng)力的技術(shù)。由于野生菌株 對(duì)CPC活性較低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，所以國內(nèi)外學(xué)者采用基因工程技術(shù)對(duì)CPC?；?酶基因進(jìn)行人工改造和化學(xué)合成表達(dá)。以降低其對(duì)GL-7-ACA活力，提高其對(duì)CPC活力。大 腸桿菌作為應(yīng)用最為廣泛的基因工程菌，有遺傳背景清楚、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)。因此研宄 人員普遍采用大腸桿菌作為表達(dá)宿主，表達(dá)CPC?；?。最早在1996年Saito等克隆了 來自Pseudomonas diminuta N176中的CPC酰化酶的基因，并在大腸桿菌中分別進(jìn)行了表 達(dá)。并進(jìn)一步定點(diǎn)突變，突變體對(duì)GL-7-ACA的活力都有所下降，對(duì)CPC活力升高，其中突變 酶M164L對(duì)CPC的催化能力提高了 22 %，而M269Y和M269F的突變使得其對(duì)CPC的比活提 高了 1. 5倍和1. 7倍?；赑seudomonas sp. SE83Acy II CPC?；富钚灾行牡臉?gòu)象對(duì)其 活性位點(diǎn)的殘基進(jìn)行改造，以使其原本適應(yīng)于GL-7-ACA側(cè)鏈的活性中心能更適應(yīng)CPC的側(cè) 鏈，通過多點(diǎn)聯(lián)合突變使該酶的CPC催化活性得到大幅提高，Q50 M/Y149 a K/F177 G突 變體的酶活提高為野生型的790%。同年Asai對(duì)CPC?；窷176突變酶的純化進(jìn)行了研 宄，可以通過加入離子表面活性劑的方法去除CPC?；钢械孽ッ福瑥亩_(dá)到純化CPC?；?酶提高其酶活的目的。通過對(duì)源于Pseudomonas diminuta N176的CPC酰化酶進(jìn)行定向進(jìn) 化并結(jié)合易錯(cuò)PCR誘變，使A215Y-H296S-H309S突變體的CPC/GL-7-ACA催化效率提高了約 100倍，顯著提高其對(duì)CPC活性，使CPC轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，即獲得了一種真正意義上的CPC酰 化酶。為酶法制備7-ACA的工業(yè)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。2008年，有研宄人員以Pseudomonas sp. SE83中的CPC?；傅陌被嵝蛄凶鳛槟０澹谡T導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)經(jīng)過優(yōu)化的CPC ?；富?。并控制培養(yǎng)條件，通過降低發(fā)酵溫度或是添加誘導(dǎo)劑來減少包涵體的形成，提 高外援蛋白的表達(dá)量。還有人運(yùn)用基因敲出技術(shù)，把大腸桿菌宿主基因組中的內(nèi)酰胺 酶和乙酰酯酶的基因進(jìn)行了敲除消除重組菌中這兩種雜酶的影響。防止酶催化過程中副產(chǎn) 物的生成，簡(jiǎn)化了酶的純化操作，提高了 7-ACA產(chǎn)品的質(zhì)量。還有報(bào)道稱對(duì)具有組氨酸標(biāo)簽 的重組CPC?；高M(jìn)行了純化研宄，采用以Cu2+-IDA為配基的固定化金屬離子親和層析柱 制備得到了高純度的CPC?；福兓蟮腃PC?；傅谋让富顬?0U/mg，是純化前的2. 5 倍。
[0007] 為了進(jìn)一步提高CPC?；傅幕钚裕景l(fā)明人根據(jù)GenBank中Pseudomonas sp. SE83cephalosporin acylase的蛋白質(zhì)序列（登錄號(hào)AAA25690)，通過密碼子翻譯獲得 基因序列。通過基因工程的方法來提高酶的穩(wěn)定性和活性，構(gòu)建分泌型基因工程菌來簡(jiǎn)化 酶的分離純化操作，優(yōu)化酶反應(yīng)的催化過程，將會(huì)是今后一段時(shí)間頭孢菌素酰化酶法生產(chǎn) 7-ACA的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的CPC?；富?，所述CPC?；?基因的核苷酸序列為選自SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 3、SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 6所示的 核苷酸序列；發(fā)明同時(shí)還公開了由所述核苷酸序列翻譯獲得的氨基酸序列。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了含有所述CPC?；富虻闹亟M質(zhì)粒和宿主菌，其中 所述重組質(zhì)粒具有如圖1所示的結(jié)構(gòu)，所述宿主菌為選自大腸桿菌BL21(DE3)和ROSETTA。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的CPC酰化酶基因在制備轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中的 應(yīng)用以及含有所述CPC?；富虻霓D(zhuǎn)基因大腸桿菌的制備方法，其中所述制備方法包括 以下步驟：
[0011] (1)合成并擴(kuò)增CPC?；富颍渲兴鯟PC?；富虻暮塑账嵝蛄腥鏢EQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6 所示；
[0012] (2)將CPC?；富蚺c載體可操作地連接，構(gòu)建CPC?；傅倪_(dá)載體并轉(zhuǎn)化到宿 主中，其中所述宿主為選自大腸桿菌BL21(DE3)和ROSETTA ;
[0013] (3)培養(yǎng)宿主和誘導(dǎo)CPC?；副硎?，獲得表達(dá)CPC?；富虻霓D(zhuǎn)基因大腸桿 菌。
[0014] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述的CPC酰化酶基因在制備頭孢菌素類藥物中的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供培養(yǎng)基所述宿主菌的優(yōu)化培養(yǎng)基，包括以下成分：甘 油11. 49-12. 49g/L，酵母提取物26. 33-27. 33g/L，牛肉膏14. 73-15. 73g/L。優(yōu)選包括以下 成分：甘油11. 99g/L，酵母提取物26. 83g/L，牛肉膏15. 23g/L。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明所述質(zhì)粒PET-28a_CPC的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017] 其中，所述CPC為選自S1、S3、S4、S6基因。
[0018] 圖2是蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖；
[0019] 四種表達(dá)載體分別表達(dá)SI、S2序列，其中M為marker，Prestained